Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang (litsea cubeba (lour ) pers

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

VŨ THỊ THÙY
Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

VŨ THỊ THÙY
Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Lớp

:

K44 - CNSH

Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn:
1. TS. Phí Quyết Tiến
Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. ThS. Bùi Đình Lãm
Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này,
tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và cán bộ Phòng Công
nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến –
Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Lên
men, Viện Công nghệ Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt

quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới NCS. Vũ Thị Hạnh
Nguyên – cán bộ phòng Công nghệ Lên men, người đã trực tiếp hướng dẫn
tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn CN. Nguyễn Phú Tâm cùng các cán bộ
Phòng Công nghệ Lên men đã chỉ bảo tôi nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện
cho tôi trong suốt quá trình thực hiện tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS. Bùi Đình Lãm cùng các thầy cô giáo
trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô,
cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong
suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những
người đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực
tập này.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2016
Sinh viên
Vũ Thị Thùy


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược
liệu ................................................................................................................... 11
Bảng 2.2. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội
sinh trên thực vật ............................................................................................. 14
Bảng 3.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 21
Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen
16S rDNA ........................................................................................................ 26
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái của một số chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình
phân lập từ các mẫu cây Màng tang ................................................................ 28

Bảng 4.2. Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 45
chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang ...................................... 32
Bảng 4.3. Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ................... 34
Bảng 4.4. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT25 khi nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau ............................................................................................. 36
Bảng 4.5. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nguồn nitơ của chủng xạ khuẩn
MPT25 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C .......................................................... 37
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của
chủng MPT25 .................................................................................................. 38
Bảng 4.7. Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ
khuẩn MPT25 .................................................................................................. 39


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm
anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA ............................................................. 17
Hình 4.1. Hình ảnh khuẩn lạc đại diện của các chủng xạ khuẩn nội sinh trên
ba môi trường đặc hiệu và 3 bộ phận khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy (A-Rễ, BThân, C-Lá) ..................................................................................................... 27
Hình 4.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh được phân bố trên các bộ phận của cây
Màng tang ........................................................................................................ 29
Hình 4.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân theo các môi trường phân lập .......... 30
Hình 4.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh được phân theo nhóm màu ...... 31
Hình 4.5. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A), Pseudomonas
aeruginosa CNLM (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh .............................. 33
Hình 4.6. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường ISP4(A), hình ảnh bề mặt chuỗi
bào tử dưới kính hiển vi có độ phóng đại 5.000 lần (B) và 20.000 lần (C) của
chủng MPT25 .................................................................................................. 36
Hình 4.7. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel
agarose 1,0% ................................................................................................... 39

iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

STT

Tên đầy đủ

1

CA

Citrate acid-agar

2

DAB

Deacetil baceatin

3

DNA

Deoxyribonucleotide acid

4

DNR

Daunorubicin

5

DOX1

Doxorubicin

6

HV

Humic acid-agar

7

IDA

Idarumycin

8

NaOCl

Sodium hypochlorite

9

RNA

Ribonucleic acid

10

SPA

Sodium propionate-asparagine-salt agar

11

VSV

Vi sinh vật


v
MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4
2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu......................................................... 4
2.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu..................................... 4

2.1.2. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn............................................... 5
2.1.3. Phân lập xạ khuẩn nội sinh ..................................................................... 7
2.1.4. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật .......................................... 8
2.1.5. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ....................................... 9
2.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh .................................................. 13
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 13
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................ 15
2.3. Khả năng sinh các chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline .............. 16
2.4. Cây Màng tang và tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh ....................... 18
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................... 20
3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 20
3.1.1. Thu thập mẫu cây Màng tang, chủng gống vi sinh vật ......................... 20
3.1.2. Hóa chất................................................................................................. 20
3.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 21
3.1.4. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 21


vi
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 21
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22
3.4.1. Lấy mẫu cây Màng tang ........................................................................ 22
3.4.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu ............................................................ 22
3.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ............. 22
3.4.4. Đánh giá khả năng sinh anthracycline .................................................. 23
3.4.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT25 ................ 23
3.4.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 dựa trên phân tích trình tự gen 16S
rDNA ............................................................................................................... 25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27
4.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ

