Khảo sát khả năng ức chế enzyme αamylase của cao chiết lá cây nhàu (morinda citrifolia l.)

Dien dan Ketnooi.com chia se
B ộ• GIÁO DỤC
• VÀ ĐÀO TẠO
•
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN
* * **

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC Ệ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ức CHẾ
ENZYME a-AMYLASE CỦA CAO CHIẾT LÁ
CÂY NHÀU (Morinda citrifolia L.)

Cán bô hướng dẫn:
TS. ĐẨl t h ị x u â n t r a n g
KHOA KHÓA HỌC T ự NHIÊN
B ộ MÔN SINH HỌC

Cần Thơ, 2013

sinh viên thực hiện:
LÊ BÁ TƯỚC
MSSV: 3097459
LỚP: SINH HỌC KHÓA 35


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

PHÀN KÝ DUYÊT
CÁN B ộ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN TH ựC HIỆN

Đái Thị Xuân Trang

Lê Bá Tước

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày 7 tháng 6 năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG
(Ký tên)


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

L Ờ I CẢM TẠ
Trong quá trình thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế enzyme aamylase của cao chiết lá Nhàu (Morỉnda citrifolm L.)”, tôi xin chân thành gửi
lời cảm ơn sâu sắc đến:
Ban lãnh đạo Khoa Khoa Học Tự Nhiên, cùng quý Thầy Cô bộ môn Sinh
Học-Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức,
kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô Đái Thị Xuân
Trang là cán bộ hướng dẫn đề tài tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho em trong
quá trình thực hiện đề tài.

Quí thầy cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học, phòng thí nghiệm Hóa
Học Khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Viện
Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi về
thời gian cũng như điều kiện thực tập tại Phòng thí nghiệm.
Tập thể lớp Sinh Học Khóa 35 đã động viên và đóng góp ý kiến cho em
trong quá trình thực hiện luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình tôi. Gia đình đã động viên
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tạo điều kiện tốt cho tôi được học
tập.
Với kiến thức còn hạn chế của mình chắc chắn không tránh khỏi những
thiếu sót, mong quý thầy cô góp ý để bài báo cáo được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Lê Bá Tước


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

LỜI CAM KẾT
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu,
kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Lê Bá Tước

Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT............................................................................................... i
LỜI CẢM TẠ...................................................................................................... iii
LỜI CAM K ẾT.................................................................................................... iv
MỤC LỤ C.............................................................................................................V
DANH SÁCH BẢNG........................................................................................ viii
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................ ix
DANH MỤC TỪ V ẾT TẮ T................................................................................X
TÓM LƯỢC......................................................................................................... xi
PHẦN 1: GIỚI T H ỆU .......................................................................................... 1
PHẦN 2: LƯỢC KHẢO TÀI L Ệ U ..................................................................... 3
1. Đại cương về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)....................................................3
1.1 Định nghĩa bệnh đái tháo đường.............................................................. 3
1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường................................................................. 3
1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 1: đái tháo đường phụ thuộc insulin........ 3
1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 2: đái tháo đường không phụ thuộc insulin
3
1.3 Tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh đái tháo đường........................................ 4
1.4 Điều trị..................................................................................................... 4
1.6 Tình hình nghiên cứu chữa đái tháo đường bằng thảo dược....................5
2. Enzyme a-amylase........................................................................................5
2.1 Giới thiệu chung về a-amylase................................................................ 5
2.2 Thành phần hệ enzyme amylase.............................................................. 6
2.3 Đặc tính của enzym a-amylase................................................................ 6

2.4 Cơ chế tác dụng của enzym a-amylase trong phản ứng thủy phân......... 7
4. Sơ lược về cây Nhàu...................................................................................... 8
4.1 Phân loại................................................................................................... 9
4.2 Đặc điểm hình thái và phân bố................................................................. 9
4.3 Thành phần hóa học có trong cây nhàu..................................................10
4.3 Tác dụng dược lý của cây Nhàu............................................................. 10
PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM....................12


Luận vẫn tốt nghiệp

Sinh học K35

1. Phương tiện.................................................................................................. 12
1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện............................................................. 12
1.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị............................................................ 12
1.2.1 Mau vật............................................................................................ 12
1.2.2 Hóa chất........................................................................................... 12
1.2.3 Dụng c ụ ........................................................................................... 12
2. Phương pháp thí nghiệm..............................................................................12
2.1 Phương pháp chiết và tách cao............................................................... 12
2.1.1 Ly trích cao lá Nhàu bằng dung môi ethanol.................................. 12
2.1.2 Tách phân đoạn cao ethanol lá Nhàu...............................................13
2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao ethanol lá Nhàu
(Morinda citrifolia L.).................................................................................. 15
2.3 Khảo sát khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao petroleum ether lá
Nhàu (Morinda citrifolia L.)........................................................................ 16
2.4 Khảo sát khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao ethyl acetate lá
Nhàu (Morinda citrifolia L.)........................................................................ 16
3 Phương pháp xử lý kết quả........................................................................... 17

PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO VÀ THẢO LUẬN...............................................18
1. Kết quả ly trích và tách phân đoạn cao lá Nhàu.......................................... 18
1.1 Độ ẩm của mẫu.......................................................................................18
1.2 Kết quả ly trích cao ethanol................................................................... 18
1.3 Kết quả tách phân đoạn cao từ cao ethanol lá Nhàu.............................. 18
2. Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao
ethanol lá Nhàu (Morinda citrifolia L.)........................................................... 19
3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao petroleum ether lá
Nhàu (Morinda citrifolia L .)........................................................................... 22
4. Khảo sát khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao ethyl acetate lá Nhàu
(Morinda citrifolia L .).....................................................................................24
5. So sánh khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao ethanol, cao petroleum
ether và cao ethyl acetate.................................................................................27
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................ 29
vi


Luận vẫn tốt nghiệp

Sinh học K35

1. Kết luận....................................................................................................... 29
2. Kiến nghị..................................................................................................... 29
TÀI L Ệ U THAM KHẢO...................................................................................30
PHỤ LỤC.............................................................................................................32

vii


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

DANH SÁCH BẢNG

Bảng

trang

Bảng 1: Độ ẩm lá Nhàu........................................................................................18
Bảng 2: Kết quả tách phân đoạn cao....................................................................18
Bảng 3: Khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao lá Nhàu...........................21
Bảng 4: Khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao PE................................... 23
Bảng 5: Khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao ethyl acetate lá Nhàu...... 25
Bảng 6 : So sánh giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) của cao ethanol, cao
petroleum ether và cao ethyl acetate................................................................... 27
Bảng 7: So sánh giữa lượng chất ức chế trong các loại cao với lượng Acarbose 27


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

DANH SÁCH HÌNH

Hình

trang

Hình 1: Cây Nhàu................................................................................................... 9

Hình 2: Tách phân đoạn cao lá............................................................................ 13
Hình 3: Cô quay dịch trích thu được sau khi đã lắt cao với dung m ôi................14
Hình 4: Sơ đồ tách phân đoạn cao từ cao ethanol lá nhàu.................................. 14
Hình 5: Đường chuẩn khả năng ức chế của Acarbose đến hoạt động của enzyme
a-amylase.............................................................................................................20
Hình 6 : Khả năng ức chế của cao ethanol lá Nhàu đến hoạt động của enzyme aamylase................................................................................................................ 22
Hình 7: Khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao petroleum ether lá Nhàu.. 24
Hình 8 : Khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao ethyl acetate lá nhàu....... 26


Sình học K35

Luận văn tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BuOH: Butanol
DMSO: Dimethyl sulfoxid
ĐTĐ: Đái tháo đường
EA: Ethyl acetate
IC 50: Nồng độ ức chế 50%
PE: Petroleum ether


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

TÓM LƯỢC
Đái tháo đường là một căn bệnh mãn tính với nhiều biến chứng nguy

hiểm, biểu hiện đặc trưng của bệnh là hiện tượng tăng đường huyết và rối loạn
chuyển hóa carbohydrate. Sử dụng thảo dược dân gian trong điều trị bệnh đái
tháo đường là một trong những hướng đi đầy tiềm năng. Cây Nhàu được biết đến
với khả năng làm hạ đường huyết. Đề tài “Khảo sát khả năng ức chế enzyme aamylase của cao chiết lá Nhàu (Morinda citrifolia L.)” được thực hiện nhằm
chứng minh cơ chế hạ đường huyết của cây Nhàu. Khả năng ức chế enzyme aamylase được xác định dựa vào lượng tinh bột ban đầu và lượng tình bột còn lại
sau khi cho phản ứng với enzyme a-amylase. Khảo sát khả năng ức chế bằng
cách ủ enzyme a-amylase với các loại cao ethanol, cao Petroleum ether, cao ethyl
acetate, cao butanol và cao nước trước khi cho tinh bột vào phản ứng. Kết quả
khảo sát cho thấy cao butanol và cao nước không có khả năng ức chế enzyme aamylase. Cao ethyl acetate cho hiệu quả ức chế cao nhất là 81,8 + 0,53% ở nồng
độ 4,5 mg/ml. Trong khi đó cao ethanol cho hiệu quả ức chế cao nhất là 36,37 ±
0,51% ở nồng độ cao 25 mg/ml. Cao petroleum ether cho hiệu quả ức chế cao
nhất là 20,39 ± 0,38%. Giá trị IC50 của cao ethanol là 41,93mg/ml, cao petroleum
ether là 194,48mg/ml và cao ethyl acetate là 3,75mg/ml. Chứng minh được một
trong những cơ chế làm hạ đường huyết của Nhàu là thông qua tác dụng ức chế
sự hoạt động của enzyme a-amylase.


