PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAOHPLC cấu tạo máy HPLC ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (607.88 KB, 19 trang )
PHƯƠN
G PHÁP
SẮC KỶ
LỎNG
HIỆU
NĂNG
CAO,
CẤU
TẠO
MÁY
HPLC ỨNG
DỤNG
TRONG
THỰC
Tên chuyên đề: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)-CẤU
TẠO MÁY HPLC-ỨNG DỤNG TRONG
THỰC PHẨM
SV thực hiện: Nguyễn Song Khoa -15116024
Nguyễn Thành Lân –15116025
Lê Ngọc Pha Lê – 15116026
Nguyễn Thị Cẩm Tú-15116060
Thời gian: 13/4/2016
Trang 1
Đánh giá của GV
MỤC LỤC
A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)…………Trang 3
1.
2.
3.
4.
5.
Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………...Trang 3
Phân loại ……………………………………………………………….....Trang 4
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao…………….......Trang 5
Chọn điều kiện sắc ký…………………………………………………......Trang 7
Kỹ thuật tiến hành sắc ký…………………………………………………Trang 10
B-CẤU TẠO MÁY HPLC……………………………………………………...Trang 11
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Bình chứa pha động………………………………………………………..Trang 11
Bộ phận khử khí…………………………………………………………...Trang 12
Bơm cao áp………………………………………………………………...Trang 13
Bộ phận tiêm mẫu ………………………………………………………...Trang 13
Cột sắc ký………………………………………………………………….Trang 13
Đầu dò……………………………………………………………………..Trang 14
Hệ thống máy tính…………………………………………………………Trang 15
In dữ liệu…………………………………………………………………..Trang 15
C-ỨNG DỤNG…………………………………………………………………...Trang15
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)-CẤU TẠO MÁY
HPLC-ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM
Trang 2
A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)
I.
-
Giới thiệu
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography ), trước kia gọi là phương
-
pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (sắc ký lỏng cao áp) là một công cụ mạnh mẽ dùng trong
-
phân tích môi trường.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản là một hình thức cải tiến của sắc ký cột. Thay vì
dung môi qua cột dưới lực hấp dẫn, chúng qua cột dưới áp lực cao lên đến 400 lần áp
suất khí quyển. Điều này cho phép bạn sử dụng một kích thước hạt nhỏ hơn rất nhiều
cho các vật liệu trong cột và một diện tích bề mặt lớn hơn nhiều cho các tương tác
-
giữa các pha và các phân tử được chuyển qua.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở
phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp
chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã
được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn,
hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ
nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ
-
phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc
trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược
phẩm, môi trường…..
Khái niệm về kỹ thuật sắc ký
II.
Phân loại
Trang 3
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC
thành 4 loại:
• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
• Sắc ký phân bố (partition chromatography).
• Sắc ký ion (ion chromatography).
• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được
những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối
lượng phân tử không quá lớn (<3000).
Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và
pha động:
• Sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography):
- Trong sắc ký pha thường, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn
pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực.
SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với
-
phân tử lượng không lớn lắm.
Cột điển hình có đường kính 4,6 mm (có thể ít hơn), và chiều dài 150-
-
250 mm.
Các hợp chất có cực trong hỗn hợp qua cột sẽ bị giữ trên cột lâu hơn
so với các hợp chất không phân cực. Những chất không phân cực do
đó sẽ vượt qua cột nhanh hơn.
• Sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography):
- Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực
hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực
đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất
thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung
môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do
-
đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT.
Trong trường hợp này, kích thước cột là như nhau, nhưng silica được thay đổi để
làm cho nó không phân cực bằng cách gắn các chuỗi hydrocacbon lên bề mặt của
nó - thường là 8 hoặc 18 nguyên tử carbon. Một dung môi cực được sử dụng - ví
-
dụ, một hỗn hợp của nước và rượu như methanol.
Điều đó có nghĩa các phân tử phân cực sẽ đi qua cột một cách nhanh chóng.
Đảo ngược giai đoạn HPLC là hình thức được sử dụng phổ biến nhất của HPLC.
Trang 4
III.
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp săc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện dựa trên việc bơm để đẩy
một lượng chất lỏng dưới áp suất cao và hỗn hợp mẫu cần phân tích đi qua một cột được
nhồi đầy một loại chất hấp phụ và từ đó dẫn tới việc tách các thành phần của mẫu. Chất
hấp phụ – được nhồi trong cột, là các hạt rắn (như silica, polymers) với kích thước từ 2 –
50 µm. Các thành phần trong hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau nhờ vào mức độ tương
tác khác nhau với các hạt chất hấp phụ. Dòng chất lỏng dưới áp suất cao thường là hỗn
hợp của các dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), được gọi là “pha động”.
