Tối ưu hóa các điều kiện để tạo vỏ vi khuẩn rỗng bacterial ghost sử dụng tác nhân hóa học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ VĂN TÙNG

Tên đề tài:
TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN TẠO VỎ VI KHUẨN RỖNG
(Bacterial ghost) SỬ DỤNG TÁC NHÂN HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Lớp

:K 44 - CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ VĂN TÙNG

Tên đề tài:
TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN TẠO VỎ VI KHUẨN RỖNG
(Bacterial ghost) SỬ DỤNG TÁC NHÂN HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. PGS.TS Đồng Văn Quyền

Viện Công nghệ Sinh học -Viện Hàn lâm và Khoa học
công nghệ Việt Nam
2.ThS. Bùi Đình Lãm
Khoa CNSH-CNTP, Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Vi sinh
Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh Học-Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ
Việt Nam, ngoài sự nỗ lực của nhóm, em còn nhận đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình
từ quý Thầy Cô của Viện Công Nghệ Sinh Học-Viện Hàn Lâm Khoa Học và
Công Nghệ Việt Nam.
Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn
PGS.TS Đồng Văn Quyền Phó viện trƣởng Viện Công Nghệ Sinh Học,
Trƣởng phòng Vi sinh vật Phân tử đã tạo điều kiện cho em có đƣợc môi
trƣờng tốt nhất để phát huy khả năng của bản thân trong suốt quá trình nghiên
cứu, học tập và trao đổi kiến thức tại phòng, giúp đỡ em tận tình để hoàn
thành tốt đề tài tốt nghiệp này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Minh Hƣờng cùng các
anh chị đang làm việc và nghiên cứu tại phòng Vi sinh vật Phân tử đã tận tình
truyền đạt kiến thức, cùng các kĩ năng và thao tác trong suốt quá trình nghiên
cứu tại phòng. Để từ đó em có một nền tảng kiến thức và kĩ năng thao tác
hoàn thiện, vững chắc hơn giúp em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Đình Lãm đã hƣớng dẫn và tạo
điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ, Anh Chị Em trong
gia đình và họ hàng, bạn bè đã động viên giúp cho em có tinh thần để hoàn

thành tốt qua trình nghiên cứu vừa qua,
Xin Chân Thành Cảm Ơn!
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2016

SINH VIÊN THỰC HIỆN
Đỗ Văn Tùng


ii

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1:

Các tác nhân hóa học sử dụng trong đề tài. ................................ 27

Bảng 2:

Các công thức thí nghiệm nghiên cứu tối ƣu quy trình tạo vỏ
rỗng ............................................................................................. 32

Bảng 3:

Ảnh hƣởng của nồng độ tế bào đƣợc pha loãng sử dụng trong
các thí nghiệm đến kết quả của các quy trình tạo vỏ rỗng tế
bào vi khuẩn................................................................................ 33

Bảng 4:

Hình ảnh tế bào vỏ rỗng vi khuẩn tạo ra dƣới các điều kiện

nhiệt độ khác nhau soi dƣới kinh hiển vi quang học độ phóng
đại 100X. .................................................................................... 35

Bảng 5:

Ảnh hƣởng của thời gian ủ tới sự bất hoạt vỏ tế bào vi khuẩn
rỗng. ............................................................................................ 37

Bảng 6:

Ảnh hƣởng của nồng độ tác nhân NaOH đến hình thái ............. 38


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Hình thái các loại vi khuẩn [3] .......................................................... 6
Hình 2: Cấu tạo tế bào vi khuẩn [3] ................................................................ 7
Hình 3: Vi khuẩn Salmonella........................................................................ 12
Hình 4: Quá trình phân giải tế bào vi khuẩn tạo vỏ tế bào rỗng................... 20
Hình 5:

Kết quả kính hiển vi điện tử quét cho thấy cấu trúc vỏ tế bào vi
khuẩn rỗng tạo ra bằng phƣơng pháp “Sponge-like”. ..................... 23

Hình 6: Hình ảnh tế bào vỏ rỗng vi khuẩn và biểu đồ thể hiện quá trình
gây đáp ứng miễn dịch bằng vỏ tế bào rỗng vi khuẩn theo các
cách tác động khác nhau Vinod và cs năm 2014. ............................ 24
Hình 7: Ảnh hiển vi quang học. .................................................................... 36

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
VSV

: Vi sinh vật

DNA

: Deoxyribonucleic acid

RNA

: Ribonucleic acid

Cs

: Cộng sự

PBS

: Dung dịch đệm

SDS

: Sodium dodecyl sulfate

LPS

: Lipopolysaccharide

BGs

: Bacterial ghost

đvC

: Đơn vị cacbon


v

MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề. ...........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài. ............................................................................2
1.2.1. Mục tiêu của đề tài. ...........................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu của đề tài. ............................................................................................2
1.3. Ý nghĩa của đề tài. ................................................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4
2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn. .............................................................................4
2.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo. ..........................................................................4
2.1.1.1. Hình thái vi khuẩn. .........................................................................................4
2.1.1.2. Cấu tạo tế bào vi khuẩn. .................................................................................7
2.1.2. Phân loại vi khuẩn. ..........................................................................................10
2.2. Giới thiệu chung về chi Salmonella. ..................................................................11
2.2.1. Nguồn gốc của vi khuẩn Salmonella...............................................................11
2.2.2. Đặc điểm hình thái và phân loại......................................................................12
2.2.2.1. Hình thái và cấu trúc của vi khuẩn Salmonella. ...........................................12

