Thiết kế vector TET – ON điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi aedes aegypti

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

NGUYỄN MINH THÀNH
Tên đề tài:
THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG
GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

NGUYỄN MINH THÀNH
Tên đề tài:
THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG
GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Lớp

:

K44 - CNSH

Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn:1. TS. Nguyễn Văn Hạnh
Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. ThS. Vi Đại Lâm
Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo,
bạn bè và người thân.
Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường
Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm, tập thể cán bộ Phòng Công nghệ phôi – Viện

Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
cùng toàn thể các thầy, cô giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ
năng quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học
Nông lâm Thái Nguyên.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS. Nguyễn Văn Hạnh – Phòng Công
nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học, ThS. Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn trực tiếp đề tài, các thầy đã
tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề
tài này.
Tôi xin được cảm ơn nghiên cứu sinh Đỗ Trung Kiên, cùng các anh,
chị và các bạn sinh viên tham gia nghiên cứu tại – Phòng Công nghệ phôi –
Viện Công nghệ Sinh học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, thầy cô, bạn bè đã
ủng hộ về mặt vật chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Minh Thành


ii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ARN

Acid ribonucleic – Một trong hại loại acid nucleic

CTAB

Cetyltrimethyl Amonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic Acid – Một trong 2 loại nucleic acid

DOX

Doxycycline

dsRNA
E.coli
LB
MLPA

Double strand RNA – RNA sợi đôi
Escherichia coli
Lauria Broth
Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification
(khuếch đại phụ thuộc mẫu dò)
Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi tổng hợp

PCR

chuỗi polymer (Phản ứng khuếch đại DNA trong ống
nghiệm)

µl
PCMV IE

PTGS
TeT-on

Microlit ( 1 µl = 10-3 ml)
Promoter encephalomyocarditis virus internal ribosome
entry site
Posttranscriptional gene silencing ( làm bất hoạt gene sau
phiên mã)
Vector pTet – DualON

TRE

Tetracycline -responsive

RNAi

RNA interference

SiRNA

Small interfeing RNA

RISC
IRES2
RNP

RNA-induced silencing complex ( phức hợp làm câm lặng
do RNA)
Internal ribosome entry site 2
Ribonucleoprotein

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1:Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài ..................................... 19
Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-1.............................................. 24
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng cắt PJET1.2-2 ............................................. 24
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 26
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 27
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 27
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 28
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 29
Bảng 3.9: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 29
Bảng 3.10: Thành phần phản ứng cắt.............................................................. 30
Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối ............................................................. 31


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của vector Tet- On ............................................................ 10
Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của vector Tet-On .............................................. 12
Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI [7].................................................. 13
Hình 3.1: Cấu trúc vector pJET1.2 ................................................................. 20
Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau khi được cắt bởi 2 enzyme HinIII và
Acc65I ............................................................................................................. 32
Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau khi được cắt bởi 2 enzyme HindIII
và Acc65I ........................................................................................................ 33

Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene 1 .................................................. 34
Hình 4.4: Kết quả so sánh với đoạn gene tra-2 ............................................... 34
Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 và đoạn DNA 2 trước khi nối T4 ....... 35
Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi được cắt bởi 2 enzyme 2)
BamHI và HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn 2 sau khi nối (Đường chạy 1 và 36
Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi được cắt bởi 2 enzyme
BamHI và HinIII sau khi được tinh sạch (đường chạy 1 và 2) ....................... 37
Hình 4.8: Kết quả vector pTRE – Tight – BI được tạo rỗng bằng 2 enzyme
BamHI và HindIII ........................................................................................... 38
Hình 4.9: Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight –
BI được cắt bởi 2 enzyme BamHI và HinIII (đường chạy số 2) .................... 39
Hình 4.10: Kết quả cắt vector pTet – DualON bằng 2 enzyme NsiI và XhoI
(Đường chạy số 1 và 2) ................................................................................... 40


v

MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................... 3
1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 3
1.2.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 4
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 4
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 4
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 5
2.1. Cơ sở khoa học ........................................................................................... 5
2.1.1 Muỗi biến đổi gene................................................................................... 5

2.1.2. Công nghệ RNAi ..................................................................................... 6
2.1.3. Gene biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti
(Transformer-2 RNAi) ...................................................................................... 8
2.1.4. Vector Tet – On ..................................................................................... 10
2.1.5. Vector pTRE-Tight-BI .......................................................................... 13
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước ..................................... 15
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................... 16
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 17
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 17
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 17
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 17
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 17


vi

3.2.2. Thời gian tiến hành ............................................................................... 17
3.3. Hóa chất, thiết bị và vật liệu .................................................................... 17
3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 17
3.3.2. Thiết bị .................................................................................................. 19
3.3.3. Dụng cụ ................................................................................................. 19
3.3.4. Vật liệu .................................................................................................. 20
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 20
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 21
3.5.1. Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính trên muỗi Aedes
aegypti ............................................................................................................. 21
3.5.2. Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào
vector pTRE – Tight – BI ............................................................................................ 26

