Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng hóa chất 2,4 d trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.4 MB, 57 trang )
BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
•
•
•
•
LÊ THỊ THU TRANG
NGHIÊN cúu XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
■
Dư LƯỢNG HOÁ CHẤT 2,4-0 TRONG Dược LIỆU
■
■
*
■
BẰNG SÂC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸĐẠI HỌC KHÓA 2(102-2007)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
: TS. Trần Việt ÌSùng
ThS. Nguyễn Tường Vy
Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung Ương
Thời gian thực hiện : Từ 2/2006 đến 5/2007
HÀ NỘI, 05/2007
L Ò I CẨM Ơ N
Trước ãêí em xin bày tỏ Còng biết ơn sâu sắc tới *zỵ. ‘ĩrẩn Việt ĩCùng,
m s. Nguyễn Tường Vy, những người đã trực tiếp íiưâng dân, cíit sảo cho em
trong quá trình nghiên cứu và thực diện Cuận văn này.
(Em jỷn gửi ữfi cãân thành cảm ơn tới (Ban giám đốc Viện íịiổn nghiệm
tíiuốc Trung ‘Uơng và toàn thể cán 6ộ %Ịư>a vật [ý đo Cường-Viện kiểm nghiệm
thuốc Trung ‘Ương ẩẫ tuôn giúp đờ và tạo ấiều íịịện cho em trong quá trìnã em
thực hiện Cuận văn.
ngkiêncứu.
Cuối cùng em vô cùng 6ỉết ơn 6Ốmẹ, anâ trai, người thân, 6ạn 6è đã Cuôn ỏ
6ên em động viên và giúp đd em.
ỈNgày 16 tháng 5 năm 2007
Tấc giả
L<Ê
MỤC LỤC
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ................................................................................................. /
PHẨN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................3
1.1- TỔNG QUAN VỂ 2,4-D..................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm hoá lý ..............................................................................3
1.1.2. Độc tính của 2,4-D.......................................................................... 5
1.1.3. Tinh hình sử dụng............................................................................ 6
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH D ư LƯỢNG 2,4-D..................7
1.2.1. Xử lý mẫu........................................................................................7
1.2.2. Phân tích định tính và định lượng.....................................................8
1.3. TỔNG QUAN VỂ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PH Ổ .............................. 9
1.3.1. Vài nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ........................................... 9
1.3.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ.........................................................10
1.3.3. Một số kỹ thuật LC-MS........................................................ ...... 14
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ................................................ 16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM.... 16
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu....................................................................... 16
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu..................................... .......................... 17
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT................................ 20
2.2.1. Chuẩn bị m ẫu................................................................................ 20
2.2.2. Khảo sát xây dựng chương trình sắc k ý ......................................... 20
2.2.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ để định tính và định
lượng 2,4-D..............................................................................................23
2.2.4. Xây dựng phương pháp chiết và làm sạch...................................... 30
2.2.5. Phân tích mẫu................................................................................ 32
2.2.6. Kết quả phân tích 2,4-D trong một số mẫu dược liệu.....................33
2.3. BÀN LUẬN........................................................................................34
2.3.1. Về đối tượng phân tích.................................................................. 34
2.3.2. Về phương pháp phân tích................................... ..........................35
2.3.3. Về kết quả phân tích trên mẫu.......................................................37
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT........................................................38
3.1. KẾT LUẬN........................................................................................38
3.2. ĐỂ XUẤT...........................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIÊT TẮT
AOAC
Association of analytical chemistry
(Hiệp hội hoá học phân tích quốc tế)
APCI
Asmospheric Pressure Chemical Ionization
(Kỹ thuật ion hoá bằng hoá học ở áp suất thường)
Amu
Atomic mass unit
(Đơn vị khối lượng nguyên tử)
CE
Collision Energy
(Năng lượng va chạm)
CTPT
Công thức phân tử
DĐVNIII
Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ ba
ECD
Electron captured detector
(Detector cộng kết điện tử)
EPA
Environmental protection agency
(Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ)
ESI
Electrospray Ionization
(Kỹ thuật ion hoá bằng phun điện tử)
FDA
Food and Drug Administration
(Cơ quan quản lý thực phẩm,dược phẩm)
GAP
Good Agriculture Practise
(Thực hành nông nghiệp tốt)
GC
Gas Chromatography (Sắc ký khí)
GC-MS
Gas Chromatography-Mass spectrometry
(Sắc ký khí ghép khối phổ)
HCBVTV
Hoá chất bảo vệ thực vật
HPLC
:
Hight Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
LC-MS
:
Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)
MS
:
Mass Spectrometry (Khối phổ kế)
PDA
:
Photo Diod Array (Chuỗi diod quang)
QIT
:
Quadrupole lon Trap
(Bộ phân tích khối bẫyion)
RSD
:
Relative Standard Deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)
SIM
:
Selected lon Monitoring
S/N
:
Signal to noise Ratio
(Tỷ số tín hiệu trên nhiễu)
SPE
:
Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)
TCVN
:
Tiêu chuẩn Việt Nam
TIC
:
Total lon Chromatogram
(Chế độ quét toàn bộ ion)
UV-VIS
:
Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)
WHO
:
World Health Organization
(Tổ chức Y tế thế giới)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Kết quả khảo sát độ tuyến tính khoảng nồng độ 0,5-10ppm..............22
Bảng 2. 2. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính kiểm tra sự phù hợp
của hệ thống........................................................................ .............................29
Bảng 2. 3. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi ở các nồng độ khác nhau................... 32
Bảng 2. 4. So sánh 2 phương pháp phân tích.......................................................36
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max... 16
Hình 2.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 2,4-D trong pha động nồng độ lppm, tốc độ
dòng 0,5 mL/phút...........................................................................................21
Hình 2.3. Tương quan hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của các
dung dịch chuẩn 2,4-D (0,5-10ppm) phân tích theo chương trình sắc ký sử dụng
detectorPDA.................................................................................................22
Hình 2.4. Phổ khối của 2,4-D nồng độ lOppm trong pha động......................... 25
Hình 2.5. Phổ khối của 2,4-D 10 ppm trong pha động, CE = 30 V ...................25
Hình 2.6. Phổ khối (MS2) của 2,4-D nồng độ 10 ppm trong pha động, CE = 25%,
mảnh mẹ 219-> mảnh con 161....................................................................... 26
Hình 2.7. Phổ khối (MS2) của 2,4-D nồng độ 10 ppm trong pha động, CE = 5%,
mảnh mẹ 221-> mảnh con 163........................................................................27
Hình 2.8. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 2,4-D pha trong pha động nồng độ 0,5 ppm,
tốc độ dòng 0,2 mL/phút.................................................................................28
Hình 2. 9. Tương quan hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của các
dung dịch chuẩn 2,4-D (0,01-lppm) phân tích theo chương trình sắc ký LC-MS30
Hình 2.10. Mẫu nhân sâm nhiễm 10 ppb 2,4-D, tốc độ dòng 0,3 mL/phút....... 33
ĐẶT VẨN ĐỂ
Dược liệu là nguồn nguyên liệu quan trọng của nền y học cổ truyền và
của ngành công nghiệp dược phẩm. Trong những năm gần đây xu hướng trên
thế giói dùng thảo dược không tách hoạt chất ngày càng nhiều. Ngày nay, hiệu
quả điều trị và tính an toàn của thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng được
quan tâm. Hơn nữa, trong mối quan hệ mật thiết vói y học hiện đại, việc sử
dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược đòi hỏi cần phải có các chứng cứ khoa
học lâm sàng chứ không đơn thuần dựa vào kinh nghiệm [18].
Từ xa xưa con người đã biết dùng các chất độc để phòng trừ dịch hại.
Sản xuất nông nghiệp ngày càng phát triển, dịch hại ngày càng nhiều và đa
dạng, hoá chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) cũng được phát minh và sử dụng
rất phổ biến đem lại nhiều lợi ích to lớn.
Ở nước ta, HCBVTV được sử dụng rộng rãi với mục đích phòng trừ sâu
bệnh, chuột, cỏ dại có hại cho cây trồng và nông sản, trong đó bao gồm cả các
loài thảo dược. Bên cạnh những mặt tích cực, HCBVTV cũng đã để lại những
hậu quả xấu, phá vỡ cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường, để lại tồn dư
trong nông sản, thực phẩm, thảo dược gây ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con
người.
Nếu như trước đây với thảo dược người ta chỉ quan tâm đến hoạt chất có
tác dụng sinh học thì ngày nay còn cần phải đảm bảo sử dụng an toàn. Trong
đó, việc kiểm tra và khống chế dư lượng HCBVTV trong thảo dược là hết sức
cần thiết.