2.2.2.2. Phân loại vi khuẩn Salmonella. ....................................................................14
2.3. Khả năng và cơ chế gây bệnh.............................................................................16
2.4. Tình trạng kháng kháng sinh của chủng Salmonella gây bệnh. .........................18
2.5. Giới thiệu về vỏ vi khuẩn rỗng (bacterial ghost). ..............................................19
2.6. Vai trò của vi khuẩn rỗng. ..................................................................................21
2.6.1. Giá trị về y học. ...............................................................................................21
2.6.2. Giá trị về kinh tế. .............................................................................................22
2.7. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và thế giới. ....................................................22
2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. .................................................................22
2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. ...................................................................25
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........26
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu. .....................................................................26


vi
3.1.1. Đối tƣớng nghiên cứu......................................................................................26
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu. ........................................................................................26
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu. .....................................................26
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất. ............................................................................26
3.4. Nội dung nghiên cứu. .........................................................................................27
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................27
3.5.1. chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn. .........................................................27
3.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................27
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................31
4.1. Kết quả ...............................................................................................................31
4.1.1. Xác định nồng độ tế bào thích hợp nhất trong quy trình tạo vỏ rỗng tế bào vi
khuẩn..........................................................................................................................32
4.1.2. Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến quy trình tạo vỏ tế bào vi
khuẩn rỗng. ................................................................................................................35
4.1.3. Đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ các tác nhân NaOH đến hình thái và hiệu

suất tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn................................................................................37
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................40
5.1. Kết luận. .............................................................................................................40
5.2. Kiến nghị. ...........................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................41
I.Tài liệu tiếng việt. ...................................................................................................41
II. Tài liệu tiếng anh. .................................................................................................41
III. Tài liệu internet ...................................................................................................44


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Ở Việt Nam hiện nay đang trong thời kì phát triển kinh tế, các hoạt
động kinh tế và sản xuất làm thay đổi môi trƣờng một cách nhanh chóng,
cùng với đó là điều kiện khí hậu nóng ẩm nhiệt đới. Điều này đã dẫn đến sự
xuất hiện nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm gây thiệt hại về kinh tế
cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời nhƣ : vi khuẩn tả lợn (Vibrio cholera), vi khuẩn
gây bệnh viêm phổi lợn, vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa(Salmonella, E.
coli)… Trong khi đó, việc sử dụng lạm dụng các chất kháng sinh dẫn đến tình
trạng gia tăng các chủng kháng thuốc trong quần thể. Các nghiên cứu gần đây
cho thấy tỷ lệ cao các chủng E. coli và Salmonella đa kháng đƣợc phát hiện
trong các nguồn thức ăn ở Việt Nam [13] [21] [19]. Đây là một trong những
nguyên nhân dẫn đến việc bùng phát dịch bệnh ngộ độc thức phẩm hằng năm
ở nƣớc ta. Trƣớc tình hình trên, nhu cầu sử dụng vaccine ở nƣớc ta là rất lớn.
Tuy nhiên, số lƣợng vaccine đƣợc sản xuất ở nƣớc ta còn hạn chế. Vaccine
sản xuất ở Việt Nam chủ yếu là vaccine vi sinh vật bất hoạt. Tuy nhiên số
lƣợng sản xuất không đủ để đáp ứng khi dịch bệnh bùng phát. Các nghiên cứu
cần đƣợc thực hiện để tìm ra các phƣơng pháp chế tạo vaccine mới với thời

gian sản xuất ngắn và độ an toàn cao, nhằm giải quyết tình trạng dịch bệnh ở
nƣớc ta.
Vỏ tế bào vi khuẩn rỗng là một bƣớc tiến mới về khoa học, cũng nhƣ
trong y học động vật. Vỏ tế bào khuẩn rỗng có thể đƣợc dùng để chế tạo ra
một loại vaccine mới với nhiều ƣu điểm hơn, việc tạo ra vỏ vi khuẩn rỗng và
đóng gói nó tƣơng đối đơn giản [26]. Đặc biệt nữa là loại vaccine đƣợc chế
tạo từ vỏ vi khuẩn rỗng không cần bảo quản ở kho lạnh nên giảm đƣợc chi phí