......................................................................................................................... 27
4.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang .................................. 29
4.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang .............. 29
4.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập ........ 30
4.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty ............ 31
4.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ................... 32
4.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ........................... 32
4.3.2. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline ...................... 34
4.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT25 ................. 35
4.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 ......................................... 35
4.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng
xạ khuẩn MPT25 ............................................................................................. 38
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, con người đang phải đối mặt với nhiều dịch bệnh gây ra bởi
vi khuẩn, nấm, virus và các vi sinh vật khác. Để điều trị các bệnh truyền
nhiễm gây ra bởi vi sinh vật, kháng sinh được sử dụng là chủ yếu. Tuy nhiên,
vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh đang là vấn đề
nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm hàng hàng đầu của cộng đồng. Vì vậy,
việc nghiên cứu lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên
hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới. Cho
đến nay, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự
nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại
thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng

phụ tới sức khỏe của người bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra.
Theo nghiên cứu của Berdy, 2005 ước tính khoảng 70% các kháng sinh
có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay được sản
sinh bởi xạ khuẩn [10]. Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất
chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu sinh ra
rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các chất kiểm soát sinh
học, các chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét,
chất diệt cỏ,chất kích thích sinh học và kiểm soát sinh học… [9, 48]. Hơn
nữa, nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cho thấy vai trò chức năng của chúng đây
là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để khắc phục những mối đe dọa gia tăng của
kháng thuốc, chống lại tác nhân gây bệnh cho con người và thực vật. Tuy nhiên,
so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn
nội sinh trên thực vật vẫn còn rất hạn chế .


2
Một trong những nguồn phân lập xạ khuẩn nội sinh là thực vật, đặc biệt
là cây dược liệu. Trong số đó, cây Màng tang (Litsea cubeba) là loài dược liệu
đã được trồng lâu để khai thác với nhiều công dụng như: kháng khuẩn, kháng
nấm, nhức đầu, đau dạ dày, đầy hơi, phong thấp… Ngoài giá trị khoa học do
thành phần của cây mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy cây Màng tang
còn là môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp chất
kháng sinh, chất chống ung thư. Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ
khuẩn trên cây Màng tang nói riêng và cây dược liệu nói chung tại Việt Nam
vẫn còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và nghiên
cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea
cubeba (Lour.) Pers.)”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp các
chất kháng khuẩn và nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại của một chủng

xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh cao.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh một số các
chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) thu
thập tại tỉnh Phú Thọ.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài kế thừa kết quả của một số nghiên cứu trước đây của nhóm
nghiên cứu cũng như những kết quả nghiên cứu trong, ngoài nước về lĩnh vực
khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung
thư mới. Đề tài chọn đối tượng là cây Màng tang đã được nghiên cứu khá
nhiều trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu hoặc
tách chiết các hợp chất tự nhiên có tiềm năng kháng vi sinh vật, kháng tế bào