Chất 2,4-D (acid 2,4-Diclorophenoxyacetic) thuộc nhóm trừ cỏ, sử dụng
ở nồng độ thấp có tác dụng kích thích sinh trưởng, được Bộ nông nghiệp và
phát triển nông thôn cho phép sử dụng [5]. Uỷ ban Tiêu chuẩn thực phẩm
quốc tế (CODEX Alimentarius) cũng như nhiều nước trên thế giới cho phép
dùng 2,4-D làm chất trừ cỏ dại [20]. Hỗn hợp 2 chất 2,4-D và 2,4,5-T (Acid
1
triclorophenoxy acetic) với tỷ lệ 50:50 có chứa một tạp chất rất độc là 2,3,7,8
TCDD (Tetra Cloro Dibenzo-p-Dioxin) hay còn gọi là dioxin, rất độc với môi
sinh và sức khoẻ con người ở nồng độ rất thấp, hiện nay đã bị cấm sử dụng
trong nông nghiệp.
Hóa chất 2,4-D dùng diệt cỏ dại tồn lưu trong đất có thể lây nhiễm cho
cây trồng hoặc có thể lạm dụng làm chất kích thích trong trồng cây thuốc. Dư
lượng của 2,4-D được quy định trong nông sản từ 0,1- 0,5 mg/kg, trong môi
trường là 0,07 mg/L [30].
Ở nước ta, hiện chưa có phương pháp phân tích dư lượng 2,4-D trong
dược liệu.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, nhằm góp phần phục vụ công tác đảm
bảo chất lượng thuốc có nguồn gốc dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng hoá chất 2,4-D
trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ” với hai mục tiêu chính:
1) Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng 2,4-D trong
dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS).
2) Khảo sát dư lượng 2,4-D trong một số mẫu dược liệu.
2
PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỂ 2,4-D [2],[5],[12],[13],[14],[22],[25],[29]
1.1.1. Đặc điểm hoá lý [12],[25]
Tên hoá học: acid 2,4-Diclorophenoxy acetic
Công thức hoá học:
o
OH
XI
CI
CTPT: C8H6C120 3
Phân tử lượng: 221.04 g/mol
Tính chất vật lý
Trạng thái: Bột rắn không màu, trắng hoặc hơi vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 140,5°c
Độ tan: khó tan trong nước (620 mg/L ở 25°C), tan trong ethanol và một
số dung môi hữu cơ khác. Là một acid mạnh ăn mòn kim loại.
3
Tổng hợp 2,4-D [25]
2,4-D thường được tạo ra bởi sự ngưng tụ của 2,4-Diclorophenol và acid
monocloroacetic trong một kiềm mạnh ở nhiệt độ thường hoặc do sự khử clo
của acid phenoxy.
Môi trường kiềm và nhiệt độ phản ứng cao trong suốt quá trình sản xuất
2,4-D dẫn đến sự tạo thêm các sản phẩm dẫn chất clo của dibenzo-p-dioxin
(CDD).
Ngày nay vói công nghệ hiện đại có thể sản xuất 2,4-D không có tạp
dioxin, nhưng người ta đã chứng minh không thể sản xuất 2,4,5-T tinh khiết
không có dioxin.Vì lẽ đó mà 2,4,5-T đã bị cấm sử dụng ở Mỹ từ năm 1983 và
sau đó cũng dần bị cấm sử dụng ở nhiều nước trên thế giói.
Các muối kim loại của 2,4-D được sản xuất bởi phản ứng của 2,4-D vói
các base kim loại thích hợp. Các muối thường gặp là Na, Ca, Fe và Mg.
Các muối amin thu được bằng phản ứng hoá học của amin và 2,4-D
trong dung môi thích hợp.
Các ester được tạo thành bằng phản ứng ester hoá với sản phẩm chưng
cất đẳng phí của nước với xúc tác acid hoặc bằng phản ứng tổng hợp thẳng từ
ester của acid monocloroacetic vói diclorophenol.
Dẫn xuất của 2,4-D [12],[25]
Có nhiều dạng dẫn xuất của 2,4-D như: các ester, các amin và muối.
Nhiệt phân các muối amin khác nhau của 2,4-D tạo ra các amin tương
ứng.
Nhiệt phân 2,4-D và dẫn xuất của nó có khả năng tạo ra sản phẩm chứa
các đồng phân CDD (polycloro-dibenzo-p-dioxin).
