Phân lập vi khuẩn Bacillis từ đất khảo sát khả năng ức chế sản sinh Aflatoxin của các chủng phân lập
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.21 MB, 76 trang )
i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ
NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
ĐƢỢC
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: PHẠM HOÀNG THÁI
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007
ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT,
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN
CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM HOÀNG THÁI
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007
iii
LỜI CẢM TẠ
Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ của ba, má và những người
thân trong gia đình đã cho con có được ngày hôm nay.
Chân thành cảm ơn
Ban chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý thầy cô đã
tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Chân thành biết ơn sâu sắc đến các quý thầy cô
Ts. Nguyễn Ngọc Hải
Ts. Lê Anh Phụng
Cô Nguyễn Thị Kim Loan
đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Chân thành cảm
ơn toàn thể bạn bè đã động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và
thực hiện đề tài.
iv
TÓM TẮT LUẬN VĂN
Qua thời gian thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất,
khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập đƣợc.” từ
tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại Phòng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Nuôi-Thú Y,
chúng tôi có những kết luận sau:
- Có thể phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất với tỷ lệ 8,16 %.
- Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
phân lập được từ đất trên môi truờng thạch nước cốt dừa: sau 7 ngày nuôi cấy chung
Bacillus subtilis và Aspergillus flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên
ngoài và dưới ánh đèn tia cực tím (UV) cho thấy một số chủng có khả năng ức chế sinh
trưởng và sản sinh aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus.
- Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
phân lập được từ đất: môi trường bắp sau 7 ngày nuôi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi
khuẩn , ghi nhận một số chủng có khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp so
với mẫu đối chứng chỉ có bào tử Aspergillus flavus không có bào tử Bacillus subtilis.
- Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy giữa bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ảnh
hưởng đến khả năng sản sinh aflatoxin trên môi trường bắp phối trộn tỷ lệ bào tử nấm
mốc/bào tử vi khuẩn là 1/10
3
, 1/10
4
và 1/10
5
. Sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy khi tỷ lệ
bào tử vi khuẩn tăng lên thì tăng khả năng làm giảm aflatoxin.
- Nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin có xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis gây chết vịt
ít hơn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin nhưng không xử lý với vi khuẩn.
v
SUMMARY
The thesis: “ Isolation of Bacillus subtilis in soil and survey their ability in
inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize.” The thesis
Bacillus subtilis in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize
and in protection of duck frome aflatoxin infection was carried out in Microbiology
and Infections Diseases Department of Freulty of Animal sciences and Veterinary,
Nong Lam University, Ho Chi Minh cty frome 03/2007 to 08/2007.
The results showed:
- Bacillus subtilis could inhibite the aflatoxin production of Aspergillus flavus
on maize in times.
- Bacillus subtilis treatment could reduce the neortility rate, health affect of the
ducks fed with 100 ppb aflatoxin containated maize.
vi
MỤC LỤC
CHƢƠNG TRANG
Trang bìa 1…………………………………………………………………........….......i
Trang bìa 2………………………………………………………………........……......ii
LỜI CẢM TẠ………………………………………………………….......……….....iii
MỤC LỤC…………………………………………………………….……........….....iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT…………………………………………...........ix
DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………….......…..x
DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………….......…..xi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ……………………………………………………..........xii
TÓM TẮT LUẬN VĂN….…………………………………………….…….......….xiii
1. MỞ ĐẦU………………………………………………………………….…........…1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ….....………………………………………………...…..........……1
1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI….........…………………………………………...........……2
1.3. YÊU CẦU ĐỀ TÀI………….........………………………………..…..........….…2
2. TỔNG QUAN…………………………..............………………………..….........…3
2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS…….......................…….3
2.1.1. Lịch sử phát hiện………………………………………………..........................3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis....................3
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại……………………………............….……………......….3
2.1.2.2. Sự phân bố…………………………………………………..................……...4
2.1.3. Đặc điểm hình thái………………….…………………………….............…….4
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy………………………………………………........….....…...4
vii
2.1.5. Đặc điểm sinh hóa………………………………………......……......................5
2.1.6. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên………………………......…...…..................6
2.1.7. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis………………………….....……...................7
2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử…………………………………………..........….......…..7
2.1.7.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử………………………..........…….......…...8
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh.................9
2.1.9. Những nghiên cứu về tác dụng đố kháng Aspergillus của Bacillus subtilis...11
2.2. KHÁI QUÁT VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN……...…..........12
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc……………………………………….............…….....12
2.2.2. Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin…………….......................................12
2.2.3. Độc tố aflatoxin…………………………………..............................................13
2.2.3.1. Các loại độc tố aflatoxin……………………….............................................13
2.2.3.2. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin…………………….......................................14
2.2.3.3. Những tác hại do aflatoxin gây ra…………………….................................14
2.2.3.4. Các phƣơng pháp phân hủy aflatoxin………………………...………........15
3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH..................................................19
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM................................................................................19