3
ung thư. Từ đó, đưa ra một số cơ sở khoa học về mặt lý thuyết và cơ chế nội
sinh của các chủng xạ khuẩn trên mô tế bào cây Màng tang. Đồng thời, đánh
giá khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn nhằm tìm ra
chất kháng sinh, kháng ung thư mới.
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu tìm kiếm các chất có
hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực y học, hóa dược.
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học và
nghiên cứu khoa học, tác phong và kỹ năng làm việc sau này.
- Giúp sinh viên biết cách đặt vấn đề, đưa ra phương pháp nghiên cứu,
xử lý, phân tích số liệu và trình bày một đề tài khoa học.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu
2.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu
Khái niệm xạ khuẩn nội sinh được đưa ra khi Smith và cộng sự (1957)
đã phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế
mạnh nấm Fusarium oxyporum f. sp. Lycopersici [55]. Từ đó, có rất nhiều
định nghĩa khác nhau về vi sinh vật (VSV) nội sinh, theo Bacon và White
(2000) định nghĩa: “VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào
thực vật, không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ” đã được các nhà VSV học
thừa nhận [9].
Xạ khuẩn nội sinh ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà phân loại
học, sinh thái học, nông học, hóa học và sinh học tiến hóa bởi khả năng sản
xuất ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm: kháng sinh, kháng u và
kích thích sự tăng trưởng của thực vật - yếu tố quan trọng trong ngành công
nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [21]. Xạ khuẩn cũng đã được chứng minh
khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm
mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện
khác nhau [3].
Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật là rất phong phú,
hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng
xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt
tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh là rất đa dạng về mặt số
lượng. Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói
chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược
liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên
thế giới.


5

2.1.2. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes
(gồm vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật
(Eubacteria) và siêu giới nhân sơ nhóm Prokaryota [51]. Xạ khuẩn nội sinh
sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ
và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào. Đáng chú ý,
trong số gần 300.000 loài thực vật trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú
của một hoặc nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tạo ra sự đa dạng sinh học rất lớn
[56]. Tuy nhiên, mới chỉ có một vài loài thực vật được nghiên cứu để tìm ra
các loài xạ khuẩn mới.
2.1.2.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
* Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử
Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ
thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất
(KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được
chỉnh lí và tái bản năm 1983 [26]. Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày
một tăng trong những năm gần. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa
trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy.
Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3
nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những
cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát
triển mạnh và xoắn. Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp
(gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [42].
* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và
nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác


6
nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH,

nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối
quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối
kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh
và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
2.1.2.2. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học
phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là
phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có
độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản
phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3
phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S
rDNA [1].
Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác
định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả
các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [41]. Chúng chỉ
khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này
người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại
các chủng VSV. Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào
chất. Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và
protein riêng rẽ. Ribosome ở VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu
đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm
rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1].
Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có
cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rDNA thì 16S
rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S


7
rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn
gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự

nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là
một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân
sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho
tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn.
Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai
trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA
thấp hơn 70% sẽ là 99% [57]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự
16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên,
cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá tri này là 98%.
2.1.3. Phân lập xạ khuẩn nội sinh
Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi
trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất,
lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ...
Trên bề mặt tế bào thực vật chứa rất nhiều vi khuẩn, nấm. Do đó, trong
quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh, ta cần xử lý bề mặt mẫu thực vật thật
kỹ, tránh bị nhiễm VSV cũng như tăng độ thuần chủng của loài xạ khuẩn nội
sinh phân lập. Trong quá trình khử trùng bề mặt mẫu, đầu tiên ta rửa mẫu
dưới vòi nước chảy liên tục để rửa trôi vi khuẩn, vi nấm bề mặt, để khô, cắt
nhỏ mẫu bằng dụng cụ đã được khử trùng trước khi phân lập. Sodium
hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử
dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật được ngâm trong ethanol 70-99% từ
1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần
bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydro
peroxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt


8
hiệu quả [38]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ
với ethanol không hiệu quả với quá trình phân lập VSV nội sinh. Nếu tăng
gấp hai hoặc ba lần các bước khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp ethanol và một