Luận vẫn tốt nghiệp

Sinh học K35

PHÀN 1: GIỚI THIỆU
Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) hay còn gọi bệnh “tiểu đường” là một trong
những vấn đề đáng quan tâm trong xã hội ngày nay. Đái tháo đường là một căn
bệnh mãn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm, có thể dẫn đến tử vong. Gánh
nặng bệnh tật do đái tháo đường đang tăng lên trên toàn cầu, đặc biệt là ở các
nước đang phát triển, nơi quá trình đô thị hóa đang làm thay đổi tập quán ăn
uống, giảm hoạt động thể lực và tăng cân. Theo WHO, năm 1985 thế giới có
khoảng 30 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, năm 2004 con số này đã là 98,9
triệu và dự đoán vào năm 2025 số bệnh nhân ĐTĐ trên toàn thế giới vào khoảng

300 - 330 triệu người, chiếm tỉ lệ khoảng 5,4% dân số toàn cầu. trong đó tỉ lệ
mắc bệnh ở các nước đang phát triển tăng 42% và tỉ lệ ở các nước này tăng lên
170% vào năm 2025 (Tạ Văn Bình và ctv., 2007).
Bệnh đái tháo đường gây ra do rối loạn các enzyme chuyển hóa
carbohydrate trong cơ thể khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hoặc giảm
tác động, biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn bình thường. Trong các
enzyme chuyển hóa carbohydrate, enzyme a-amylase có vai trò thủy phân các
hợp chất polychaccharide tạo glucose, phản ứng này trực tiếp tăng hàm lượng
đường trong máu. Do đó, nếu có thể ức chế được enzyme này, việc điều trị bệnh
đái tháo đường sẽ dễ dàng hơn.
Bệnh đái tháo đường đến nay vẫn chưa có thuốc trị khỏi hoàn toàn.
Những loại thuốc trị bệnh đái tháo đường phải được uống thường xuyên và suốt
đời như: Meformin, sulfonylureas, glinides, chất ức chế enzyme a-glucosidase
(Acarbose), thiazolidinediones, insulin...(Nathan et al., 2006). Nhìn chung, các
liệu pháp này có tác dụng nhất định, công dụng chính của các nhóm thuốc này là
hạ đường huyết hoặc cung cấp insulin thay thế tạm thời cho người bệnh ĐTĐ.
Tuy nhiên hiệu quả điều trị chưa cao và gây ra nhiều tác dụng phụ như béo phì,
vàng da, suy đường huyết, ngộ độc gan...(Sudha et ai., 2011; Nathan et al.,
2006).
Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ tự nhiên được quan
tâm nghiên cứu vì rất an toàn và hiệu quả trong việc phòng và điều trị nhiều bệnh
ở người trong đó có bệnh đái tháo đường (Addis và Warner, 1991;
1


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

Halliwell,1994; Rice-Evans et al., 1997; Lu và Foo, 2000). Trong dân gian, các

bộ phận của cây Nhàu đã được sử dụng như một loại thuốc trị bệnh ĐTĐ. Các
nghiên cứu cũng đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của cao chiết Nhàu
trên chuột bệnh (Võ Thị Ngọc Diễm và ctv, 2012).
Đề tài “Khảo sát khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao chiết lá
Nhàu (Morỉnda citrifolia L.)” được thực hiện nhằm đánh giá một cách khoa học
tác dụng hạ đường huyết của lá Nhàu trên invitro. Từ đó làm rõ cơ chế hạ đường
huyết của cao chiết lá Nhàu.
Mục tiêu của đề tài đánh giá khả năng ức chế enzyme a-amylase của cao
chiết lá Nhàu trong phản ứng chuyển hóa tinh bột.