Các ester của 2,4-D với alcol mạch ngắn rất dễ bay hơi. Điều này gây
ảnh hưởng đáng kể đến hiệu lực của chúng khi sử dụng cho cây trồng, gây hậu
quả cho các cây trồng lân cận và làm ô nhiễm bầu khí quyển.
4
Các muối kali hoặc amin ít bay hơi hơn các ester nên được ưu tiên hơn
khi sử dụng.
1.1.2. Độc tính của 2,4-D [12],[25],[28],[29]
Mặc dù tỷ lệ dioxin trong 2,4-D là rất nhỏ, nhưng các nghiên cứu trên
thế giới đã cho thấy độc tính của 2,4-D trên cơ thể người là rất đáng lưu ý.
Muối 2,4-D dimethyl độc vói mắt được xếp vào nhóm độc I (rất độc),
các dẫn chất 2,4- D khác xếp vào nhóm độc II (độc trung bình) [12].
Khi tiếp xúc với 2,4-D (công nhân ở nhà máy sản xuất 2,4-D, nông dân
khi phun thuốc...) có thể nhiễm độc 2,4-D. 2,4-D và các dẫn xuất của nó có
thể được hấp thu theo đường miệng, qua da và đường hô hấp, nhưng hơn 90%
tổng lượng 2,4-D hoặc các hợp chất clorophenoxy khác vào cơ thể là do xâm
nhập qua da. 2,4-D phân bố đến khắp cơ thể nhưng sự tích luỹ của nó thì
không được biết rõ ràng và được bài tiết chủ yếu theo đường nước tiểu dưới
dạng acid và base phenoxy kết hợp [25].
Các triệu trứng thường thấy khi nhiễm độc 2,4-D [25],[29]
•
Kích thích da, mắt và đường hô hấp.
•
Hít vào có thể gây cảm giác nóng mũi, ngực, cổ họng, hoamắt.
•
Đau đầu, ôn mửa, ỉa chảy.
•
Các hành vi hỗn loạn, kì quái hoặc hung hãn.
•
Ảnh hưởng xấu đến thận (nặng có thể suy thận),làm chậm nhịp
tim.
• Acid hóa chuyển hoá gây mùi lạ cho hơi thở.
Trong các sản phẩm 2,4-D thường có một số lượng chất clophenol
không được tổng hợp hết (gọi là phenol tự do) tạo nên mùi nặng, khó chịu của
2,4-D.
Trong tự nhiên, clorophenol tồn tại tương đối lâu và có thể chuyển hoá
thành chất dioxin (2, 3, 7, 8-tetraclorodibenzo-p-dioxin) [5]. Đây là chất có
độc tính rất cao, rất bền vững, độ tan trong nước rất thấp [2]. Dioxin rất nguy
5
hiểm với môi trường, có khả năng kích thích tế bào ung thư phát triển, gây đột
biến tế bào và dị dạng cơ thể ngưòi và động vật máu nóng.
Lượng clorophenol nhiều hay ít tuỳ thuộc trình độ công nghệ sản xuất
2,4-D. Theo quy định của tổ chức y tế thế giới (WHO) hàm lượng clorophenol
trong các chế phẩm 2,4-D dùng trong nông nghiệp không được quá 0.3% [5].
1.1.3. Tình hình sử dụng [5],[12],[20],[25],[27],[28]
Trên thế giới
Là chất diệt cỏ dại đầu tiên, sử dụng ở Mỹ từ đại chiến thế giới thứ II,
trở nên nổi tiếng do là thành phần trong chất độc chiến tranh sử dụng làm chất
khai quang ở Việt Nam. Do là chất diệt cỏ kinh điển, không còn bảo hộ bản
quyền cho nên 2,4-D được rất nhiều công ty hóa chất nông nghiệp khác nhau
trên thế giới sản xuất, có thời gian sử dụng tràn lan, và cũng do sử dụng trong
một thời gian lâu dài nên đã để lại những vấn đề về môi trường. 2,4-D là chất
diệt cỏ chọn lọc, diệt trừ các loại cỏ năn lác và lá rộng cho các cây trồng hòa
bản như lúa, ngô, mía. Ngoài ra còn có tác dụng điều hoà sinh trưởng nhóm
Auxin, do đó còn sử dụng là chất kích thích đặc biệt là mầm, rễ.. .[12]
2,4-D gây trở ngại quá trình sinh trưởng bình thường của thực vật. Nó
được hấp thu qua lá, thân, rễ. Trong thực vật 2,4-D bị thoái hóa bởi các con
đường hoá học và sinh học khác nhau [25].