3.5.3. Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh............................................................ 29
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 32
4.1. Kết quả tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi
Aedes aegypti .................................................................................................. 32
4.1.1. Kết quả tạo đoạn DNA 2 từ vector pJET1.2-2...................................... 32
4.1.2. Kết quả tạo vector pJET1.2-1 rỗng ....................................................... 33
4.2. Kết quả chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới
tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector ........................................................ 35
4.2.1. Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau khi nối
đoạn DNA 2 .................................................................................................... 35
4.2.2. Kết quả vector pTRE – Tight – BI được nhân với số lượng lớn, cắt bằng
enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi quy
định tính trạng giới tính ................................................................................... 37
4.2.3. Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính trên muỗi
Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI ................................................. 38


vii

4.3. Kết quả tạo vector Tet – on hoàn chỉnh .............................................................. 40
4.3.1. Kết quả vector pTet – DualON được nhân với số lượng lớn, cắt bằng
enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi........................................................ 40
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 42
5.1. Kết luận .................................................................................................... 42
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Theo tổ chức y tế thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng
2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt
vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue). Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh do
muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes
aegypti phải điều trị, trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do
muỗi Aedes aegypti là 5%. Bệnh lây lan trên 100 nước khu vực có khí hậu
nhiệt đới, cận nhiệt đới. Châu Mỹ cao nhất là 42 nước, châu Phi 20 nước, khu
vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đông Nam Á 7 nước và Địa Trung Hải 4
nước [1].
Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành. Từ những
năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển với số mắc bệnh
và chết ngày một tăng. Bệnh chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở
Việt Nam, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và
tình trạng quá tải cho các bệnh viện trong mùa dịch [4], [5]. Dịch bệnh không
có chu kì rõ rệt, giữa các đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch vẫn xảy ra rải rác.
Để giải quyết vấn đề trên nhiều hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp
dụng. Các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra muỗi
biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. Những con muỗi biến đổi gene sẽ
được thả ra ngoài môi trường và giao phối với muỗi cái tạo ra thế hệ muỗi con
bị khuyếm khuyết và chết trước khi trưởng thành. Các nhà khoa học Mỹ tại
Đại học Rocckefeller đã nghiên cứu đã biến đổi gene muỗi, vô hiệu hóa sự
nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không có khả năng
tìm kiếm mục tiêu để hút máu. Nhóm nghiên cứu cho rằng muỗi có cơ quan
thụ cảm khứu giác gọi là orco, được xem là bộ phận cần thiết để phối hợp với


2

protein đặc biệt liên quan đến việc hình thành cơ chế ngửi mùi. Khi orco bị
biến đổi cơ quan thụ cảm mất cân bằng khiến chúng không phân biệt được
mùi người với động vật có máu nóng khác, đáng lưu ý là hai loại muỗi truyền
bệnh sốt xuất huyết ở người là Anopheles gambiae và Aedes aegypti rất thích
mùi của con người, kết quả biến đổi orco khiến muỗi bị mất cân bằng nghiêm
trọng trong việc phân biệt mùi người và mùi khác. Đáng lưu ý là muỗi đã bị
biến đổi orco càng không phân biệt được mùi trong môi trường không có khí
carbonic (CO2) [16] [22]. Trong nghiên cứu này nhà khoa học Mỹ tại Đại học
Rocckefeller mới chỉ dừng lại ở vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng
đối với người, khiến chúng không tìm kiếm người để hút máu chứ chưa làm
giảm hoặc tiêu diệt toàn bộ quần thể muỗi Aedes aegypti.
Hiện nay có một số nghiên cứu về vector điều khiển tính trạng giới tính
trong đó có vector Tet – On được các nhà khoa học sử dụng để điều khiển tính
trạng giới tính của quần thể sinh vật ví dụ như ruồi giấm [10] [15].
Đến nay, vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu và vắc xin phòng bệnh
sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue cũng như bệnh do virus Zika, nên việc
phòng chống bệnh chủ yếu dựa vào việc phòng và diệt muỗi truyền bệnh. Vai
trò và khả năng truyền bệnh của một số loài muỗi thuộc giống Aedes mà chủ
yếu là Aedes aegypti đã được biết từ lâu, song mỗi vùng, mỗi địa phương với
những phong tục tập quán và hoạt động của người dân, nhất là điều kiện sống
khác nhau ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng truyền bệnh [3]. Hiện nay đã
có một số công trình nghiên cứu nhằm giảm sự truyền nhiễm của muỗi và
sinh sản của chúng trên thế giới như các phương pháp sử dụng tia X tia
gamma để dời một đoạn nhiễm sắc thể hay phương pháp đưa DNA ngoại lai
vào côn trùng tạo côn trùng biến đổi gene [9]. Nhưng các biện pháp này chỉ
giảm thiểu phần nào quần thể muỗi bằng cách tác động vào hệ gene của
chúng. Cụ thể hơn là tác động vào hệ gene giới tính của nó. Một khi chúng ta