2


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

PHÀN 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1. Đại cương về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)
1.1 Định nghĩa bệnh đái tháo đường
Bệnh đái tháo đường (diabetes mellitus - DM) được định nghĩa là một
nhóm các bệnh chuyển hóa được đặc trưng bởi tăng đường huyết mãn tính, do
hậu quả từ tình trạng thiếu insulin tuyệt đối hay tương đối của tuyến tụy. Biểu
hiện đặc trưng của bệnh là tình trạng tăng đường huyết cùng rối loạn các chuyển
hóa carbohydrate. Rối loạn này có thể đưa đến các biến chứng cấp tính, các tình
trạng dễ bị nhiễm trùng và lâu dài sẽ gây ra các biến chứng ở các mạch máu nhỏ
và mạch máu lớn (Nguyễn Thị Bay, 2007). Đái tháo đường cũng là một phức hợp
rối loạn các chuyển hóa lipid, protein (Nguyễn Huy Cường, 2005).
l ễ2 Phân loại bệnh đái tháo đường
Theo phân loại của WHO năm 1999, thì bệnh đái tháo đường có những

thể loại sau:
l ễ2ếl Bệnh đái tháo đường loại 1: đái tháo đường phụ thuộc insulin
Nguyên nhân do tế bào p bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt insulin tuyệt
đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn). Đái tháo đường
loại 1 chiếm tỷ lệ khoảng 5-10% bệnh đái tháo đường trên thế giới.
Đái tháo đường loại 1 phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen (di truyền) và
thường được phát hiện trước 40 tuổi. Đa số các trường hợp được chẩn đoán bệnh
đái tháo đường loại 1 thường là người có thể trạng gầy, tuy nhiên người béo cũng
không loại trừ. Người bệnh đái tháo đường loại 1 sẽ có đời sống phụ thuộc
insulin hoàn toàn.
1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 2: đái tháo đường không phụ thuộc
insulin
Nguyên nhân do kháng insulin ở cơ quan đích, kèm theo suy giảm chức
năng tế bào p hoặc do suy giảm chức năng tế bào p kèm theo kháng insulin của
cơ quan đích. Tùy trường hợp cụ thể mà một trong hai trường hợp trên nổi trội
hoặc cả hai. Đái tháo đường loại 2 chiếm tỷ lệ khoảng 90% đái tháo đường trên
thế giới. (Zimmet et a l, 2001).
3


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

Đái tháo đường loại 2 không phụ thuộc nhiều vào yếu tố di truyền, và
thường được phát hiện sau 40 tuổi (Nguyễn Thị Bay, 2007). Người mắc bệnh đái
tháo đường loại 2 thường có thể trạng béo. Bệnh đái tháo đường loại 2 có thể
điều trị bằng cách thay đổi thói quen ăn uống, hoạt động kết hợp dùng thuốc để
kiểm soát đường huyết, tuy nhiên nếu quá trình này thực hiện không tốt thì bệnh
nhân cũng sẽ phải điều trị bằng cách dùng insulin.

l ễ3 Tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh đái tháo đường
Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán đái tháo đường là dựa trên nồng độ
glucose huyết tương lúc đói (tức là không ăn qua đêm hoặc ít nhất sau khi ăn 8
giờ). Năm 1998, WHO đã công nhận tiêu chuẩn chẩn đoán do Hiệp Hội ĐTĐ Mỹ
đề nghị là: Nồng độ glucose huyết tương bất kỳ > 200 mg/dl, kèm theo các triệu
chứng của tăng đường máu. Glucose huyết tương lúc đói > 126 mg/dl.
1.4 Điều tri
Với người bệnh đái tháo đường việc kiểm soát đường huyết ổn định là vô
cùng quan trọng. Nếu như việc thay đổi thói quen ăn uống và luyện tập chưa
kiểm soát tốt được mức đường huyết thì cần phải kết hợp với dùng thuốc. Xét
cho cùng mục đích chính của việc điều trị đái tháo đường hiện tại là làm ổn định
lượng đường trong máu. Đối với bệnh nhân đái tháo đường loại 1 thì chỉ có một
phương pháp là dùng insulin. Insulin là một nội tiết tố của cơ thể, có khả năng
làm hạ đường huyết.
Insulin được tế bào p của tụy Langerhans tiết ra. Việc bài tiết insulin của
cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó sự thay đổi đường huyết có vai trò
quan trọng. Ở người bệnh đái tháo đường, khả năng bài tiết insulin của cơ thể
giảm hoặc không còn là nguyên nhân làm cho đường máu tăng cao.
Một số nhóm thuốc được dùng trong điều trị đái tháo đường
Nhóm Biguanide (như Metformin với biệt dược là Siofor 500 mg, 850
mg) tác dụng chủ yếu là ức chế sản xuất đường tò gan và tăng tính nhạy cảm của
cơ thể đối với insulin, hiệu quả là làm giảm đường huyết.
Nhóm Sulfonylurea (như Diamicron MR 30 mg) tác dụng kích thích
tuyến tụy tăng tiết insulin để làm hạ đường huyết, tác dụng phụ hay gặp là hạ
đường huyết quá mức.
4