2
vận chuyển và sử dụng, do chúng có thể tiến hành đông cô và bảo quản ở
nhiệt độ bình thƣờng [11]. Giúp tiết kiệm chi phí và thời gian cho ngƣời sử
dụng. Cách thức tạo vi khuẩn rỗng hiện nay chủ yếu là sử dụng các kĩ thuật
chuyển gen và kĩ thuật di truyền. Phƣơng pháp này hiệu quả nhƣng có thể
chứa nhiều nguy cơ tạo ra các chủng siêu vi khuẩn hay các loại vi khuẩn mới
khó kiểm soát.
Do đó, dƣới sự phát triển của khoa học kĩ thuật cũng nhƣ kinh nghiệm
từ nghiên cứu của một số tác giả, đã nghiên cứu các phƣơng pháp hóa học để
sản xuất vỏ tế bào vi khuẩn rỗng. Nguyên lý của phƣơng pháp dựa trên khả
năng phá vỡ thành tế bào vi khuẩn của một số chất hóa học ở nồng độ xác
định. Năm 2003, Amara và cs đã thành công sản xuất vỏ tế bào vi khuẩn rỗng
từ vi khuẩn E .coli ở pha cân bằng [6] qua đây ta có thể “Tối ƣu hóa các điều
kiện để tạo vỏ vi khuẩn rỗng (Bacterial ghost) sử dụng tác nhân hóa học”
phƣơng pháp này có thể là hƣớng phát triển đúng đắn và tránh đƣợc các nguy
cơ rủi ro. Việc hoàn thiện quy trình và nắm bắt đƣợc phƣơng pháp tái tạo
này, sẽ mở ra bƣớc tiến lớn về sinh học cũng nhƣ trong y học động vật, y học
của ngƣời.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài.
1.2.1. Mục tiêu của đề tài.
Lựa chọn các tác nhân hóa học cho hiệu suất tạo vỏ tế bào vi khuẩn

rỗng cao nhất và tối ƣu hóa quy trình tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng. Đối tƣợng
vi khuẩn đƣợc lựa chọn trong đề tài này là một chủng Salmonella spp. thuộc
nhóm vi khuẩn Gram âm, một trong những nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu
ở nƣớc ta.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài.
- Tìm ra nồng độ vi khuẩn cho số lƣợng vỏ tốt nhất và nhiều nhất.
- Độ sống sót của vi khuẩn rỗng sau quá trình tạo thành bị bất hoạt 100%.
- Hình thái vỏ rỗng không bị vỡ nát, nguyên vẹn và có độ rỗng cao nhất có thể.


3
1.3. Ý nghĩa của đề tài.
- Ý nghĩa trong khoa học:
+ Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của một số tác
nhân hóa học đến khả năng tạo vỏ vi khuẩn rỗng trên một chủng vi khuẩn
Salmonella spp.
+ Dần tối ƣu các điều kiện để hoàn thiện quy trình tạo vỏ rỗng vi
khuẩn sử dụng tác nhân hóa học.
+ Cung cấp tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh
viên hoàn thiện cả về kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn.
- Ý nghĩa trong thực tiễn:
+ Tái tạo thành công vỏ vi khuẩn rỗng từ một số loại vi khuẩn gây
bệnh, từ đó cung cấp nguồn nguyên liệu để chế tạo vaccine dùng trong y học
thú y và sau đó là trên ngƣời.
+ Có thể tạo ra một dòng vaccine thế hệ mới với nhiều đặc tính ƣu việt
hơn nhƣ sản xuất nhanh, hiệu lực cao và tiết kiệm chi phí, trƣớc tình hình phát
triển của các loại bệnh đang tăng cao.
+ Có thế chế dùng vỏ tế bào vi khuẩn rỗng để chế tạo thành chất mang
thuốc, hay thuốc dẫn.

4
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn.
2.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo.
2.1.1.1. Hình thái vi khuẩn.
- Vi khuẩn (bacteria) là những VSV đơn bào, không có màng nhân
(prokaryote), chúng có cấu trúc và hoạt động đơn giản hơn nhiều so với các tế
bào có màng nhân (eukaryote), kích thƣớc của vi khuẩn đƣợc tính bằng đơn vị
micromet (

.

- Dựa theo hình thái bên ngoài, có thể chia vi khuẩn làm 5 loại hình
khác nhau: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn, xoắn khuẩn và phảy khuẩn.
a) Cầu khuẩn (Coccus, cocci)
- Là những vi khuẩn hình cầu, tuy nhiên có nhiều loại có thể là hình
tròn, hình bầu dục nhƣ lậu cầu khuẩn Neisseria gonorrhoeae, hoặc hình ngọn
nến nhƣ phế cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae [3].
- Kích thƣớc của cầu khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0,5-1,0

(1

=

10-3 m).
- Cầu khuẩn đƣợc chia ra thành các giống chính sau đây:
+ Giống đơn cầu khuẩn (Micrococcus, Monococcus)
Thƣờng đứng riêng lẻ từng tế bào một, đa số sống hoại sinh trong đất,

nƣớc và không khí nhƣ Micrococcus agilis, Micrococcus roseus, Micrococcus
leuteus.
+ Giống song cầu khuẩn (Diplococcus)
Là những cầu khuẩn đứng thành đôi, một số loại diplococcus có khả
năng gây bệnh nhƣ mô não cầu khuẩn (Niseria menigitidis), lậu cầu khuẩn
(Niseria gonorrrhoeae) [3].