3

điều khiển được hệ gene giới tính của muỗi, chúng ta có thể tạo ra được một
quần thể mới toàn cá thể muỗi đực hoặc toàn cá thể muỗi cái. Từ đó chúng ta
có thể ứng dụng trong việc tạo ra các dòng muỗi triệt sản hoặc mang các gene
giới tính có khả năng ức chế, gây chết tế bào trứng của muỗi cái trong quần
thể tự nhiên.
Xuất phát từ mục tiêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Thiết kế vector TET – ON điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi
Aedes aegypti”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
* Mục tiêu lâu dài của đề tài
Tạo được vector TET – ON có khả năng điều khiển tính trạng giới
tính trên muỗi Aedes aegypti.
* Mục tiêu trƣớc mắt
Mục tiêu cần đạt trong khuôn khổ thời gian thực hiện khóa luận là
nắm được mục đích, ý nghĩa của việc nghiên cứu điều khiển tính trạng ở côn
trùng và thực hiện các thí nghiệm để nắm được các phương pháp để tạo vector
định hướng điều khiển giới tính.
- Tạo đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi
Aedes aegypti thông qua vector pJET1.2-1 và pJET1.2-2.
- Bước đầu gắn lõi Tra-2 RNAi vào vector pTRE-Tight-BI để chuẩn bị
gắn vào vector đích Tet-On.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
Có thông tin về khả năng tạo được vector TET – ON có khả năng
hoạt động định hướng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti.


4

1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Điều khiển chủ động tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti, tạo
tiền đề cho các nghiên cứu về sự biểu hiện tính trạng trên muỗi Aedes aegypti.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới giúp
tiêu diệt hoặc làm giảm số lượng quần thể muỗi Aedes aegypti trong tự nhiên


5

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1 Muỗi biến đổi gene
Thành công ban đầu từ những cuộc thử nghiệm trên muỗi biến đổi
gene đã đặt ra kì vọng biến chúng thành phương pháp tiêu diệt hoặc làm giảm
tác hại của loài muỗi gây bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất châu Á và châu
Mỹ La Tinh hiện nay. Sự lạc quan dường như cũng thể hiện rõ ở nhiều nhà
khoa học, nhưng sự thành công chưa trọn vẹn của phương án này cũng đặt ra
không ít lo ngại. Muỗi chuyển gene được bổ sung hai đặc điểm mới so với
loại muỗi thường là chúng chứa gene phát huỳnh quang và gene gây chết có
điều kiện (còn gọi là gene làm giảm sức đề kháng). Đặc điểm phát huỳnh
quang hoạt động như một dấu hiệu để nhận diện muỗi biến đổi gene trong khi
gene gây chết sẽ làm muỗi và các ấu trùng chết trong những điều kiện nhất
định. Khi muỗi biến đổi gene đực giao phối với muỗi cái trong tự nhiên, gene
gây chết sẽ được truyền lại cho thế hệ con cháu và các ấu trùng, kết quả là
chúng sẽ chết trong điều kiện thiếu vắng kháng sinh tetracycline [9].
Sở dĩ “công nghệ” muỗi chuyển gene nhận được nhiều sự đồng tình là

do việc sử dụng loại muỗi này - theo đánh giá của những người ủng hộ quan
điểm muỗi chuyển gene - là an toàn và thân thiện hơn nhiều so với việc dùng
hóa chất. Các nhà khoa học thậm chí còn dự tính sẽ tạo ra hàng loạt các thế hệ
côn trùng, ong, sâu, ruồi mang “thương hiệu” biến đổi gene, nhằm chống lại
những căn bệnh có tính chất đại dịch vốn lây lan qua côn trùng, đồng thời tạo
điều kiện cho việc tăng năng suất cây trồng và các sản phẩm nông nghiệp,
giúp ổn định an ninh lương thực. Muỗi chuyển gene được kì vọng là phương
án sẽ tạo nên bước đột phá trong ngành y học và nông nghiệp [20]. Thời gian