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

Nhóm ức chế a-glucosidase (như Acarbose 50 mg, 100 mg) tác dụng tại
ruột non làm chậm hấp thu do đó làm thấp đường huyết sau ăn.
Nhóm Meglitinide (các chế phẩm như Repaglinide và Nateglinide) có cơ
chế tác dụng gần giống như nhóm Sulfonylurea.
Nhóm Thiazolidinnedione Thuốc đang được dùng là Rosiglitazone và
Pioglitazone, nhóm này tác dụng nên nhiều khâu trong cơ chế bệnh sinh của đái
tháo đường loại 2 (cả kháng insulin và cải thiện chức năng tế bào P).
Việc kiểm soát khẩu phần ăn và chế độ hoạt động cũng góp phần giúp
người bệnh không gia tăng lượng đường trong máu. Kiểm soát khẩu phần ăn
không cung cấp nhiều glucose hay kiểm soát quá trình tiêu hóa tạo glucose từ
thức ăn. Đe không tăng glucose đột biến sau bữa ăn là một trong những liệu pháp
cho người đái tháo đường.
1.6 Tình hình nghiên cứu chữa đái tháo đường bằng thảo dược
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy các thảo dược có khả năng hỗ trợ
điều trị bệnh ĐTĐ như lá ổi (Psidum guyjava L.) của Oh et al., (2003), Trái ổi
(Psidum guyjava L.) của Yusof et al., (2007), mướp đắng (Momordica
charantỉa), cỏ cari (trigonella foenum graecum) của Tripaứii et al., và rất nhiều
công trình khác đã chứng minh tác dụng làm hạ đường huyết của các loai thảo
dược. Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu liên quan đến bệnh đái tháo đường. Tuy
nhiên các nghiên cứu khoa học về dược liệu dân gian sử dụng trong hỗ trợ điều
trị bệnh đái tháo đường còn rất ít. Công trình nghiên cứu của Võ Thị Ngọc Diễm
và ctv, 2012 cũng đã chứng minh cao lá Nhàu có khả năng làm hạ đường huyết
trên chuột bạch bệnh đái tháo đường.
2. Enzyme a-amylase
2ếl Giới thiệu chung về a-amylase
Tên thay thế: 1,4-a-glucan-glucanhydrolase glycogenase
Mã số enzyme: EC 3.2.1.1
a-amylase (EC 3.2.1.1) là một enzyme quan trọng trong hệ thống tiêu

hóa và xúc tác bước đầu tiên trong thủy phân tinh bột tạo ra một hỗn hợp của
oligosaccharides nhỏ hơn bao gồm maltose, maltotriose và một số a-(l-6) và a-

5


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

(1-4) oligoglucans (Sudha et al., 2011). Do sự tác động lên các liên kết 1,4-0
glycoside.
Trong cơ thể người và hầu hết các động vật có vú dạng chủ yếu của
amylase là a-amylase. Ở người a-amylase có trong nước bọt và dịch tụy. Phần
lớn các enzyme amylase sử dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm ngày
nay điều có nguồn gốc tò vi sinh vật (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2ẵ2 Thành phần hệ enzyme amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử
trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. Có 6 loại enzyme được
xếp vào 2 nhóm là endoamylase và exoamylase.
Endoamylase (enzyme nội phân tử) gồm có a-amylase và nhóm enzyme
khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại. Khử trực tiếp
là Pullulanase (hay a-dextrin 6-glucosidase), khử gián tiếp là transglucosylase
(hay oligo-l,6-glucosidase) và maylo-l,6-glucosidase. Các enzyme này thủy
phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase (enzyme ngoại phân tò) gồm có P-amylase và y-amylase.
Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi
polysaccharide (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen.