5
+ Giống liên cầu khuẩn (Streptococcus)
Là những cầu khuẩn đứng thành từng chuỗi dài nhƣ liên cầu khuẩn sinh
mủ (Streptococcus pyogenes). Trong giống này còn có loại liên song cầu
khuẩn (Streptodiplococcus), tức song cầu khuẩn tập hợp từng đôi một thành
từng chuỗi dài. Đây là loại vi khuẩn gây bệnh thƣờng hay gặp.
+ Giống tứ cầu khuẩn (Tetracoccus)
Là những cầu khuẩn đứng thành từng nhóm bốn tế bào một. Tứ cầu
khuẩn thƣờng sống hoại sinh, song cũng có loài có khả năng gây bệnh cho
động vật nhƣ Tetracoccus homeri.
+ Giống bát cầu khuẩn (Sarcina)
Là những cầu khuẩn đứng thành những khối gồm 8 hoặc 16 tế bào.
Trong không khí thƣờng gặp một số loài nhƣ Sarcina lutea, Sarcina
aurantiaca.
+ Giống tụ cầu khuẩn (Straphilococcus, Staphylococci)
Là những cầu khuẩn đứng thành từng đám giống nhƣ chùm nho. Đa số
tụ cầu khuẩn sống hoại sinh, một số có thể gây bệnh cho ngƣời và động vật
nhƣ Staphilococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.
b) Trực khuẩn (Bacillus)
- Là tên chung để chỉ các loài vi khuẩn có hình que, hình gậy, đầu tròn
hay hình vuông, kích thƣớc của trực khuẩn 0,5-1 1-5

. Những trực khuẩn

hay gặp thuộc các giống sau:
+ Bacillus
Là trực khuẩn gram dƣơng, sống hảo khí, sinh nha bào, chiều ngang
của nha bào không vƣợt quá chiều ngang của vi khuẩn, do đó khi có nha bào,
tế bào vi khuẩn không thay đổi hình dạng. Ví dụ: trực khuẩn nhiệt thán
(Bacillus anthracis).


6

+ Bacterium
Là trực khuẩn gram âm, sống hảo khí, không sinh nha bào, thƣờng có
lông ở quanh thân vi khuẩn, có nhiều loại Bacterium gây bệnh cho ngƣời và
gia súc nhƣ trực khuẩn đƣờng ruột. Ví dụ: Salmonella, Escherichia shigella,
Proteus….
+ Clostridium
Là trực khuẩn gram dƣơng hai đầu tròn, sống kị khí, kích thƣớc khoảng
0,4-1

3-8

, sinh nha bào, chiều ngang của nha bào thƣờng lớn hơn chiều

ngang của vi khuẩn, do đó khi mang nha bào thì vi khuẩn bị biến đổi hình
dạng nhƣ hình thoi, hình vợt, hình dùi trống. Có nhiều loại gây bệnh cho
ngƣời và động vật nhƣ trực khuẩn gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ trực
khuẩn uốn ván (Clostridium chauvoei), trực khuẩn gây bệnh ngộ độc thịt
(Clostridium botulium), trực khuẩn hoại thƣ sinh hơi (Clostridium

pefringens), nhƣng cũng có loài rất có ích nhƣ trực khuẩn cố định nitơ
(Clostridium pasteurianum)……

Hình 1: Hình thái các loại vi khuẩn [3]


7
1) Đơn cầu khuẩn; 2) Song cầu khuẩn; 3) Liên cầu khuẩn; 4) Tụ cầu
khuẩn; 5) Bát cầu khuẩn; 6) Trực khuẩn; 7) Cầu trực khuẩn; 8) Xoắn khuẩn
c) Cầu trực khuẩn (Cocco-bacillus)
Là loại vi khuẩn trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn, có hình bầu
dục, hình trứng, có kích thƣớc khoảng 0,25-0,3 0,4-1,5

, ví dụ: vi khuẩn

tụ huyết trùng (Pasteurella), vi khuẩn dịch hạch.
d)Xoắn khuẩn (Spirochoetales)
Là những vi khuẩn có hình lƣợn sóng, gồm các vi khuẩn có từ hai vòng
xoắn trở lên, bắt màu gram dƣơng, di động đƣợc nhờ có một hay nhiều tiên
mao mọc ở đỉnh. Kích thƣớc của xoắn khuẩn thay đổi trong khoảng 0,5-3,0
5-40

, ví dụ: Treponemma detina, Siprium rubrum, Leptospira canicola,

Leptospira Pomona [3].
e) Phảy khuẩn (Vibrio)
Là tên chung để chỉ các vi khuẩn có hình que uốn cong, có hình giống
nhƣ dấu phảy, hình lƣỡi liềm.Phần lớn phảy khuẩn sống hoại sinh, mốt số ít
có khả năng gây bệnh nhƣ phảy khuẩn trùng tả, nhƣ Vibrio cholera.
2.1.1.2. Cấu tạo tế bào vi khuẩn.