6

gần đây có nhiều báo cáo cho rằng có thể tạo ra muỗi chuyển gene nhờ công
nghệ tiên tiến mới, là công nghệ RNAi.
2.1.2. Công nghệ RNAi
2.1.2.1. Đặc điểm công nghệ RNAi
Công nghệ RNAi có tính đặc thù cao, đầy sức mạnh và hiệu quả, chỉ
cần một lượng nhỏ phân tử ARN sợi kép (dsRNA) trong một tế bào là đủ để
gây bất hoạt gene. Rất nhạy cảm (phản ứng nhanh và mạnh đối với các RNA
xâm nhiễm như virus), có thể làm bất hoạt gene ở các giai đoạn phát triển
khác nhau của cá thể ở mức độ nhất định có thể truyền từ thế hệ này sang thế
hệ khác, từ mô này sang mô khác như kiểu “di căn” [2] [6].
2.1.2.2. Vai trò của công nghệ RNAi
RNAi có khả năng hoạt động như một chất xúc tác (catalyst) và các
enzyme có bản chất RNA được gọi là ribozyme. Quan điểm trước đó cho rằng
RNAi chỉ đóng vai trò trung gian giữa DNA và protein. Các nghiên cứu sau
đó cho thấy RNA có thể tự xúc tác để tự sao chép và tổng hợp các phân tử
RNA khác. Hiện nay các nhà khoa học đã khẳng định rằng ribosomal RNA
xúc tác tạo liên kết peptide giữa các amino acid trong quá trình dịch mã, phát
hiện sau đó còn cho thấy RNA không chỉ như chất xúc tác, mà còn đóng vai

trò quan trọng hơn nữa trong biểu hiện gene.
Một số lượng lớn các phân tử RNA nhỏ không đóng vai trò như mã di
truyền mà liên kết với protein để tạo ra phức hợp ribonucleoprotein (RNP).
Các ribonucleoprotein (RNP) ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình phiên mã
(transcription), dịch mã (translation), nhân bản DNA và cấu trúc nhiễm sắc
thể (ví dụ gây xoắn sợi nhiễm sắc thể). Trong những năm đầu của thập kỷ
1980, người ta đã phát hiện thấy các phân tử nhỏ (dài khoảng 100 nucleotide)
trong vi khuẩn Escherichia coli có thể bám vào trình tự tương đồng trong


7

mRNA và ức chế phiên mã. Một loạt các nghiên cứu về RNAi được công bố và
đã chỉ ra rằng ARNi có thể là chiến lược để chống lại virus [2].
Sự bất hoạt gene có thể xảy ra ở mức độ phiên mã và sau phiên mã. Kết
quả nghiên cứu vào những năm 1990 cho thấy một gene biến nạp (gene chuyển)
vào hệ gene có thể kìm hãm biểu hiện gene tương tự của nó trong cây [2].
Ứng dụng RNAi có giá trị cả trong nuôi cấy tế bào và trong các sinh
vật sống, vì tổng hợp RNA mạch kép đưa vào tế bào chọn lọc, có thể gây ức
chế gene cụ thể cần quan tâm. RNAi có thể được sử dụng cho các mô hình có
quy mô lớn có thể giúp xác định các thành phần cần thiết cho một quá trình tế
bào cụ thể hoặc một sự kiện như phân chia tế bào. RNAi cũng được sử dụng như
một công cụ thiết thực trong công nghệ sinh học, y học và thuốc trừ sâu [2].
2.1.2.3. Cơ chế hoạt động của RNAi
Ngay sau khi khám phá ra RNAi thì người ta đã biết được rằng quá
trình làm bất hoạt gene sau phiên mã (PTGS) ở thực vật có liên quan tới một
quần thể các RNAs có kích thước nhỏ (dài khoảng 25 nucleotide) và người ta
cũng biết rằng những RNA này chứa cả trình tự RNA sense và trình tự
antisense (trình tự có nghĩa và trình tự đối nghĩa). Người ta đã giả định rằng
loại RNA này là yếu tố quyết định của quá trình PTGS. Sau khi khám phá ra

các RNAi ở tế bào động vật người ta đã biết rằng RNA ở dạng sợi đôi cũng có
khả năng bắt đầu quá trình PTGS ở thực vật [6].
Sinh hóa của quá trình RNAi được làm sáng tỏ trong một hệ thống in
vitro thí nghiệm trên các phôi của ruồi Drosophila, cũng có thể nói rằng
dsRNA (RNA dạng sợi đôi) được xử lý thành những đoạn dsRNA dài từ 2123 nucleotide những đoạn này có sự tương đồng khá cao với các dữ liệu về
quá trình PTGS ở thực vật người ta đã giả đỉnh rằng những dsRNA này và
siRNA (small interfering RNA) có vai trò định hướng trong sự phân cắt phân
tử mRNA. Ở điều kiện in vivo, Fire and Mello đã cho rằng các dsRNA dài bị