2.3 Đặc tính của enzym a-amylase
a-amylase tò các nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau,
mỗi loại a-amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, a-amylase là một
protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và
aspartic acid chiếm khoảng lÁ tổng lượng acid amin cấu thành nên phân tử
enzyme.
a-amylase có ít methionine và có khoảng 7 - 1 0 gốc cysteine. Trọng
lượng phân tử của a-amylase nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Protein của các aamylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm
trong vùng pH 4,2 - 5,7. Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và
rượu loãng (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
6


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

a-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử a-amylase đều có chứa 130 nguyên tò gram Ca/mol. Canxi tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc
bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme. Do đó, canxi còn có vai trò duy
trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác
động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử a-amylase bị loại bỏ hết
canxi thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất, a-amylase bền
với nhiệt độ hơn các enzyme khác (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+,
Ag+, Hg+. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+
không có ảnh hưởng đến a-amylase (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Thành phần amino acid của a-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau
(g/100 g protein): Alanine = 6,8, glycine = 6,6, valine = 6,9, leucine = 8,3,
Isoleucine = 5,2, prolin = 4,2, phenylalanine = 4,2, tyrosine = 9,5, trytophan =
4,0, xetin = 6,5, trionin = 10,7, cystein + cystine = 1,6, glutamic acid= 6,9,

amide= 1,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Điều kiện hoạt động của a-amylase tò các nguồn khác nhau thường
không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của a-amylase từ nấm sợi là 4,0 4,8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt
động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng
5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin
hóa của nó là 6,0 - 7,0 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). a-amylase trích tò tụy heo có
vùng pH hoạt động trong khoảng 5,5 - 8, pH tối thích là 7 (www.sigmaaldrich.com/enzymeexplorer). pH tối thích cho hoạt động của a-amylase trích từ
mầm lúa là 5,3 (Nguyễn Minh Chơn và ctv, 2005).
2.4 Cơ chế tác dụng của enzym a-amylase trong phản ứng thủy phân
Enzyme a-amylase có khả năng phân cách các liên kết a-l,4-glucoside
nằm ở phía bên trong phần tò cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào cả. a-amylase không chỉ thủy phân hồ tình bột
mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy
phân tinh bột bởi a-amylase là quá trình đa giai đoạn (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
7


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa), chỉ một số phân tử cơ chất bị
thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (a-dextrin), độ nhớt của
hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa), các dextrin phân tử thấp tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine.
Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi a-amylase cho tới disaccharide và
monosaccharide. Dưới tác dụng của a-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh
thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng aamylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1). Sau

đó, các polyglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose
colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và
maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa
13% glucose và 87% maltose.
Tác dụng của a-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì
không phân cắt được liên kết a-l, 6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các
đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và
isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của a-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường
a-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không
cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của a-amylase
là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là
amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
4. Sơ lược về cây Nhàu
Tên khoa học: Morinda citrifolia L.
Tên khác: Cây ngao, nhàu rừng, nhàu núi
Tên nước ngoài: Indian mulberrry, eats indian muberry, awl tree (tiếng Anh);
morinde (Pháp)

8


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

Hình 1: Cây Nhàu.
4.1 Phân loại

• Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
• Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
• Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)
• Bộ: Cà phê (Gentianales)
• Họ: Cà Phê (Rubiaceae)
• Giống: Morinda
• Loài: Morỉnda citrifolia L. (Phạm Hoàng Hộ, 2003)
4.2 Đặc điểm hình thái và phân bố
Nhàu là cây thân gỗ, cao từ 6 - 8 m, lá mọc đối có hình bầu dục, đầu
nhọn, dài khoảng 12-15 cm, rộng 6 - 8 cm. Mặt trên lá màu xanh lục bóng, mặt
dưới của lá nhạt. Lá kèm to khoảng 0,8 - 1,3 cm. Hoa Nhàu có màu trắng về sau
vàng nhạt, thường kết thành khối và dính bởi đài. Quả thịt gồm nhiều quả hạch
dính vào nhau, hình trứng, dài khoảng 3 - 4,5 cm. Khi chín màu trắng vàng hoặc
hồng nhạt, mặt ngoài lồi lõm. Chứa một lớp cơm mềm, ăn được, hạt nhiều, vị
cay, nồng, khó ngửi. Mùa hoa Nhàu tháng 11-2, mùa quả: tháng 3 - 5.
Cây Nhàu có nguồn gốc từ Nam Á (Indonesia) và ú c Châu, phân bố ở
Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam... Ở nước ta, Nhàu mọc nhiều ở những vùng ẩm