Tính từ ngoài vào trong, cho thấy :

Hình 2: Cấu tạo tế bào vi khuẩn [3]


8
1) Tiên mao; 2) Nhân; 3) Màng nguyên sinh chất Tiêm mao; 4) Lớp vỏ
nhày; 5) Thành tế bào vi khuẩn; 6) Riboxom; 7) Tiêm mao; 8) Nhân gốc
a) Tiên mao (Flagellum): Nhờ có tiên mao (roi) mà vi khuẩn di chyển
đƣợc. Một tế bào có thể có 1 hoặc vài tiên mao, kích thƣớc dao động 0,010,03 4-100

. Có 3 loại tiên mao: đơn mao, chùm mao và chu mao. Thành

phần hóa học của tiên mao chủ yếu là protein, chiếm > 90%, phần còn lại là
các chất vô cơ.
b) Nhân gốc: vai trò điều khiển tiên mao di động theo các hƣớng khác nhau.
c) Tiêm mao: đó là các lông tơ phủ ngoài cùng của tế bào vi khuẩn, có
tác dụng bảo vệ tế bào và là chỗ bám khi 2 tế bào tiếp hợp với nhau, ở giai
đoạn trƣởng thành, 1 tế bào có tới vài nghìn tiêm mao. Thành phần hóa học
của tiêm mao chủ yếu là protein.
d) Lớp vỏ nhày (lớp dịch nhày): Là lớp dịch đƣợc phủ phía bên ngoài
của tế bào vi khuẩn. Nhờ có lớp vỏ nhày này mà tế bào vi khuẩn mới có khả
năng xâm nhập vào tế bào chủ. Thành phần hóa học của lớp vỏ nhày rất khác
nhau, thậm chí còn phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trƣởng, phát triển của vi
khuẩn, phụ thuộc vào môi trƣờng sống khac nhau. Nhƣng nhìn chung, lớp vỏ
nhày đƣợc tạo bởi 2 loại nhƣ sau: Polisaccarit và polipectit.
e) Thành tế bào vi khuẩn: nằm phía trong của lớp vỏ nhày, có vai trò bảo
vệ tế bào và luôn luôn giữ cho tế bào ở trong trạng thái ổn định. Thành phần
hóa học của thành tế bào rất khác nhau và có cấu trúc vô cùng phức tạp, có
thể thành tế bào đƣợc cấu trúc bởi chất dị cao phân tử- Heteropolimer, ngoài

ra trong thành tế bào vi khuẩn, ngƣời ta còn thấy có nhiều hợp chất murein,
đây là hợp chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp đƣợc tạo bởi các dây nối 1.4 và
1.6 pectit.
f) Màng nguyên sinh chất: nằm phía trong của thành tế bào có vai trò rất lớn
trong hoạt động sống của tế bào, đó là: vận chuyển các chất dinh dƣỡng vào trong
tế bảo và bào thải các chất không cần thiết ra ngoài tế bào, ngoài ra còn có chức


9
năng là giữ cho áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào ổn định, là nơi sinh tổng
hợp của lớp nhày, là nơi dự trữ các chất dinh dƣỡng của tế bào.
g) Riboxom: trong tế bào vi khuẩn có chứa nhiều riboxom, có hằng số
lắng là 50S và 30S. Vi khuẩn có 1 loại riboxom = 70S, có khối lƣợng mol phân
tử = 2,7 106 đvC. Riboxom có vai trò trong việc tổng hợp protein của tế bào.
h) Mezoxom: đƣợc tạo lên bởi nhiều lớp cuộn lại với nhau hình cầu hoặc
hình trứng, vai trò của mezoxom trong sự hình thành vách ngăn ngang trong
quá trình phân chia tế bào vi khuẩn.
i) Nhân: nhân của vi khuẩn không phải là nhân thật, chỉ tồn tại ở chất
nhân, có vai trò rất lớn trong sự tổng hợp protein của tế bào và di truyền các
tính trạng cho thế hệ sau.
j) Các hạt dự trữ khác: trong tế bào vi khuẩn còn có rất nhiều các chất,
các hạt dự trữ và sắc tố, các loại vitamin đóng vai trò quan trọng trong hoạt
động sống của vi khuẩn.
k) Nha bào: nha bào có sức đề kháng đối cao với các nhân tố vật lí và
hóa học nhƣ nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và các chất sát trùng.
- Ở nhiệt độ 180oC, nha bào của Clostridium botulinum chịu đƣợc 10 phút.
Trong điều kiện nhiệt độ thấp và khô cạn, nha bào có thể sống đƣợc 1 thời gian
rất dài. Nha bào vi khuẩn nhiệt thán (Bacillus anthracis) có thể sống tới 18 năm
hoặc lâu hơn nữa ở trạng thái tiềm sinh. Dƣới tác động của các loại hóa chất
cũng nhƣ các loại tia bức xạ, cùng một nồng độ, cùng một thời gian tác động, có

thể dễ dàng giết tế bào vi khuẩn, nhƣng không giết đƣợc nha bào.
- Nƣớc trong nha bào phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả
năng làm biến tính protein khi tang nhiệt độ.
- Do trong nha bào có một lƣợng lớn ion Ca++ và axit dipicolinic.Protein
trong nha bào kết hợp với dipicolinat canxi thành một phức chất có tính ổn
định cao đối với nhiệt độ.