số chất khử trùng khác thì không phân lập được xạ khuẩn nội sinh. Hiệu quả
khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề
mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử
trùng với bề mặt thực vật [11].
Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp,
nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quá trình phân lập, hai tuần
đầu tiên VSV phát triển mạnh là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu
thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong
muốn cũng như tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã
được sử dụng như: môi trường thạch humic acid-vitamin, môi trường thạch
casein tinh bột, cao nấm men,… [12, 32, 36]. Ngoài ra, bổ sung các hợp chất
kháng sinh như acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide
để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc
của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [27].
2.1.4. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật
Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, ngày càng có
nhiều nhà khoa học nghiên cứu về mối quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật
cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực vật. Theo nhiều nghiên cứu
cho thấy vi khuẩn thường xâm nhập vào mô thực vật qua lỗ khí, vết thương,
lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ phụ và biểu bì bị phân cắt bằng cách hình
thành cụm tế bào của chúng [28]. Hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi mọc
trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên và các vết
thương do cơ học hoặc côn trùng. Chủng xạ khuẩn Streptomyces scabies hình


9
thành mạng lưới phủ trên bề mặt khoai tây. Sợi nấm xâm nhập vào củ khoai
tây thông qua lỗ hổng trên bề mặt cây non và các vết thương khi khoai tây
đang ở giai đoạn phát triển mạnh. Sau khi xâm nhập, các tác nhân gây bệnh
phát triển trong các khoảng trống của tế bào và phý hủy các tế bào mà chúng

tiếp xúc. Ngoài ra, chủng Streptomyces ipomoeae cũng gây bệnh thối ở củ
khoai tây bằng cách phát triển trên bề mặt rễ và xâm nhập vào rễ thông qua
các mô ở vị trí liên kết giữa các tế bào [15]. Loài này hình thành hệ sợi phân
nhánh từ sợi chính và xâm nhập trực tiếp vào thành tế bào chủ.
Từ đó, nhiều nhà khoa học đã đưa ra các hình ảnh mô tả sự hiện hiện
của các sợi nấm trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế
nội sinh của VSV nội sinh vẫn là một ẩn số. Năm 2003, Coombs và Franco đã
gắn protein huỳnh quang xanh vào chủng Streptomyces sp EN27 cấy vào hạt
lúa mì để nghiên cứu sự hình thành, phát triển của chúng trong cây chủ [17].
Kết quả, tuy không chứng minh được giai đoạn xâm nhập ban đầu của xạ
khuẩn nội sinh vào vật chủ nhưng cũng khẳng định được xạ khuẩn nội sinh
xâm nhập vào cây chủ từ rất sớm, và có thể xâm nhập qua phôi của vỏ hạt rồi
mở rộng ra các nội nhũ của hạt. Năm 2007, Franco tiếp tục quan sát khuẩn lạc
của chủng EN27 tại các vết nứt xung quanh rễ và quá trình hình thành bảo tử
trong 3-4 tuần [20]. Kết quả cho thấy sự lây nhiễm của chúng vào rễ thông
qua các vết nứt để xâm nhập và nhân lên trong các mô tế bào.
2.1.5. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật
Phần lớn xạ khuẩn nội sinh có thể sống trong các mô thực vật và không
gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quá trình phát triển bình thường của cây.
Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về khả
năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thư, enzyme, chất kích thích sinh
trưởng thực vật, ức chế và kiểm soát bệnh thực vật….


10
2.1.5.1. Kháng ung thư, kháng sinh
Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng, ức chế
tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội sinh đang là hướng nghiên cứu mới của các nhà
khoa học trên thế giới. Li J và cộng sự khi nghiên cứu chất chống ung thư và hoạt
tính kháng khuẩn của xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu trong rừng nhiệt đới đã

xác định được 41 chủng xạ khuẩn nội sinh Streptomyceps có khả năng kháng ung
thư. 31,7% trong số chúng biểu hiện hoạt động gây độc trên các tế bào A549,
29,3% trên các tế bào HL-60, 85,4% trên các tế bào BEL-7404 và 90,2% trên các
tế bào P388D1 [34].
Chất kháng sinh đã được phát hiện và ứng dụng để chữa bệnh cho con
người. Nhờ kháng sinh mà chúng ta đã đẩy lùi được nhiều bệnh và dịch bệnh
nguy hiểm do vi khuẩn hay nấm gây ra như: thương hàn, tả, đậu mùa… Xạ
khuẩn, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces được xem là nguồn sản
xuất chất kháng sinh nhiều nhất [44]. Trong số các tác kháng sinh được biết
trên thế giới, 80% là do xạ khuẩn sinh ra [18]. Nhiều loại xạ khuẩn nội cộng
sinh, đặc biệt là những loài từ cây dược liệu có khả năng ức chế, tiêu diệt
nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm, virus. Do đó, xạ khuẩn nội sinh
có tiềm năng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới. Bảng dưới đây cho
thấy tiềm năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây
dược liệu (Bảng 2.1).