9


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

thấp dọc theo bờ sông, suối, ao hồ hoặc mương rạch ở khắp các tỉnh miền Nam
và một số tỉnh miền Trungễ
4ế3 Thành phần hóa học có trong cây nhàu
Rễ Nhàu chứa morindin là một anthraquinoic kết tinh thành tinh thể hình
kim, màu vàng cam, tan trong nước sôi và các chất kiềm, ít tan trong nước lạnh,

không tan trong ether. Ngoài ra, còn có L-metoxyrubiazin, morindon, alizarin và
l-oxy-2,3 dimetoxy anthraquinon (Trương Thị Đẹp, 2007).
Vỏ rễ Nhàu chứa morindon (trihydroxy-methylanthraquinon), chủ yếu
dưới dạng glucoside là morindin. Sự thủy phân morindin cho glucose, rhamnose
và morindon. Ngoài ra rễ còn chứa acid rubicloric, alizarin a-methyl ether,
rubiadin-1-methyl ether, 2 đồng phân dihydroxymethyl anthraquinon (moridadiol
và soranjidion) và 2 trihydroxymeứiyl anthraquinon monomethyl ether và salen
(Đỗ Huy Bích và ctv, 2003).
Ngoài ra, trong rễ Nhàu còn chứa một số hợp chất khác như: 2-methyl-7hydroxy-8-methoxy
hydroxyanthraquinon

anthraquinon,
(monrenon-1),

2-methyl-3,

5-dimethoxy-6-

l,8-dihydroxy-7-methoxy-anthraquinon

(monrenon-2), l-methoxy-2-formyl-3-hydroxyanthraquinon (Đỗ Huy Bích và
ctv, 2003).
Hoa Nhàu chứa anthraquinon glycosid, 2-flavon glycosid, 5,7-acacetin 7-0-P-D(+)-galactopyranosid (Jagdamba et al., 1976). Quả chứa ít tinh dầu trong
đó gồm: acid hexoic, acid octoic, một ít parafin và các ester của các alcol ethylic
và methylic (Đỗ Huy Bích và ctv, 2003).
Lõi gỗ Nhàu có chứa chất anthraquinon glycosid là physcion-8-0- [(a-Larabinopyranosyl(l ->3)] (P-D-galactopyranosyl(l -^6)-P-D galactopyranossid).
Ngoài ra còn có physcion và morindon (Đỗ Huy Bích và ctv, 2003).
4ế3 Tác dụng dược lý của cây Nhàu
Trong ngành y học cổ truyền, Nhàu được xem là một loại cây thuốc quý.
Hầu hết các bộ phận của cây Nhàu đều có thể làm thuốc (Đỗ Tất Lợi, 2005). Các

bộ phận của cây Nhàu được sử dụng làm thuốc là hoa, trái, thân, rễ và cả lá
Nhàu.

10


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

Dược tính của tinh chất rễ Nhàu được biết có tác dụng nhuận trường nhẹ
và lợi tiểu nhẹ, làm êm dịu thần kinh, hạ huyết áp kéo dài, rất ít độc và không
làm nghiện (Đỗ Huy Bích và ctv, 2003).
Ngoài tác dụng ổn định huyết áp qua cơ chế thần kinh, tác dụng thông
kinh hoạt huyết cũng ảnh hưởng rất lớn đến việc cải thiện tuần hoàn huyết nên rễ
Nhàu vẫn đang là một vị thuốc Nam thông dụng được dùng phối hợp với những
vị thuốc khác để chữa trị các chứng cao huyết áp.
Các nghiên cứu cũng đã chứng minh tác dụng chống ung thư của Nhàu,
hai chất được phân lập tò rễ Nhàu là Damnacathal và Nordamnacathal có tác
dụng gây độc ở cả hai dòng tế bào ung thư: dòng ung thư tế bào tiết hắc tố B16
và ung thư máu dòng L. 1210 (Đỗ Quốc Việt và ctv, 1998). Ngoài ra
Damnacathal trong rễ Nhàu là một tác nhân kìm hãm chức năng của gen ras-gen
gây ung thư phổi, một kết, và tuyến tụy (Hiramatsu et al., 1993)
Rễ nhàu có tác dụng ức chế nhẹ. Những người thường hay bị căng thẳng,
tâm lý dễ bực bội, cáu gắt, khó ngủ, khi dùng rễ Nhàu có thể cảm thấy thần kinh
được êm dịu, thư giãn, dễ ngủ. Một số bệnh nhân bình thường hay lo sợ vu vơ,
buồn bực, than vãn thì nước sắc rễ Nhàu có thể làm cho họ cảm thấy tươi tỉnh lạc
quan hơn. Tác dụng tự điều chỉnh giữa hưng phấn và ức chế. Rễ nhàu có phạm vi
sử dụng an toàn khá rộng. (Đỗ Huy Bích và ctv, 2003).