10
- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác trong nha bào đều tồn tại
dƣới dạng không hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của nha bào đối với
môi trƣờng bên ngoài.
- Sự có mặt của các axit amnin có chứa lƣu huỳnh, đăc biệt là xystin
giúp nha bào đề kháng với tia cực tím.
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp
màng, làm cho các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động tới
nha bào.
2.1.2. Phân loại vi khuẩn.
Đơn vị cơ bản trong phân loại VSV nằm trong hệ thống phân loại của
sinh vật gồm:
- Giới (kingdom) : Ví dụ: giới động vật, giới thực vật. Tên gọi lấy theo
đặc điểm chính của giới bằng chữ Hi Lạp hoặc Latin.
- Ngành (division hoặc philum), dƣới ngành (subdivision).
- Lớp (class), dƣới lớp (subclass).
- Bộ (order): tên gọi lấy tên họ chính và tận cùng bằng ales. Ví dụ:
Pseudomonadales.
- Bộ phụ (Suborder) hay dƣới bộ, có tên tận cùng bằng ineae. Ví dụ:
Rhodobacteriineae.
- Họ (famili) thƣờng có tên tận cùng bằng aceae. Ví dụ: Enterobacteriaceae.
- Dƣới họ (subfamily): thƣờng tận cùng bằng oideae.

- Tộc (tribe) : thƣờng có tên tận cùng bằng eae. Ví dụ: Escherichieae.
- Dƣới tộc (subtribe) thƣờng tận cùng bằng inae.
- Giống (genus hoặc genera ). Ví dụ: Staphilococcus, Salmonella.
- Loài (species).
Đây là đơn vị phân loại cơ bản nhất,tên khoa học của loài thƣờng đặt
kép, tên giống trƣớc và tên loài sau. Mỗi loài vi khuẩn đều mang một tên khoa


11
học riêng, tên này đƣợc đăt theo nguyên tắc “ danh pháp kép” của linne, gồm
hai từ: từ thứ nhất chỉ tên giống (viết hoa) còn từ thứ hai chỉ tên loài (viết
thƣờng).
Ví dụ: Staphilococcus aureus, trong đó Staphilococcus chỉ tên giống,
aureus chỉ tên loài.
2.2. Giới thiệu chung về chi Salmonella.
2.2.1. Nguồn gốc của vi khuẩn Salmonella.
- Năm 1885 Salmon và Smith (Mỹ) tìm đƣợc Salmonella từ lợn mắc
bệnh dịch tả và gọi tên là Bacillus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella [1].
Nhƣng sau đó Schweinittz và Doét 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do
một loại virus gây ra nên và đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh
phó thƣơng hàn [1].
- Năm 1888 A.Gartner phân lập đƣợc mầm bệnh từ thịt bò và lách
ngƣời bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn
này đƣợc gọi là S.enteritidis [1]. Vi khuẩn này cũng đƣợc gọi bằng nhiều tên
khác nhƣ: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner ….
- Năm 1889 Klein phân lập đƣợc S. gallinarum và Rettger cũng đã
phân lập đƣợc S. pullorum năm 1909 [1]. Trƣớc đây ngƣời ta cho rằng đây là
hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó
thƣơng hàn gà ( typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S. gallinarumpullorum.
- Năm 1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập đƣợc vi khuẩn S.

paratyphi equi và S. bacillus [1]. Ngày nay vi khuẩn này đƣợc gọi tên là S.
paratyphi B và đến năm 1989, S. paratyphi A đã tìm đƣợc do N.Guyn và
H.Keyer [1].


12
2.2.2. Đặc điểm hình thái và phân loại.
2.2.2.1. Hình thái và cấu trúc của vi khuẩn Salmonella.
a) hình thái vi khuẩn Salmonella.