11
Bảng 2.1. Các chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh trên
cây dƣợc liệu
Xạ khuẩn

Cây dƣợc liệu

Streptomyces

Cây họ Dáy

sp. MSU-

(Monstera

2110

sp.)

Streptomyces
sp. CS

Mỹ đăng mộc
(Maytenus
Hookeri)

Streptomyces

Liễu sam

sp. TP-

(Cryptomeria

A0456

Japonica)

Streptomyces
sp. TPA0556

Chi Ô rô
bà(Aucuba

Japonica)

Kháng sinh

Hoạt tính

Coronamycins

Kháng sinh

24-demethylbafilomycin C1

Cedarmycins A
and B

Tài liệu
tham thảo

[19]

Kháng sinh
Kháng ung

[37]

thư
Kháng nấm

Demethylnovobio

Kháng vi

cins

sinh vật

[29]

[29]

Ngày càng có nhiều chất kháng sinh mới được phát hiện từ các loài xạ
khuẩn nội sinh như: munumbicins A-D [13], celastramycins A-B [43],
kakadumycins [12] và demethylnovobiocins [29]...
Do vậy, hiện nay xạ khuẩn nội sinh là nguồn tiềm năng cần được quan
tâm nhằm khai thác các chất có hoạt tính sinh học mới và thúc đẩy tìm kiếm các
loại thuốc mới.
2.1.5.2. Kháng nấm, kháng viêm
Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn nội sinh đã được nghiên cứu.
19 chủng xạ khuẩn được phân lập từ lá nim, bạch đàn và hat cà phê đã được sử
dụng để xác định hoạt tính chống nấm. Chủng NEK5 (từ lá nim), EE9 (bạch đàn)
và CE1 (hạt cà phê) cho thấy hoạt tính chống nấm tốt. Dịch chiết ethyl acetate thu


12
nhận từ môi trường thạch nuôi cấy với chủng NEK5, EE9 và CE1 ức chế sự tăng
trưởng của các mầm bệnh như Fusarium sp, Pythium sp, Curvularia sp và
Cercospora sp [62].
Các chất chuyển hóa từ 23 chủng Streptomycetes cho thấy hoạt tính kháng
nấm. Nấm men (S. cerevisiae) nhạy cảm với hầu hết các chất chiết từ xạ khuẩn
nội sinh, mặc dù Candida albicans kháng với hầu hết các sản phẩm. Các hợp chất

từ xạ khuẩn nội sinh Streptomycetes có thể ngăn chặn sự phát triển của nấm: (F.
oxysporum, Cladosporium fulvum, và R. Solani [33].
2.1.5.3. Kiểm soát sinh học
Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của
các nhà VSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do đặc tính
nội sinh và tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Cơ chế
kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi chất như chất
kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone... Ngoài ra, các chủng xạ
khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kích thích các
thụ thể tế bào.
Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm
Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây
Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh
Erwinia carotovora và F. oxysporum; kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid
jasmonic, acid salicilic và etylen [16]. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với
các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi
xạ khuẩn nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng
trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng.
2.1.5.4. Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh
Ngoài đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông
qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh đã