Thành phần và nhiệt độ dung môi đóng vai trò chính trong quá trình tách chất do tương tác
xảy ra giữa các thành phần của mẫu và chất hấp phụ.
Phương pháp sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá
trình vừa có tính chất hóa học lại vừa có cả tính chất lý học. Nó là những cân bằng động
xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục
của các chất tan ( hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột
tách đến cuối cột tách .Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giưa hai
pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định,
hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn
chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Mặt khác, cũng vì
cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển
trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc
độ của dòng pha dộng, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh
giữ lại. Như vậy là có một khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc
ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu
trúc của mỗi chất tan khác nhau đồng thời phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha
động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn đến kết quả là có quá
trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký.
Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:
•
Tương tác hấp thụ
Trang 5
Tương tác trao đổi ion
Tương tác theo cơ chế rây phân tử
Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
• Sắc ký hấp thụ ( hấp thụ pha thường NP – HPLC và hấp thụ pha ngược RP- HPLC)
• Sắc ký trao đổi ion ( EX- HPLC)
• Sắc ký rây phân tử (Gel – HPLC)
•
•
Tóm lại: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất
trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi
kích thước nhỏ, chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó.
Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiểu quả tách sắc ký tốt. Thành phần
pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới
cuối cột tách được chuyển tới detector để phát hiện. Tùy thuộc vào bản chất của chất tan
mà dùng các loại detector khác nhau.
TÓM GỌN NGUYÊN TẮC :
-
Pha động là chất lỏng
Pha tĩnh là chất rắn. ( chứa trong cột dưới dạng tiểu phân hoặc là chất lỏng đã phủ
lên chất mang rắn, hoặc chất đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức
-
hữu cơ.
Ở pha động, chất lỏng được di chuyển qua một cột chứa pha tĩnh.
-
Hỗn hợp các chất
được tạo ở đầu cột và phân tách ra khi hỗn
hợp này đi qua cột)
Trang 6
Từng thành phần này (peaks) được nhận biết bằng các máy Detector và kết quả
-
được ghi lại ở hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu.
Chọn điều kiện sắc ký
Muốn cho kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn
IV.
hợp mẫu.
Các điều kiện đó bao gồm:
• Pha tĩnh :
- Loại pha tĩnh
- Kích thước cột
• Pha động:
- Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ...Nếu là chương trình rửa
-
giải Isocratic
Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung
môi ... Nếu là chương trình rửa giải Gradient.
• Hệ thống trang bị:
- Loại Detector
- Van tiêm mẫu, thể tích tiêm
- Hệ đường dẫn
- Các yếu tố khác (nhiệt độ, độ nhảy của Detector, bước sóng phân tích)
Lựa chọn pha tĩnh
- Dựa vào các thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn
•
-
cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác
Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha thuận (NP) và cột pha đảo ( RP)
Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN,cột NH2 ,....
Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính
Pha tĩnh : Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực .Trên
bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước .
Trang 7
-
Ví dụ: Cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu tạo cột như sau :
OH OH
OH
- O- S -O-Si - O - Si - O OH
-
OH
OH
Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân
cực như : Methanol,Benzen,Acetonitril,Chlorofoc ...
• Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa )
- Pha tĩnh : Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phân
cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là
thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP
8 hay RP 18) hay các mạch Carbon vòng( Phenyl- tương đương cột Phenyl ) vì thế
nó ít phân cực hay phân cực rất ít .
Ví dụ: cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS, Cột Nucleosil C18........
- Pha động: Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực
như :Methanol ,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn hợp của các
dung môi-đệm
Lựa chọn pha động :
- Dựa vào các thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa
chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu
đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân
tiïch phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu
sự hoạt động của thiết bị .
- Pha động có thể thay đổi:
Trang 8
+ Độ chọn lọc α
+ Thời gian lưu
+ Hiệu năng tách của cột
+ Độ phân giải
+ Tính đối xứng của Peak
Do đó ,Trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù
hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích.
Chính vì vậy pha động cần có những yêu cầu sau:
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có .Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi
hóa học . ( vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)
+ Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng.
( đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không
làm tủa các chất có trong cột ,hay pha động có sẵn trong cột vd : đệm phosphat rửa ngay
bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)
+ Pha động phải bền vững theo thời gian : càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là
chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu ).
+ Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết để phân tích
+ Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
+ Phải phù hợp với loại Detector : vd UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ
quang (vd acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm) . Detector huỳnh quang thì dung môi
không được phát quang.
+ Phải kinh tế ,không quá hiếm và đắt
Trang 9
Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha động là dung môi phân cực là :
Nước,ACN,MeOH ,acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay Aminoacid ..
+ Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn
chất hữu cơ nguyên một mình nó .
Ví dụ: thêm nước vào ACN hay MeOH .. Sẽ tạo được pha động phân cực hơn nó .
Tất nhiên độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ nước được thêm vào.
+ Ngòai các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường
hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH.Chất tạo phức,tạo cặp
ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất .
+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo bảng sau:
V.
Kỹ thuật tiến hành sắc ký
1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc:
+ Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho
kết quả phân tích có độ đúng,độ lặp lại,tuyến tính,tỷ lệ dung môi ,tốc đô dòng,năng lượng
đèn ....đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra .
+ Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có
nghi ngờ về khả năng tách ,và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký :
2.
Chuẩn bị dung môi pha động :
+ Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC
+ Các hóa chất dùng phải là loại PA
Trang 10
+ Pha dung môi đúng ,chính xác theo đúng tỷ lệ, ,để ổn định dung môi đúng thời
gian theo chuyên luận đã yêu cầu .Lọc dung môi qua màng lọc 0.2 - 0.45 µm ,Siêu âm
đuổi bọt khí
3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC:
+ Mẫu Thử : Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận ,qui trình theo nguyên tắc :
Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động ,trong nhiều trường
•
hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu
• Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rưẳ giải được bằng
cách lọc hay chiết ..
• Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua màng lọc 0.2 - 0.45 µm
• Nồng độ mẫu ở mức vừa phải,không vượt quá khả năng tách của cột.Có thể gây
ra nghẽn cột.
+ Mẫu chuẩn : Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng
dung môi ,riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất ,ngoài ra có thể
dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành
phần.
4. Cách do HPLC
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuôcü vào hãng sản xuất ,phần mền
sắc ký . Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau :
+ Chạy máy với dung môi pha động để đuỏi hết bọt khí có trong hệ thống ống
dẫn trước khi cho vào cột.
+ Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:
•
•
•
Cấu hình máy
Tỷ lệ các dung môi pha động
Bước sóng, thành phần, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu
B-CẤU TẠO MÁY HPLC
Trang 11
Máy HPLC
CẤU TẠO MÁY HPLC
*Trong đó
1. Bình chứa pha động.
2. Bộ phận khử khí
3. Bơm cao áp
4. Bộ phận tiêm mẫu
5. Cộ sắc ký (pha tĩnh)
6. Đầu dò
7. Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.
8. In dữ liệu.
Trang 12
1. Bình chứa pha động.
•
Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử
dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng
tỉ lệ của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà
thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất
hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải.
•
Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng
cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là
hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh
hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân
tích.
2. Bộ phận khử khí Degases
Trang 13
Mục đích: nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy
ra một số hiện tượng có thể có như sau:
•
Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak
thay đổi.
•
Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm
cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động
của cả hệ thống HPLC.
Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.
3. Bơm cao áp
Mục đích: bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt
được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến
10ml/phút
Trang 14
4. Bộ phận tiêm mẫu
-
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự
động.
5. Cộ sắc ký (pha tĩnh)
-
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng
-
hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay
-
đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…
Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.
6. Đầu dò
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột
và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính
và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích
mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.
Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện
Trang 15
thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…
Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau:
- Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp
thụ quang.
- Đầu dò hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên
và các dẫn suất có huỳnh quang.
- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các
chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường.
- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.
- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt ,……
Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS.
7. Bộ phận ghi nhận tín hiệu
Ghi tín hiệu do đầu dò phân tích
Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần
này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận,
lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên
quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân
giải,… đồng thời tính tóan, xử lý các thông
Trang 16
số
liên
quan
đến
kết
quả
phân
tích.
8. In dữ liệu.
Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài
phần mềm điều khiển.
C- ỨNG DỤNG
-
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được ứng dụng để xác định một số
carotenoid quan trọng trong rau quả như lutein, zeaxanthin, lycopene, α-carotene và β-
-
carotene.