3.1.1. Thời gian ............................................................................................................19
3.1.2. Địa điểm..............................................................................................................19
3.2. ĐỐI TƢỢNG KHẢO SÁT...................................................................................19
3.3. THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM ................................................................19
3.4. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY................................................................................20
3.4.1. Môi trƣờng tự nhiên ..........................................................................................20
3.4.2. Môi trƣờng tổng hợp.........................................................................................20
viii
3.5. NỘI DUNG...........................................................................................................20
3.6. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU...............................................20
3.6.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất.......................................................20
3.6.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn........................................................20
3.6.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................21
3.6.2. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc..............................21
3.6.2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi.............................................21
3.6.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập đƣợc…………....22
3.6.3. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc
Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các
chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc........................................................................22
3.6.3.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốcAspergillusflavus..22
3.6.3.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các
chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc………………………………..…………..…23
3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi
trƣờng bắp của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc……..…........23
3.6.4.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc
Aspergillus flavus………………………………………………………………...….. 23
3.6.4.1.1. Phƣơng pháp thu hoạch bào tử nấm mốc Aspergillus flavus...................23
3.6.4.1.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử nấm mốc
Aspergillus flavus……………………………………………………………………..24
3.6.4.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn
Bacillus subtilis.............................................................................................................24
3.6.4.2.1. Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩnBacillus subtilis…24
ix
3.6.4.2.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis..........25
3.6.4.3. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................26
3.6.4.3.1. Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trƣớc khi tiến hành thí nghiệm……….26
3.6.4.3.2. Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và bào tử nấm
Aspergillus flavus trên môi trƣờng nguyên liệu bắp..................................................26
3.6.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi
khuẩn đối với sự sản sinh aflatoxin............................................................................27
3.6.5.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc
Aspergillus flavus..........................................................................................................28
3.6.5.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn
Bacillus subtilis.............................................................................................................28
3.6.5.3. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................28
3.6.6. Thí nghiệm 4: Thử mức độ an toàn của ngƣyên liệu bắp đã nhiễm
aflatoxin sau khi xử lý bằng vi khuẩn Bacillus subtilis (có khả năng ức chế
aflatoxin) trên vịt..........................................................................................................29
3.7. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU……………………………………….....30
3.8. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU....................................................................30
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………………..31
4.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS………...31
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis……………..…..31
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis sau
nhuộm Gram………………………………………………………………………….32
4.1.3. Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillussubtilis..32
x
4.2.THÍ NGHIỆM 1: KIỂM TRA KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA
CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ KHẢ
NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG
BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC...............................................................35
4.2.1. Kiểm tra khả năng sinh khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc
Aspergillus flavus..........................................................................................................35
4.2.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng
Bacillus subtilis phân lập đƣợc……………………………………………..…..……35
4.3. THÍ NGHIỆM 2 : KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIẢM AFLATOXIN
SẢN SINH TRÊN MÔI TRƢỜNG BẮP CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS
SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC……………………………………...……………....38
4.4. THÍ NGHIỆM 3: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ BÀO TỬ
NẤM MỐC/BÀO TỬ VI KHUẨN ĐỐI VỚI SỰ SẢN SINH AFLATOXIN…….40
4.5. THÍ NGHIỆM 4: THỬ MỨC ĐỘ AN TOÀN CỦA NGHUYÊN LIỆU BẮP
ĐÃ NHIỄM AFLATOXIN SAU KHI XỬ LÝ BẰNG VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS (CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN) TRÊN VỊT NUÔI............43
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………...……….…..48
5.1. KẾT LUẬN……………………………………………………………..………..48
5.2. ĐỀ NGHỊ…………………………………………………………………...…….48
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………...……49
xi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt Nguyên chữ Nghĩa
ADN Acid Deoxyribonucleic
ARN Acid Ribonucleic
CFU Colony Formation Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc
ppb part per billion Phần triệu (mg/kg)
TLC Thin Layer Chromatography Phương pháp sắc ký lớp mỏng
UV Ultra Violet Tia cực tím
xii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus sutilis………………………............…. 6
Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào dinh dưỡng của Bacillus subtilis….........8