13
được khoa học biết đến từ lâu. Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn
phát hiện ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của nhóm VSV này có ý nghĩa rất
quan trọng đối với sức khỏe con người.
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất phá hủy tế bào hồng cầu
của động vật (như haemolysin ở Rhodococcus equi). Các nhà khoa học đã
phát hiện tiềm năng rất lớn của các hợp chất này trong xạ khuẩn có tác dụng

làm tan những phần máu đông tụ ở những người bị bệnh tim mạch. Trong
phòng thí nghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt tính chống đông máu (phá
hủy hồng cầu) từ xạ khuẩn được tiến hành trên mẫu máu động vật như máu
ngựa, máu thỏ [50].
Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với
sự sinh trưởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên còn
chưa rõ ràng nhưng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực y dược, dược
phẩm, nông nghiệp đã được chứng minh. Chính vì lý do này, các nhà khoa
học hiện nay rất quan tâm tới việc sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học
cao từ xạ khuẩn nói chung và xạ khuẩn nội sinh nói riêng.
2.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong vài thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều thành tựu trong tìm kiếm
các loài xạ khuẩn và các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong
mô tế bào thực vật. Sơ lược về tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên
thực vật trong hơn 10 năm gần đây được thể hiện trong bảng 2.2


14
Bảng 2.2. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn
nội sinh trên thực vật
Loài thực vật

Chi xạ khuẩn

Tài liệu
tham khảo

Cây trồng

Đậu Hà Lan
(Pisum sativum)
Dầu mè
(Jatropha curcasL.)

Micromonospora pisi

[22]

Pseudonocardia sichuanensis

[47]

Cây dƣợc liệu

Cam thảo nam (Scoparia
Glycomyces scopariae
dulcis)
Thanh hoa hoa vàng
(Artemisia annuaL.)

Pseudonocardia artemisiae

[45]
[64]

Xạ khuẩn đã được phân lập từ thân và rễ của nhiều loài thực vật như:
lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua và cam quýt [8], [40]… các loài cây
thân gỗ khác nhau [53], [64]… dương xỉ và rêu [31]. 2174 chủng xạ khuẩn đã
được thu nhận trên các môi trường khác nhau từ 90 loại cây dược liệu tại rừng

nhiệt đới Xishuangbanna và xác định chúng đại diện cho 10 bộ khác nhau và
32 chi trong đó có 19 loài xạ khuẩn mới [46]. Các chủng xạ khuẩn được phân
lập thì chi Streptomyces spp chiếm ưu thế nhiều nhất sau đó lần lượt là các
chi:

Microbispora,

Micromonospora,

Nocardioides,

Nocardia

và

Streptosporangium [48]. Từ 36 cây dược liệu ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu
của Taechowisan đã phân lập được 330 chủng xạ khuẩn thuộc 4 chi khác
nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia, Micromonospora) [58]. Tuy
nhiên, Lee và cộng sự (2008) đã phân lập được 81chủng xạ khuẩn nội sinh từ
rễ bắp cải Trung Quốc, các chủng phân lập được thuộc chi Microbispora spp
là phổ biến, chiếm 67%; tiếp theo là Streptomyces spp chiếm 12% và


15
Micromonospora spp chiếm 11% [33] . So với thân cây và lá thì rễ cây chứa
xạ khuẩn nội sinh đa dạng hơn. Cho đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã
được tìm thấy bằng nhiều phương pháp phân lập và phân loại khác nhau, bao
gồm 4 chi mới thuộc nhóm Plantactinospora, Actinophytocola, Phytohabitans
và Jishengella [48].
Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật rất phong phú hứa

hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ
khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực đời sống.
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về VSV nội sinh nói chung và
xạ khuẩn nói riêng.
Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Mai Hương tại Viện Hóa học các
hợp chất thiên nhiên đã thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ
(Taxus sp.) ở Việt Nam và tách chiết một chất gần giống 10-deacetil baceatin
III (10-DAB)-chất chuyển hóa thành taxol. Từ lõi cây, nhóm nghiên cứu đã
phân lập được 6 chủng nấm, trong đó một chủng thuộc loài Mucor
circinolloides var. tieghem. Chất tách chiết từ dịch lên men của chủng nấm
nội sinh có đặc điểm gần giống với 10-DAB từ cây thông đỏ. Từ kết quả đó,
có thể khẳng định những sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học không
chỉ được tạo ra từ cây chủ mà còn có thể tạo ra bởi VSV nội sinh [2].
Quách Ngọc Tùng và các cộng sự tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập được 78 chủng xạ
khuẩn nội sinh trên các mẫu cây quế thu thập tại tỉnh Hòa Bình, trong đó tỷ lệ
xạ khuẩn từ thân, rễ, lá chiếm lần lượt là 66,7%; 24,3%; 9,0%. Kiểm tra khả
năng kháng VSV gây bệnh cho thấy 16 chủng thể hiện hoạt tính ức chế ít nhất
một loại VSV kiểm định [4].


16
2.3. Khả năng sinh các chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline
Trong quá trình nội sinh với cây chủ, thực vật nội sinh không chỉ sinh
ra các chất chuyển hóa sinh học có khả năng kháng khuẩn mà còn sản xuất ra
các hợp chất chống ung thư. Gần đây, các nhà khoa học đã chú ý hơn đến
việc nghiên cứu các hợp chất sinh học mới từ xạ khuẩn nội sinh có khả năng
chống ung thư và đã thu hoạch được kết quả rất tốt. Các chất chuyển hóa thứ
cấp mang hoạt tính kháng ung thư sản xuất từ xạ khuẩn nội sinh cản trở sự

nhân lên, làm giảm hoặc phát triển tế bào ung thư.
Theo một số nghiên cứu cho thấy có rất nhiều nhóm kháng sinh có khả
năng điều trị ung thư như anthracycline, actinomycin và bleomycin. Trong
đó, anthracycline được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư như ung thư
máu, ung thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư bàng
quang [24]. Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo hóa học, các
anthracycline thay đổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu
da cam ở pH acid và màu tím khi ở pH kiềm. Đặc tính này được dùng để sàng
lọc sơ bộ các chủng sinh anthracycline trong số các chủng xạ khuẩn phân lập
được. Nhóm chất kháng ung thư này cho đến nay được ghi nhận gồm
daunorubicin (DNR), doxorubicin (DOX1), epirubicin (EPI) và idarumycin
(IDA). Daunorubicin và idarumycin gắn vào các cặp base do đó kìm hãm tổng
hợp RNA và DNA. Mithramycin và chromomycin A3 (là các actinomycin), kìm
hãm tổng hợp RNA phụ thuộc DNA. Bleomycin tương tác và làm đứt gãy DNA.


17

Hình 2.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm
anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA
Sự khác nhau về cấu trúc của DOX và DNR là chuỗi của DOX kết thúc
ở gốc alcohol, còn DNR kết thúc ở gốc methyl. Chính sự khác biệt này tạo
nên sự khác biệt trong phổ điều trị ung thư của hai hợp chất này. DOX có tác
dụng trong điều trị ung thư vú, hình thành các khối u. Trong đó, DNR lại có
tác dụng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính. Tuy nhiên, cả DOX và DNR
đều gây tác dụng phụ như gây đau cơ tim mãn tính hay suy tim [25].
Trước những nhược điểm của DNR và DOX cùng với nhu cầu trong
việc tìm kiếm chất kháng ung thư, các nhà khoa học đã biến đổi cấu trúc hóa
học của 2 hợp chất trên, thu được EPI và IDA. EPI là doxorubicin được
epime hóa tại vị trí C-4 hydroxyl trên phân tử đường, được sử dụng nhiều

trong điều trị ung thư dạ dày, ung thư vú,... IDA là dẫn xuất của
daunorubicin, bị khuyết thiếu nhóm methoxyl tại vị trí C-4 dẫn đến làm tăng
khả năng hòa tan trong chất béo, dung môi cũng như ức chế tế bào ung thư.