Ở Việt Nam
Hiện nay, 2,4-D vẫn thuộc danh mục hoá chất diệt cỏ được phép sử
dụng ở Việt Nam (theo danh mục hoá chất bảo vệ thực vật được phép, hạn chế
và cấm sử dụng ở Việt Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn,
2004) [5].
Gần đây có rất nhiều thông tin về việc lạm dụng 2,4-D để làm chất kích
thích như ngâm giá đỗ ở Hà Nội và thông tin hoa quả nhập từ Trung Quốc về
Việt Nam cũng bị ngâm 2,4-D.
6
Vì được sử dụng làm thuốc diệt cỏ và kích thích sinh trưởng, nên dư
lượng của 2,4-D được quy định trong nông sản theo Uỷ ban dinh dưỡng của
liên hợp quốc (CODEX ALIMENTARIUS) là từ 0,1- 0,5 mg/kg [20].
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG 2,4-D
1.2.1. Xử lý mẫu
Bao gồm các kỹ thuật chiết, làm sạch và làm giàu chất phân tích. Hiện
nay có rất nhiều quy trình xử lý mẫu nhằm chiết 2,4-D từ các đối tượng môi
trường (đất, nước bề mặt...), thực phẩm và nông sản.
1.2.1.1. Chiết thông thường [8],[15]
• Chiết lạnh
Nguyên tắc: sử dụng dung môi hữu cơ để chiết chất phân tích tan trong
dung môi từ mẫu đã được nghiền nhỏ ở nhiệt độ thường. Sau đó làm sạch bằng
hấp phụ pha rắn. Có thể sử dụng một số tác nhân vật lý bổ trợ như: lắc cơ học,
khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm...
Áp dụng: Là kỹ thuật phổ biến nhất sử dụng chiết HCBVTV từ nông
sản và dược liệu.
Dung môi: Aceton, hexan, ether dầu hoả.
Ưu, nhược điểm: Kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém. Tuy nhiên, nhược điểm
là sử dụng dung môi hữu cơ gây tổn hại đến môi trường và sức khoẻ, nếu chiết
bằng dung môi hữu cơ không phân cực hàm ẩm trong mẫu không được quá
lớn.
• Chiết nóng trong dụng cụ Soxhlet
Nguyên tắc: Dùng dung môi ở nhiệt độ cao chiết liên tục và chiết kiệt
chất phân tích trong mẫu đã nghiền nhỏ.
Áp dụng: Cho mẫu đất, nông sản, môi trường, chè và dược liệu.
Dung môi: Hỗn hợp ether dầu hoả hoặc hexan và aceton.
7
ưu, nhược điểm: Là kỹ thuật chiết kinh điển nhưng hiệu quả. Nhiệt độ
sôi của hỗn hợp dung môi hữu cơ không quá cao tránh làm phân hủy các chất
phân tích. Nhược điểm là thường tốn dung môi hữu cơ và thời gian chiết dài.
Hiện nay, phương pháp phân tích 2,4-D trong đất (TCVN 6134:1996)
sử dụng kỹ thuật chiết Soxhlet.
1.2.1.2. Làm sạch và làm giàu chất phân tích trong mẫu bằng chiết pha rắn
(SPE) [1],[8],[15],[17],[26]
Nguyên tắc: Chất phân tích được tách từ mẫu bằng một chất rắn, sau đó
rửa giải bằng dung môi thích hợp.
Cột Silica gel dùng trong phân tích dư lượng rất phân cực, có tính chất
hấp phụ mạnh hoạt động theo nguyên tắc giữ lại tạp chất phân cực và để chất
phân tích ít hoặc không phân cực đi qua cột.
Áp dụng: Sử dụng SPE với pha tĩnh là Silica gel để chiết, làm sạch chất
phân tích.
Ưu, nhược điểm: Có thể giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ được sử
dụng, chiết khá chọn lọc, thời gian chiết nhanh, tỷ lệ thu hồi chất cao, hiệu
quả chiết tốt, độ lặp lại cao và có thể tự động hoá toàn bộ quá trình chiết. Tuy
nhiên cột SPE nhồi sẵn còn khá đắt, sử dụng chưa thật phổ biến ở Việt Nam.