Hình 3: Vi khuẩn Salmonella.
Theo bergeys manual (1994) [10], vi khuẩn Salmonella là trực khuẩn
ngắn, hai đầu tròn, có kích thƣớc 0,4-0,6 1,0-3,0

, bắt màu Gram âm,

không hình thành nha bào và giáp mô. Đa số loài salmonella có

lông

(flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S. gallinarum-pullorum) [8].
Lông giúp cho vi khuẩn có khả năng di động. Lông có hình tròn, dài,
xuất phát từ màng cytoplasma. Do có cấu trúc từ các sợi protein hình xoắn
nên có thể co giãn và di động nên lông của chúng khó nhuộm. Nếu nhuộm
bằng phƣơng pháp Haschem (1972) thì có thể nhìn thấy chúng dƣới kính hiển
vi điện tử (Lê Văn Tạo, 1993) [4]. Lông có tính kháng nguyên và do các gen
mã hóa tổng hợp protein riêng quy định.
Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella đều có các
cấu trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili. Chúng có kích thƣớc chừng
0,01-0,03 1,0

. Số lƣợng Fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250-400 cái


13
vƣơn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào. Fimbriae có cấu trúc là protein và có
tính kháng nguyên đặc trƣng. Theo Jones và cs (1981) [18]: Fimbriae tạo cho vi
khuẩn khả năng bám dính(adhesion) lên các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập
vào lớp niêm mạc.
b) Cấu trúc vi khuẩn Salmonella.
- Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện
trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với
những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng
nguyên lông H, và kháng nguyên vỏ K, Vi khuẩn thƣơng hàn (S. typhi) có
kháng nguyên vỏ V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn
thƣơng hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu [1].
- Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O)
+ Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp.
Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu
chất

và

tới

lớp

màng

ngoài

(outer

memberane)

là

phức

hợp

lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.
+ Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết
định độc tố của nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính
đặc hiệu. Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là
lipopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một,
Nhƣng tính miễn dịch thì khác nhau: Kháng nguyên O ngoài LPS còn bao
gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS.
Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhƣng phospholipid hầu nhƣ
chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10nm
gồm 3 thành phần: lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O. Màng ngoài
còn có thêm các protein : Protein cơ chất, porin ở vi khuẩn còn gọi là protein
lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng nhƣ
dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. Protein màng ngoài : chức năng vận


14
chuyển một số phân tử riêng biệt và đƣa qua màng ngoài. Lipoprotein: đóng
vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài.
- Kháng nguyên lông (kháng nguyên H)

+ Kháng nguyên H: chỉ có ở các Salmonella có lông. Hầu hết
Salmonella đều có lông chỉ trừ S. galilarum [8], S. pulorum gây bệnh cho gia
cầm. Kháng nguyên H là một loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém
bền hơn kháng nguyên O. kháng nguyên H rất dễ bị phá hủy ở nhiệt độ cao
hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu.
+ kháng nguyên H chia làm 2 phase :
Phase 1: có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông
đƣợc biểu thị bằng chữ số Latin thƣờng : a, b, c….
Phase 2: không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngƣng kết với
các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E. coli. Pha 2 gồm có 6 loại
đƣợc biểu thị bằng chữ số Arap 1-6 hay chữ số Latin e,n,x……
- Kháng nguyên vỏ K: không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là
kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S. typhi và S. paratyphi.
kháng nguyên Vi-antigen đƣợc felix và các cộng sự phát hiện năm 1935 [1].
Kháng nguyên Vi gây hiện tƣợng ngƣng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ,
kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O,
kháng nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh.
2.2.2.2. Phân loại vi khuẩn Salmonella.
- Về phân loại khoa học Salmonella đƣợc xếp vào:
Giới : Bacteria
Ngành : Proteobacteria
Lớp: Gramma Proteobacteria
Bộ : Enterobacteriales
Họ : Enterobacteriaeae
Giống : Salmonella lignieres 1900


15
- Lúc đầu, các loài Salmonella đƣợc đặt tên theo hội chứng lâm sang
của chúng nhƣ S. typhi hay S. paratyphi A, B, C (typhoid= bệnh thƣơng hàn,

para = phó), hoặc theo vật chủ nhƣ S.typhimurium gây bệnh ở chuột ( murine
= chuột), về sau ngƣời ta thấy rằng 1 loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội
chứng và có thể phân lập đƣợc ở nhiều loài khác nhau. Vì những lí do đó mà
các chủng Salmonella. Mới phát hiện đƣợc đặt tên theo nơi mà nó đƣợc phân
lập nhƣ S. teheran, S. congo, S. london….
Vi khuẩn Salmonella là 1 loài trực khuẩn thuộc bộ Eubacteriales, họ
Enterobacteriaceae. Giống Salmonella gồm 2 loài: S. enterica và S. bongri đã
đƣợc phân chia thành trên 2000 serotyp theo bảng phân phối loại Kauffmannwhite trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và
đôi khi các kháng nguyên vỏ( kháng nguyên K). Gần đây, loài S. enterica đã
đƣợc chia thành 6 phân loài đó là:
+ S. enterica subsp. Enterica
+ S. enterica subsp. Salamae
+ S. enterica subsp. Arizonae
+ S. enterica subsp. Diarizinae
+ S. enterica subsp. Houtenae
+ S. enterica subsp. Indica
Trong đó phân loài S. enterica subsp. Enterica gồm phần lớn các chủng
gây bệnh cho ngƣời và động vật. Do dƣới loài lại có nhiều type huyết thanh
khác nhau nên chúng tiếp tục đƣợc phân loại đến type huyết thanh. Các type
huyết thanh dƣới loài khác nhau thƣờng có sự khác biệt trong vùng tiến hóa là
3,8-4,6%.
S.enterica subsp. Enterica có 7 dạng huyết thanh học bao gồm:
+ Salmonella Choleraesuis
+ Salmonella Dublin
+ Salmonella Enteritidis