8

cắt thành các RNA nhỏ dài khoảng 25 nucleotide, các RNA antisense gây ra
quá trình phân hủy của mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA. Như vậy,
các dsRNA đã được kết hợp với những yếu tố ảnh hưởng có khối lượng phân
tử thấp [6].
Cơ chế phân tử có liên quan trong quá trình RNAi đã được chỉ ra.
Trong một hệ thống in vitro được xây dựng trên các tế bào Drosophila được
nuôi cấy, đã chỉ ra rằng có một phức hợp lớn gọi là RISC (RNA-induced
silencing complex) nhắm tới phân tử mRNA thông qua một đoạn RNA
antisense ngắn, phân tử mRNA bị nhắm tới, bị phân cắt rồi bị phân hủy. Phức
hợp RISC chứa ít nhất một thành viên trong họ “protein argonaute”, họ
protein này hoạt động như một endonuclease và các phân tử mRNA bị cắt từ
các trình tự ở bên trong chuỗi (có thể gọi là chức năng làm “câm”). Người ta
cũng đã chỉ ra rằng một nuclease giống như là một ribo nuclease III gọi là
Dicer có liên quan tới quá trình xử lý các RNA thành các RNA ngắn. Trong
các hệ thống nhất định hoặc là các thực vật cụ thể các loại giun hoặc các loại
nấm phát hiện một RNA (lệ thuộc vào RNA polymerase (RdRP)) đóng vai trò
quan trọng trong quá trình tạo thành hoặc khuếch đại siRNA [6].
Vì thế chỉ trong một vài năm một tập hợp lớn các thông tin về các

protein hoặc các phức protein chuyên biệt có liên quan tới quá trình RNAi và
các thông tin ở mức phân tử tại các bước của quá trình này được xây dựng.
Nó là bằng chứng cho một sự khởi đẩu của những phát hiện đáng kể về quá
trình RNAi [6].
2.1.3. Gene biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti
(Transformer-2 RNAi)
Gene Transformer-2 (Tra-2) là gene tác động đến giới tính của loài
côn trùng nói chung và loài muỗi nói riêng. Tra-2 tác động vào tế bào soma
và sự sinh tinh trong tế bào của con mầm đực. Tra-2 là một trong số ít gene


9

quy định giới tính ở ruồi giấm Drosophila melanogaster, chức năng của Tra-2
là cần thiết trong tế bào soma của con cái nơi mà chúng hoạt động cùng với
gene transformer (tra) cần thiết cho việc biểu hiện gene doublesex (dsx) hoạt
động cùng với gene transformer ở trong cái con đường biệt hóa tạo ra con cái.
Việc thiếu hụt chức năng của Tra-2 hoặc transformer dẫn đến một số thay đổi
trong việc biểu hiện chuyên hóa giới tính đực của gene dsx. Nó dẫn đến sự
biến đổi giới tính của con cái thành những con đực không có khả năng sinh
sản vì thế gọi là “con đực giả”. Những đột biến “null” ở tra hoặc tra-2 không ảnh
hưởng đến quá trình biệt hóa giới tính ở các tế bào soma của con đực (XY). Quá
trình biểu hiện chuyên hóa giới tính đực của gene dsx là điển hình ở những con
đực ở dạng hoang dại “wild type” không biểu hiện protein tra [15].
Việc điều hòa của gene dsx xảy ra ở mức độ “chế biến” RNA. Sản
phẩm phiên mã của gene dsx ở con đực và con cái là giống nhau trong 3 exon
đầu tiên nhưng khác nhau ở hầu hết các exon ở đầu 3’. Nhưng sản phẩm
phiên mã khác nhau của gene dsx chuyên hóa cho việc xác định giới tính mã
hóa cho các protein mà có đầu N giống nhau, nhưng có đầu C khác nhau. Ở
những con cái thì các protein mã hóa bởi gene Tra hoặc Tra-2 có liên quan

trực tiếp tới quá trình cắt nối phân tử tiền mRNA của dsx và tạo ra một phân
tử mRNA dsx trưởng thành chuyên hóa cho giới tính cái [15].
Gene Tra-2 ở muỗi không giống như gene Tra-2 ở Drosophila,
Ceratitis Capitata and Anastrepha, mà gene Tra-2 ở muỗi có liên quan đến
quá trình biệt hóa giới tính, quá trình hình thành tinh trùng và việc bất hoạt
gene Tra-2 không gây ra được biến đổi con cái thành con đực giống như đã
được biết ở những loài côn trùng thuộc loài Dipteran khác. Bởi vì một ảnh
hưởng nhất thời từ dsRNA không thể kéo dài từ giai đoạn trứng đến giai đoạn
trưởng thành để gây ra một cái ảnh hưởng bất hoạt tới các giai đoạn của quá
trình hình thành tinh trùng và những hậu quả ở thế hệ sau đó, vì vậy tất cả