1.2.2. Phân tích định tính và định lượng
Phương pháp phân tích 2,4-D trong môi trường theo Cơ quan bảo vệ
môi trường Mỹ (EPA), hoặc theo Hiệp hội hoá học phân tích quốc tế (AOAC)
là sử dụng sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC-MS) [22].
Phương pháp phân tích 2,4-D trong thực phẩm theo cơ quan quản lý
thực phẩm, dược phẩm (FDA) của Mỹ cũng tương tự. Ngoài ra, người ta còn
tạo dẫn xuất methyl ester của 2,4-D dễ bay hơi, phân tích bằng sắc ký khí với
detector MS hoặc ECD.
8
sử đụng sắc ký khí [25]
2,4-D là một acid hữu cơ, khá phân cực, ít bay hơi tuy nhiên có thể làm
bay hoi nhờ dẫn xuất hoá. Để phân tích 2,4-D bằng sắc ký khí, kỹ thuật
thường dùng nhất là tạo dẫn xuất ester (ví dụ tạo methylester bằng phản ứng
với BF3-methanol, diazomethal hoặc với hỗn hợp acid sulfurid-methanol). Sau
đó thực hiện kỹ thuật lấy mẫu không gian hoi (head space). Để phân tích, sử
dụng sắc ký khí mao quản với detector ECD (do 2,4-D có 2 nguyên tử clo
trong phân tử, do đó ECD rất nhạy vói 2,4-D) hoặc khối phổ.
Sử dụng sắc ký lỏng [4]
Theo TCVN 6134 : 2006, phương pháp định lượng 2,4-D trong đất,
được xây dựng từ năm 1996, để định tính và định lượng 2,4-D, sử dụng sắc ký
lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector u v ở 230 nm. Nhược điểm của
phương pháp là có độ đặc hiệu và độ nhạy thấp.
Hiện nay trên thế giới, chủ yếu sử dụng LC-MS để phân tích dư lượng
2,4-D trong các đối tượng môi trường, nông sản và thực phẩm. Phương pháp
này có tính đặc hiệu và có độ nhạy cao.
1.3. TỔNG QUAN VỂ SẮC KÝ LỎNG KHỔl PHỔ
1.3.1. Vài nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ [10]
Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) và detector khối phổ (MS).
Trong kỹ thuật LC-MS, hỗn hợp các chất trong pha động sau khi được
tách khi qua cột sắc ký sẽ được phát hiện bằng detector khối phổ.
Sự kết nối sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS) đầu tiên được thực hiện
năm 1950, chỉ 4 - 5 năm sau sự ra đời của GC. Sự kết nối sắc ký lỏng với khối
phổ kế là rất dễ nhận ra do lĩnh vực rộng lớn của các hợp chất có thể dùng
HPLC để phân tích bao gồm những chất kém bền vói nhiệt và các phân tử kém
bay hơi không thể sử dụng sắc ký khí, và do độ chọn lọc cao của HPLC.
9
Vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân không
cao (hệ thống phân tích khối phổ) là nhân tố chủ yếu của sự chậm trễ này.
Chính vì vậy, mặc dù kỹ thuật sắc ký lỏng ra đời trước sắc ký khí nhưng kỹ
thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) được thực hiện trước kỹ thuật sắc ký
lỏng ghép khối phổ (LC-MS), mãi đến năm 1970 việc kết nối LC-MS mới
thành công.
Người ta thường sử dụng phương pháp LC-MS cho: [9]
+ Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi
(GC-MS rất khó thực hiện hay không thực hiện được).
+ Các phân tích kiểm nghiệm phức tạp mà HPLC thường không giải
quyết được.
+ Các nghiên cứu về cấu trúc một số phân tử có nguồn gốc tự nhiên.
Phân tích khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau của khoa học công nghệ như xác định các đồng vị, xác định công thức
cấu tạo, định tính và định lượng các chất trong dịch sinh học và trong các sản
phẩm có nguồn gốc tự nhiên [1],[19].
1.3.2. Thiết bị sắc ký lỏng khôi phổ [1],[3],[9],[10],[11],[19],[21]
1.3.2.1. Pha động
Trong sắc ký lỏng, thành phần của dung môi rửa giải (pha động) là một
trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách. Pha động thường là các dung môi
hữu cơ hoặc dung dịch nước.