Hai phương pháp chính được khảo sát là phương pháp của Hart và Scott (1995) và
phương pháp theo AOAC (1984). Các carotenoid được định tính và định lượng trên sắc
-
ký lỏng với các detector UV-VIS và PDA.
Hàm lượng các carotenoid chính trong một số loại rau, quả đã được xác định như sau:
• Lutein có nhiều nhất trong rau ngót và rau muống (5419,3 µg% và 867,9 µg%
tương ứng), lycopene có nhiều nhất trong cà chua và dưa hấu (2750,0 µg% và
2000,5 µg% tương ứng), α-carotene có nhiều nhất trong ớt vàng và carốt (3270,6
µg% và 3036,0 µg% tương ứng)
• β-carotene có hàm lượng cao nhất trong rau ngót (6810,1µg%), carốt (6597,1µg
-
%) và ớt vàng (3606,7 µg%).
Các kết quả thu được có thể áp dụng để phân tích các carotenoid nhằm bổ sung cho bảng
-
thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam.
Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy và tính chọn lọc cao có thể phân tích
các độc tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến và thức ăn gia súc như
-
Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,…
Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực phẩm,
các loại đường,… trong thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia súc,…
- Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản.
Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng trong nghiên cứu phân tích kháng thuốc
điều trị
Một trong những vấn đề khó khăn trong kháng thuốc chloroquine do Plasmodium
vivax hiện nay là không phân định được tái phát hay tái nhiễm lại tác nhân gây bệnh sau
Trang 17
khi đã hoàn tất liệu trình điều trị, ngay cả kỹ thuật sinh học phân tử như PCR cũng khó
phân biệt vì vốn dĩ chu kỳ sinh học của Plasmodium vivax là có thể ngủ và tái hoạt thể
ngủ nên không thể đánh giá thấu đáo tái phát (relapse) hay tái nhiễm (reinfection) đối với
loài KSTSR này.
Các trường hợp xuất hiện lại P. vivax, cần đo nồng độ CQ trong máu toàn phần,
các mẫu máu được lấy vào giấy thấm Whatman 31ETchr vào các ngày D 0, D7, Dthất bại và
D28. Lấy 100ml máu đầu ngoán tay bằng ống mao quản chứa sẵn heparin hoặc chất chống
đông EDTA, để khô trong môi trường và bỏ vào túi plastic có khóa (có thể để được 24
tháng), sau đó gởi đi phân tích bằng máy HPLC (Agilent 1200 series, Agilent
Technologies, Germany) theo quy trình phương pháp của Bell và cộng sự (2007). Hệ
thống sắc ký lỏng của HPLC sử dụng là cột phân tích trong pha nghịch ZORBAX Ecllpse
XDB-C18 (4.6 × 150mm ID, 5 μm), với tốc độ dòng chảy 1ml/phút, pha động isocratic
chứa nước đã khử ion, acetonitrile và triethylamine theo tỷ lệ 90%, 10% và 1%.
Theo Chương trình phòng chống sốt rét toàn cầu (Global Malaria
Programme_GMP) và Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organisation_WHO) cho
phép và hướng dẫn trong đánh giá nhạy kháng thuốc chloroquine do Plasmodium vivax,
chỉ số tổng nồng độ Chloroquine và Desethylchloroquine (CQ+DCQ) sau khi điều trị 3
ngày và trong quá trình theo dõi 28 ngày vẫn còn KSTSR Plasmodium vivax mà tại thời
điểm đó nồng độ CQ+DCQ ≥ 90 ng/ml là một chỉ điểm (marker) nghi ngờ kháng thuốc.
Do đó, việc phân tích xác định nồng độ Chloroquine và Desethylchloroquine (CQ+DCQ)
trong máu bệnh nhân trong và sau điều trị bằng máy HPLC và HPLC/MS là rất cần thiết
trong đánh giá nhạy - kháng thuốc, để đưa ra các thay đổi chính sách thuốc sốt rét phù
hợp từng giai đoạn.
Việc nghiên cứu phân bố của CQ và DCQ trong máu, huyết tương và hồng cầu trên
những cá nhân khỏe mạnh tình nguyện và bệnh nhân sốt rét đã được nghiên cứu từ nhiều
năm qua sử dụng hệ thống HPLC đo nồng độ Chloroquine (Cq) và desethyl-chloroquine
(CqM) với HPLC và các kết quả đang mang lại nhiều khía cạnh quan trọng đánh giá nhạy
kháng thuốc cũng như một số chỉ số thông số dược động học về thuốc sốt rét loại CQ .
Trang 18
Trang 19