10

những cố gắng để chuyển các dsRNA nhằm thu được những ảnh hưởng cục
bộ bền vững hơn sẽ là không thể. Để ức chế thành công gene Tra-2 ở muỗi thì
cần phải tạo ra các dòng chuyển gene lâu dài với nhiều cấu trúc Tra-2 RNAi
bằng cách đó những cái tác động can thiệp sẽ được biểu hiện bền vững trong
suốt quá trình hình thành tinh trùng. Việc bất hoạt gene Tra-2 ở muỗi
Culiciane có thể gây chết các tinh trùng có liên quan tới nhiễm sắc thể X từ
con đực và chỉ những tinh trùng có nhận được nhiễm sắc Y của con đực mới
sống sót, và tạo thành thế hệ con non toàn bộ là con đực. Những con đực này
về mặt di truyền có mang nhiễm sắc thể Y, những con đực được tạo thành từ
phương pháp này là không phải là vô sinh nhưng chúng chỉ tạo ra nhũng tinh
trùng mà mang nhiễm sắc thể Y. Về mặt lý thuyết, những con đực non sẽ
trưởng thành liên tục phát tán cấu trúc Tra-2 RNAi vào quần thể tự nhiên cho
đến khi những quần thể này bị tuyệt diệt [9].
2.1.4. Vector Tet – On
Cấu trúc của vector Tet - On
Cấu trúc của vector Tet-On được thể hiện dưới hình 2.1.

Hình 2.1: Cấu trúc của vector Tet- On


11

Vị trí và từng tính năng:
- PCMV IE (Promoter của cytomegalovirus): 7 – 606
- Tet – On Advanced: 634 – 1380
-

IRES2

(vị

trí

tương

tác

với

ribosome

thu

nhận

từ

encephalomyocarditis): 1389–1973
- ZsGreen1 (protein Zoanthus sp protein huỳnh quang màu xanh):
1979-2674
- SV40 dấu hiệu PolyA: 2712-2901
- ColE1 ori (khởi đầu sao chép): 3077-3501
- Ampr (Gene kháng ampicillin; b-lactamase): 3842-4837 (bổ sung)
pTet – DualON đồng biểu hiện chất kích hoạt phiên mã được kiểm
soát bởi tetracycline và protein fluorescent xanh có tên ZsGreen1. Tet – On
Advanced là một tổ hợp của Tet repressor (chất ức chế Tet) và 3 domains lấy
từ protein VP16 của virus herpes có vai trò kích hoạt phiên mã kiểu type “F”.
Gene mã hõa cho Tet – On advanced được tổng hợp hoàn toàn chứa vị trí cắt
nối mARN và sử dụng các bộ ba của người để hỗ trợ cho việc ổn định trên
các tế bào động vật có vú. ZsGreen1 là một biến thể đã được tối ưu hóa bởi
các codon của người có nguồn gốc từ protein fluorescent xanh ZsGreen lấy từ
san hô Zoanthus sp đã được xử lý để cho tín hiệu huỳnh quang phát ra mạnh
hơn (mức kích thích và mức phát xạ tối đa: 493 và 505nm).
Vector đồng biểu hiện ZsGreen1 và Tet-On Advanced từ một sản
phẩm phiên mã mRNA dạng bicistronic (có thể mã hóa cho 2 protein được
biểu hiện độc lập). Quá trình biểu hiện có thể đạt được nhờ sử dụng promoter
(PCMV IE) lấy từ cytomegalovirus. Một vị trí có tên là IRES2 có vai tò tương
tác với ribosome có nguồn gốc từ virus encephalomyocarditis (EMCV), có vị
trí giữa Tet- On Advanced và ZsGreen1 hỗ trợ cho việc dịch mã độc lập
ZsGreen1 từ một vị trí khởi đầu nằm bên trong đoạn nối của IRES2 và


12

ZsGreen1. Điều này đảm bảo rằng biểu hiện ZsGreen1 có tỉ lệ thành công cao
và nó cũng có thể biểu hiện cả Tet- On Advanced, cho phép ZsGreen1 được

sử dụng như một chất chỉ thị cho mức hiệu quả của quá trình chuyển nhiễm
và là một maker cho quá trình chọn lọc bằng flow cytometry. Vector cũng
chứa 1 vị trí khởi đầu sao chép có tên là CoIE1 và một gene kháng sinh
Ampicilin (Ampr), cho phép việc nuôi cấy và chọn lọc vi khuẩn E.coli [7].
Cơ chế hoạt động của vector Tet –On
Cơ chế hoạt động của vector Tet-On được thể hiện trong hình 2.2:

Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của vector Tet-On
Promoter (PCMV) của hệ thống Tet-On khởi đầu quá tình phiên mã của
rTetR và VP16 tổ hợp của hai gene này gọi là rtTA. Khi bổ sung kháng sinh
Doxycyline (DOX) hoặc Tetracycline (Tet) vào môi trường, kháng sinh này
sẽ kết hợp với rtTA làm thay đổi cấu hình không gian của rtTA vào TRE làm
hoạt động của promoter P miniCMV hoạt động khởi đầu quá trình phiên mã gene
đích. Ngược lại môi trường không được bổ sung DOX hoặc Tet thì rtTA
không liên kết vào TRE làm cho promoter P miniCMV bị ức chế, ngăn cản phiên
mã của gene đích
pTet – DualOn được sử dụng để phát triển các dòng tế bào bền vững
mà nó có thể biểu hiện. Các dòng tế bào được sử dụng kết hợp với vector đáp
ứng Tet, ví dụ pTRE – Dual2 để tạo thành hệ thống biểu hiện gene được điều


13

hòa bằng hệ thống cảm ứng nhờ kháng sinh doxycycline, hệ thống này biểu
hiện 1 gene quan tâm dưới sự kiểm soát của yếu tố đáp ứng Tet (TRE). Trong
promoter PTight.
ZsGreen1 là một sản phẩm thương mại của protein fluorescent xanh
phát tín hiệu mạnh nhất. Sự xuất hiện của protein này cho phép chất truyền
nhiễm được quan sát bằng mắt thường dưới kính hiển vi huỳnh quang và
được phân loại bằng kĩ thuật flow cytometry với một tập hợp các màng lọc

tiêu chuẩn FITC (ZSGree1 có mức kích thích tối đa là 493nm và mức phát xạ
tối đa 505nm) [7].
2.1.5. Vector pTRE-Tight-BI
Cấu trúc của vector pTRE-Tight-BI được thể hiện dưới hình 2.3:

Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI [7]
- Ptight Tet-responsive promoter: –70–322
- Tet response element (TREmod): 3–252
- Fragment containing PminCMV-1: 258–317
- Fragment containing PminCMV-2: 2856–2788
- Multiple cloning site I (MCS I): 335–405


14

- Multiple cloning site II (MCS II): 2782–2726
- Fragment containing SV40 polyA signal-1: 417–617
- Fragment containing SV40 polyA signal-2: 2726–2533
- Fragment containing ColE1 origin of replication: 780–1379
- Ampicillin resistance gene (β-lactamase): 2536–1540
pTRE-Tight-BI là một plasmid pTRE-Tihgt hai chiều mà có thể được
sử dụng để cảm ứng biểu hiện hai gene, trong hai gene đó một gene có thể là
gene marker còn gene kia là gene đích quan tâm hoặc cả hai đều là gene quan
tâm. Plasmid này được sử dụng trong hệ thống biểu hiện gene Tet ON/ Tet
OFF và trong các dòng tế bào, hai gene được biểu hiện đồng thời. Hệ thống
biểu hiện Tet vào các dòng tế bào cung cấp những cách tiếp cận có sẵn với hệ
thống biểu hiện được biểu hiện bằng tetracyline.
Vector pTRE-Tight-BI chứa một yếu tố tương tác với Tet đã được xử
lý ( TREmod), chứa bẩy đoạn lặp trực tiếp của một trình tự dài 36bp trong đó
chứa 19bp là trình tự của operator Tet ( TetO). Hai promoters mini CMV

thiếu enhancer (trình tự tăng cường) ở bên cạnh của TREmod, hai promoter
này là thành phần của promoter CMV. Các vị trí nhân dòng I (multiple
cloning sites-MCS I) và MCS II có vị trí ở bên cạnh của promoter PTight tương
tác với Tet. Cả hai gen được chèn vào MCS I và MCS II sẽ tương ứng với các
protein điều hòa tTA và rtTA trong hệ thống Tet-OFF và Tet-ON. Chú ý rằng
đoạn chèn được nhân dòng phải chứa bộ ba mở đầu ATG. Trong nhiều trường
hợp có sự thêm vào của trình tự dẫn đầu Kozak, có thể tăng cường các mức
độ biểu hiện, tuy nhiên nhiều cDNA đã được biểu hiện hiệu quả trong hệ
thống Tet mà không có sự thêm vào của các trình tự Kozak. pTRE-Tight-BI
nên được đồng chuyển nhiễm với marker Linear Hygromycin hoặc marker
Linear Puromycin cho phép lựa chọn những yếu tố chuyển nhiễm ổn định [7].