Có hai cách dùng pha động để rửa giải:
• Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình
sắc ký.
• Gradient: Pha động thường là hỗn hợp dung môi, thuờng là 2 đến 4
loại được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong
quá trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi).
10
1.3.2.2. Bơm
Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung
môi qua hệ thống sắc ký. Yêu cầu của bơm là phải đẩy được dung môi rửa giải
thành dòng qua cột tách và không có xung ở áp suất cao. Dòng không liên tục
sẽ gây nhiễu đường nền.
1.3.2.3. Cột tách
Cột HPLC thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tinh hoặc chất
dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm. Kích thước hạt của
chất nhồi trong cột thường là 5-10 |j.m. Các chất nhồi thường được sử dụng là
Silica gel, hoặc các loại pha đảo C2, C8, C18...
Cột tách sắc ký lỏng phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và
có thể chịu được áp suất cao.
1.3.2.4. Detector khối phổ
Một trong những bộ phận quan trọng nhất trong HPLC là detector. Việc
chọn detector để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hóa của chất cần phân tích.
Hiện nay người ta hay sử dụng các loại detector sau:
Detector hấp thụ tử ngoại (UV), detector huỳnh quang, detector điện
hóa, detector chiết suất vi sai, detector khối phổ, detector đo độ dẫn....
Việc sử dụng khối phổ kế làm detector cho sắc ký đem lại một số ưu
điểm:
• Có thể đưa ra thồng tin về cấu tạo hoá học của chất phân tích, thông tin
này đặc hiệu hơn là khi sử dụng các loại detector khác (detector tử ngoại khả
kiến, detector hồng ngoại, detector điện hoá..
• Có tính chọn lọc, phân tích đúng và chính xác đối tượng phân tích.
• Có độ nhạy cao (phân tích được dư lượng các chất ở mức ppb) vì dòng
khối phổ nhạy [10].
11
a. Nguyên tắc hoạt động [13]
Khối phổ là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của
ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng
nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này được
diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10'3 Pa đến
10‘6Pa.
Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic)
có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối. Nó cung cấp thông tin định
tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng
các chất.
b. Nhiệm vụ của detector khối phổ [9]
- Đối với phân tích định tính: Khi ghép vói thiết bị sắc ký lỏng, hoá chất
được xác nhận bằng:
+ Sắc ký đồ ở thời gian lưu xác định tRđặc trưng cho hoá chất. tRnày
chính là thời gian từ lúc hoá chất bắt đầu vào cột và ra khỏi cột để vào detector
khối phổ.
+ Phổ khối tương ứng của hoá chất hoặc phổ khối biểu diễn cường độ
các ion sinh ra từ một ion nhất định của hóa chất
Như vậy việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu, vừa phổ khối sẽ
chắc chắn hơn là chỉ dựa vào thời gian lưu.
- Đối với phân tích định lượng: Do đặc thù của detector như đã nêu,
giúp cho định lượng đúng đối tượng và có độ nhạy cao.
c. Các bộ phận của detector khối phổ [1],[9],[19]
- Bộ nạp mẫu:
Trong máy sắc ký lỏng khối phổ, bộ nạp mẫu là đầu ra của máy sắc ký
lỏng được kết nối với khối phổ.
- Bộ phận ion hoá (ionizer):
12
+ Nhiệm vụ:
• lon hoá chất cần phân tích.
• Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hoi.
• Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối.
• Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong
chân không sâu.
• Rút ra ngoài các phân tử trung hoà và ion khác dấu có thể ảnh
hưởng đến phép đo.
+ Kỹ thuật ion hoá: Hiện nay sử dụng chủ yếu hai kỹ thuật phun điện tử
(ESI) và ion hoá bằng hoá học ở áp suất thường (APCI).
Kỹ thuật sử dụng trong khoá luận này là kỹ thuật ESI, kỹ thuật sử dụng
phổ biến nhất trong LC-MS. Kỹ thuật này được mô tả như sau:
Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một
ống mao quản bằng kim loại cao thế 3 - 5 KV (điện thế dương ở đầu kim tạo
ion dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy chất khảo
sát) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao
quản. Dưới tác dụng của điện thế cao và luồng khí phun nitơ, có sự tạo thành
những hạt nhuyễn mang điện thoát ra từ đầu ống mao quản.
Trong khí nóng, các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện
tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bể
dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích. Sau đó, các ion dương hoặc âm
tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí
nitơ bị bơm hút ra ngoài.