16

+ Salmonella Heidelberg

+ Salmonella Paratyphi
+ Salmonella Typhi
+ Salmonella Typhimurium
Hệ thống phân loài này hiện đang đƣợc sử dụng phổ biến bởi các tổ
chức nhƣ World Health Organization (WHO), Centers for Disease Control
and Prevention(CDC) [18].
2.3. Khả năng và cơ chế gây bệnh.
a) Khả năng gây bệnh: bệnh xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm
Salmonella, thƣờng do thức ăn không đƣợc bảo quản trong tủ lạnh.
Thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 đến 48 giờ (đây là điểm khác biệt rất
cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu, thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ vài ba
giờ). Sau thời gian ủ bệnh, bệnh nhân có sốt, nôn và ỉa chảy [25]. Ở ngƣời
lớn, rối loạn tiêu hóa thƣờng kéo dài từ 2 đến 5 ngày rồi rồi tự khỏi. Một số
rất ít bệnh nhân trở thành ngƣời lành mang vi khuẩn, có thể kéo dài nhiều
tháng. Một số loài Salmonella chỉ gây nhiễm khuẩn nhiệm độc thức ăn ở
ngƣời lớn lại có thể gây ra tình trạng bệnh lí rất nặng ở trẻ nhỏ và trẻ sơ sinh.
Bệnh nhi có thể bị nhiễm khuẩn đƣờng huyết, viêm màng não, viêm xƣơng.
Có thể gây ra các vụ dịch ở các khoa nhi.
Tùy theo từng loài, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho ngƣời, chỉ gây
bệnh cho động vật, nhƣng cũng có thể vừa gây bệnh cho ngƣời vừa gây bệnh
cho động vật. Nhƣng những loài Salmonella có khả năng gây bệnh cho ngƣời
đƣợc quan tâm nhiều hơn cả:
- S. typhi: loài này chỉ gây bệnh cho ngƣời, đó là vi khuẩn quan trọng
nhất trong các căn nguyên gây bệnh thƣơng hàn.
- S. paratyphi A: cũng chỉ gây bệnh cho ngƣời. Là nguyên nhân gây
bệnh thƣơng hàn ở nƣớc ta , tỉ lệ phân lập đƣợc chúng chỉ sau S.typhi.


17
- S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở ngƣời, nhƣng có thể gây bệnh

cho động vật. Tại các nƣớc châu âu, tỉ lệ phân lập đƣợc vi khuẩn này cao hơn.
- S. paratyphi C: vừa có khả năng gây bệnh thƣơng hàn vừa có khả
năng gây bệnh viêm ruột, dạ dày và nhiễm khuẩn huyết. Thƣờng gặp ở các
nƣớc đông nam châu Á .
- S. typhimurium và S. enteritidis : vừa có khả năng gây bệnh cho ngƣời
vừa có khả năng gây bệnh cho động vật. Có thể gặp ở các nƣớc khác nhau
trên thế giới. Chúng là nguyên nhân chủ yếu của bệnh nhiễm khuẩn nhiễm
độc thức ăn do Salmonella.
- S. choleraesuis: là căn nguyên thƣờng gặp trong các nhiễm khuẩn
huyết do Salmonella ở nƣớc ta.
b) Cơ chế gây bệnh: bệnh thƣơng hàn do S. typhi và các S. paratyphi
A, B, C gây ra. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đƣờng tiêu hóa do thức
ăn, nƣớc uống bị nhiễm bẩn. Số lƣợng vi khuẩn đủ để gây bệnh là khoảng 10 5
đến 107 tế bào [1]. Sau khi vào ống tiêu hóa, vi khuẩn thƣơng hàn bám vào
niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột vào, các hạch mạc treo
ruột, ở đây vi khuẩn nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào
màu, lúc này các dấu hiệu lâm sàng bắt đầu xuất hiện. Từ máu, vi khuẩn đến
lá lách và các cơ quan khác. Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi đƣợc đào thải
qua phân. Tới thận, một số vi khuẩn đƣợc đào thải ra ngoài theo nƣớc tiểu.
Vi khuẩn thƣơng hàn gây bệnh bằng nội độc tố, nội độc tố kích thích
thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột, vị
trí tổn thƣơng thƣờng ở các mảng payer. Đây là biến chứng hay gặp do bệnh
nhân ăn sớm khi chƣa bình phục, nhất là các thức ăn cứng. Nội độc tố theo
máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật. Giai đoạn toàn phát thân
nhiệt tăng cao, sốt bệnh nhân thƣờng có dấu hiệu ngủ li bì, có thể hôn mê,
trụy tim mạch và dẫn đến tử vong [25]. Những bệnh nhân qua khỏi, sau khi đã