15

2.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Việc tạo ra muỗi biến đổi gene được tiến hành từ 20 năm trước nhưng
chỉ gần đây phương án sử dụng loại muỗi này mới được các quan chức y tế
ủng hộ. Điển hình là Malaysia, đất nước đầu tiên ở châu Á có kế hoạch thả
thử nghiệm muỗi biến đổi gene vào môi trường, nhằm đối phó với đại dịch sốt
xuất huyết. Viện nghiên cứu y học của quốc gia này đã hoàn tất kế hoạch thả
hàng nghìn muỗi đực biến đổi gene để chúng giao phối với muỗi cái bình
thường, tạo ra loại muỗi có tuổi đời ngắn hơn và không có khả năng truyền bệnh.
Vào năm 2000, các nhà khoa học ở Học viện Hoàng gia Luân Đôn và
Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu lần đầu tiên trên Thế giới đã
thành công trong việc đưa một gene ngoại lai vào genome của muỗi
Anopheles stephensi và đã tạo ra muỗi chuyển gen. Thành tựu này có ý nghĩa
rất lớn, giúp các nhà khoa học đi đến một bước gần hơn để tạo ra muỗi không
truyền bệnh sốt rét.

Vào năm 2002, các nhà nghiên cứu thuộc trường Ðại học Case
Western Reserve (CWRU) ở Cleveland, Ohio, Mỹ đã phát triển một loại muỗi
chuyển gene chống sốt rét ở chuột. Chúng ta biết rằng có nhiều loại muỗi
nhưng duy nhất chỉ có giống Anopheles truyền bệnh sốt rét ở động vật có vú
[18]. Các nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller đã phát minh cách biến
đổi gene muỗi, vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người,
khiến chúng không tìm kiếm người để hút máu [16].
Một số thành tựu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gene. Sau khi tạo
ra muỗi chuyển gene, chiến lược tiếp theo để khắc phục bệnh sốt rét là đưa
dòng muỗi chuyển gene kháng ký sinh trùng sốt rét vào trong tự nhiên.
Phương pháp này phải được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách cẩn
thận để kiểm tra xem muỗi chuyển gene sống như thế nào khi được giải


16

phóng vào các quần thể muỗi không chuyển gene. Kết quả nghiên cứu quần
thể muỗi chuyển gene đầu tiên trong phòng thí nghiệm đã được các nhà khoa
học thuộc Học viện Hoàng gia Luân Đôn công bố vào năm 2003. Các nhà
nghiên cứu đã chuyển gene marker huỳnh quang đỏ hoặc xanh vào 4 dòng
muỗi A. stephensi. Ở các quần thể đối chứng bao gồm toàn muỗi chuyển gen,
marker huỳnh quang đã duy trì một cách nguyên vẹn qua hơn 30 thế hệ.
Nhà khoa học Gareth J Lycett đã nghiên cứu thành công biểu hiện
gene điều kiện trong muỗi sốt rét Anopheles stephensi với hệ thống Tet-on và
hệ thống Tet-off bằng việc bổ sung các DOX [10].
Như vậy hoạt động của muỗi chuyển gene không ảnh hưởng lớn đến
khả năng tồn tại của chúng. Nó còn giúp đánh giá một cách toàn bộ tính khả
thi của việc sử dụng muỗi chuyển gene để chống lại các bệnh tật như sốt rét,
sốt vàng da, sốt xuất huyết, và đóng vai trò là một bộ phận quan trọng trong
các chiến lược phát triển trong tương lai để góp phần ngăn ngừa các bệnh dịch

phổ biến trên thế giới [16] [20].
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Không riêng Malaysia, rất nhiều quốc gia khác, trong đó có Việt Nam
cũng muốn thử nghiệm muỗi chuyển gene. Theo PGS.TS Vũ Sinh Nam, Phó
Cục trưởng Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế, sau thành công trong việc nuôi muỗi
biến đổi gene mang vi khuẩn ruồi giấm Wolbachia, Việt Nam cũng sẽ thử
nghiệm thả chúng tại đảo Trí Nguyên, TP Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa vào
năm 2011[21].
Hiện nay tại nước ta chưa có nghiên cứu nào được công bố về việc sử
dụng vector Tet-on trong việc chuyển gene vào loài muỗi nào để làm ảnh
hưởng đến khả năng kìm hãm hay tiêu diệt loài muỗi đặc biệt là loài muỗi
Aedes aegypti loài muỗi liên quan trực tiếp đến khả năng truyền nhiễm bệnh
sốt xuất huyết, bệnh Zika,..