- Bộ phận phân tích khối:
Bộ phân tích khối được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ
tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Các ion được
13
gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến
detector.
- Bộ phận phát hiện ỉon:
Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện
tử của máy khối phổ.
1.3.3. Một số kỹ thuật LC-MS [9],[19]
1.3.3.1.Kỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan)
Giả sử ta có một hỗn hợp A, B, c được tách ra sau khi qua cột sắc ký
lỏng và lần lượt đưa vào detector khối phổ:
A
--------►
A+l, Aj, A2, A3...
B
c
Khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ A, B, c. Ta có
một sắc đồ toàn ion TIC (Total lon Chromatogram) và phổ khối được lấy toàn
bộ (FULL SCAN MS) các ion sinh ra từ A, B, c.
A
14
Trong sắc đồ toàn ion , mũi A biểu diễn tổng cường độ các ion A+l, Aj,
A2, A3.. .sinh ra từ mũi A, mũi B biểu diễn tổng cường độ các ion B+l, Bj, B2,
B3.. .sinh ra từ B và tương tự cho mũi c.
FƯLL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên
phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn.
1.3.3.2. Kỹ thuật phân tích chọn lọc ỉon (SIM, Selectỉve Iort Monitoring)
Nếu ngay từ đầu ta chỉ cho khối phổ kế nhận diện ion Aj (z = 1) mà thôi
và ghi sắc đồ theo thời gian, ta nói đã áp dụng kỹ thuật SIM để phát hiện, và
sắc đồ lúc bấy giờ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa Aj mà thôi. Ta nói lấy khối
phổ SIM (m/z = Aj). Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền
và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu s/nhiễu đường nền N.
Có thể sử dụng kỹ thuật SIM để định lượng với điều kiện biết chắc chắn
là mũi ở thời gian lưu tAđúng là mũi của hợp chất A thuần tuý, không có tạp
chất nào có ion Aj có cùng thời gian lưu tA. Kỹ thuật này thuận lợi để phân
tích dư lượng một chất đã biết trong một nền mẫu phức tạp.
Kỹ thuật SIM nhạy hơn so vói FULL SCAN
1.3.3.3. Kỹ thuật MS/MS
Đối với kỹ thuật MS/MS, một ion chọn lọc ồ chế độ MS lần 1 được
phân tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion
con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2.
Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do
làm giảm nhiễu đưòng nền rất đáng kể. Trong một nền phức tạp, sử dụng kỹ
thuật này giúp xác nhận cấu trúc và định lượng tốt hơn.
15
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1.1. Hoá chất - thuốc thử
- Chuẩn 2,4-D 99,8% (Merck).
- Các dung môi tinh khiết dùng cho sắc ký: Methanol, acetonitril.
2.1.1.2. Thiết bị dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Thermo-Finigan LCQ Avantage
Max.
Hình 2.1. Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max
16
- Dụng cụ chiết pha rắn (SPE Maniíold, Supelco).
- Cột chiết pha rắn 3 mL, nhồi 0,5g Silica gel tinh khiết dùng cho phân
tích dư lượng có kích thước 63-200 |um (Altech).
- Máy cất quay chân không (Rovator, Buchi RE 111).
- Máy lắc siêu âm Branson 5200.
- Thuyền tán, rây...
2.1.1.3. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là dư lượng 2,4-D trong dược liệu. Do 2,4-D là
chất diệt cỏ nên chúng tôi chọn dược liệu là bộ phận dưới mặt đất như rễ, thân
rê
Để xây dựng phương pháp, chúng tôi sử dụng mẫu Nhân Sâm Hàn
Quốc sạch. Mẫu này không có 2,4-D và được cung cấp bởi khoa kiểm nghiệm
Đông dược Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Xử lý mẫu
- Chuẩn bị mẫu: bao gồm mẫu chuẩn và mẫu nhiễm.
- Xác định hàm ẩm: Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 5.16. Xác định
mất khối lượng do làm khô.
- Chiết đối tượng nghiên cứu từ mẫu dược liệu:
Khảo sát 2 kỹ thuật chiết:
+ Chiết lạnh.
+ Chiết Soxhlet.
- Làm sạch:
+ Tiến hành theo TCVN 6134:1996 (Xác định dư lượng 2,4-D
trong đất)
+ Sử dụng phương pháp chiết pha rắn.
17
\