11


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

PHÀN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
1. Phương tiện
1.1 Đỉa
điểm và thòi ogian thưc
hiên
•
•
•
Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Sinh Học và phòng thí nghiệm
Hóa Học-khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử-Viện
Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học cần Thơ.
Thời gian thực hiện: Từ tháng 8/2012 đến tháng 4/2013.
l ễ2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
l ệ2ệl Mẩu vât
Lá Nhàu (Morinda citrifolia L.) thu tại khu vực TP cần Thơ.
l ẽ2ề2 Hóa chất
Ethanol 96° (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), ethyl acetate (Trung
Quốc), petroleum ether (Trung Quốc), NaH2P 0 4 (Trung Quốc), Na2HP0 4 (Trung
Quốc), HC1 (Trung Quốc), iodine, KI (postassium iodide), DMSO (dimethyl
sulfoxid), Acarbose (Wako), enzyme a-amylase tò tụy heo (SIGMA), tình bột
(Trung Quốc).
l ề2ế3 Dụng cụ
Máy đo quang phổ Beckman Coulter 640B (Mỹ), máy cô quay chân

không Heidolph (Đức), máy đo pH Metier Toledo, máy khuấy từ, máy vortex,
máy ổn định nhiệt, cân phân tích AB104 (Switzerland), bình lắng, eppendorf,
micropipette và một số dụng cụ khác.
2. Phương pháp thí nghiệm
2ếl Phương pháp chiết và tách cao
2Ế1.1 Ly trích cao lá Nhàu bằng dung môi ethanol
Lá nhàu được xác định và thu mẫu dựa vào các đặc điểm hình thái của cây
Nhàu và tham khảo tài liệu từ bộ sách cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ
(2003) để định danh. Chỉ chọn những lá có màu xanh, không chọn những lá còn
quá non hay quá già. Lá Nhàu sau khi thu hái đem về được loại bỏ phần sâu
bệnh, rửa sạch, đễ ráo cân trọng lượng tươi, sau đó phơi khô cho đến khi trọng
lượng không đổi và cân lại lần nữa để xác định trọng lượng mẫu khô. Độ ẩm của
12


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

nguyên liệu là sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô và được
tính theo công thức sau:

Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô
—

-------------- ------------------------------ -------------- -----------------------

X

100 %

Trọng lượng tươi

Lá Nhàu sau khi nghiền nhỏ được ngâm với dung môi ethanol 96° trong
7 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau 7 ngày, phần dịch trích được lọc và cô cạn bằng hệ
thống máy cô quay để loại bỏ dung môi ethanol và thu được cao ethanol lá nhàu.
Cao ethanol từ lá Nhàu được trữ ở 4°c để sử dụng cho thí nghiệm sau.
2.1.2 Tách phân đoạn cao ethanol lá Nhàu
Lấy 6 g cao ethanol lá Nhàu hòa tan
trong một ít nước nóng, khuấy mạnh để tạo
thành hỗn hợp sệt. Hỗn hợp này được lắc
tách với petroleum ether (PE), mỗi lần cho
khoảng 20 ml PE rồi lắc, thu lấy dịch
petroleum ether và tiếp tục cho 20 ml PE
vào phần dịch còn lại lắc đến khi phần PE
tách lớp trong suốt (lặp lại khoảng 10 lần).
Cô quay phần dịch petroleum ether để loại
dung môi dưới áp suất kém thu được
„
2,3845 g cao thô petroleum ether (cao PE).

Hình 2: Tách phân đoan cao ethanol

Phần dung dịch còn lại sau khi trải qua tách với petroleum ether tiếp tục lắc
với dung môi ethyl acetate (EA), thực hiện tương tự như khi tách với dung môi
petroleum ether. Thu được 1,2 g cao thô ethyl acetate (cao EA). Tương tự như
trên tách tiếp trong dung môi n-butanol. Thu được 1,0263 g cao butanol (cao
BuOH).
Phần dung dịch còn lại sau khi tách với dung môi n-butanol là cao nước,
sau khi đã trừ trọng lượng của nước thu được 0,18 g cao nước.

13


Luận văn tốt nghiệp

Sinh học K35

Hình 3: Cô quay dịch trích thu được sau khi đã lắc cao với dung môi

Hình 4: Sơ đồ tách phân đoạn cao từ cao ethanol lá nhàu

14