Bảng 2.3: Số lượng của Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cấy
(CFU/ml)........................................................................................................................10
Bảng 2.4: Khả năng ức chế aflatoxin B
1
của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
trong thí nghiệm của Norio Kimura………………………….................................…..12
Bảng 2.5: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin……………............…13
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm nghiệm 2............................................................................27
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 3………………………………………………………….28
Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập được……………...33
Bảng 4.2: So sánh khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của 8 chủng Bacillus subtilis...38
Bảng 4.3: Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin của thí nghiệm 2…………………..39
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm 3……………………………………...………………..41
Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm 4………………………………………...……………..43
Bảng 4.6: So sánh sự khác nhau về bệnh tích đại thể các mẫu gan vịt…………….....45
Bảng 4.7: Kết quả bệnh tích vi thể gan của vịt ở các lô thí nghiệm…………………...46
xiii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis……………………...…………...…..…….4
Hình 2.2: Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis……………………..………………….………..7
Hình 3.1: Nuôi cấy bào tử vi khuẩn và bào tử nấm mốc trên môi trường bắp………...28
Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis trên môi trường TSA…………....…...31
Hình 4.2: Hình dạng tế bào và bào tử của Bacillus subtilis sau khi nhuộm Gram…….32
Hình 4.3: Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis……..…………...34
Hình 4.4: Khuẩn lạc Aspergillus flavus sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường
thạch nước cốt dừa………………………………………………….…………....……35
Hình 4.5: Khuẩn lạc Aspergillus flavus tiếp xúc và chưa tiếp xúc với khuẩn
lạc Bacillus subtilis trên môi trường thạch nước cốt dừa...............................................36
Hình 4.6: Sự ức chế phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn đối với nấm mốc..…………....36
Hình 4.7: Vòng sáng aflatoxin không đều ở các phía của khuẩn lạc
Aspergillus flavus...........................................................................................................37
Hình 4.8: So sánh các mẫu bắp………………………………….……………….…....42
Hình 4.9: Kết quả thí nghiệm lô 2 sau 4 ngày…………………….……………….......44
Hình 4.10: Sự khác nhau giữa 2 mẫu gan vịt………………………………….……....45
Hình 4.11: Bệnh tích vi thể các mẫu gan vịt ở các lô thí nghiệm……………….….....47
xiv
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1: Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis………………….….22
Sơ đồ 3.2: Phương pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử Bacillus subtilis……………....25
Sơ đồ 3.3: Phương pháp xác định số lượng bào tử Bacillus subtilis………………………….26
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là một trong những nhóm độc chất tự nhiên do
các loài nấm mốc sản xuất ra trong quá trình phát triển trên các cơ chất, đặc biệt là
lương thực, thực phẩm dành cho con người và gia súc. Người ta đã phát hiện khoảng
3000 loại mycotoxin nhưng độc tố quan trọng nhất cho đến hiện nay là aflatoxin do
nấm mốc Aspergillus sản sinh. Aflatoxin không chỉ là độc tố gây nhiễm độc, gây rối
loạn chức năng, gây suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây chết gia súc,
gia cầm trong trường hợp nhiễm độc hàm lượng lớn. Aflatoxin cũng được chứng minh
là chất độc gây ung thư cho động vật thí nghiệm. Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm
thích hợp của nước ta, nếu không được bảo quản tốt thì các loại nguyên liệu cũng như
thức ăn gia súc thành phẩm rất dễ bị nhiễm các loại nấm mốc sinh aflatoxin. Một khi
điều đó xảy ra sẽ gây tổn thất rất lớn cho nhà chăn nuôi, ngành chăn nuôi nước nhà và
nguy hiểm hơn là ảnh hưởng gián tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng sản phẩm
chăn nuôi.
Xuất phát từ tình hình thực tế đó, đã có nhiều nghiên cứu khoa học trong và
ngoài nước được tiến hành nhằm giải quyết vấn đề này: như dùng nhiệt độ, ánh sáng,
chất oxy hóa để làm mất hiệu lực của aflatoxin, .... Một trong những xu hướng hiện nay
là áp dụng phương pháp vi sinh vật học. Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer,
2
Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus), nấm men
(Saccharomyces cerevisiae), xạ khuẩn đã được thử nghiệm về khả năng làm giảm
aflatoxin thu được kết quả cũng rất khả quan.
Được sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông
Lâm Tp.HCM, sự cho phép của phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi-Thú Y và dưới sự
hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập vi
khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các
chủng phân lập đƣợc.”
1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Phân lập, tìm ra chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế afltoxin để có thể
ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu, thức ăn gia súc thành phẩm.
1.3. YÊU CẦU ĐỀ TÀI
- Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất.
- Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của chủng vi khuẩn phân lập
được.
- Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin theo tỷ lệ nuôi cấy giữa bào tử của nấm
mốc và bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis.
- Thử nghiệm độ an toàn của nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin sau khi đã được
xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis thu được trên vịt nuôi.
3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN
2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức
y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh
sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.Việc ứng dụng điều trị phải đợi tới những năm 1949 - 1957
khi Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis.
Từ đó “subtilis therapy “ có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm
đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên
rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, (trích dẫn bởi Lê Văn Hiệp,
2004).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo đặc điểm phân loại của Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacterriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
4
2.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đường ruột,
chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất, nước, Phần lớn
chúng tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g.
Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm.
Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào
sinh dưỡng vi khuẩn Bacillus subtilis.
2.1.3. Đặc điểm hình thái
Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis
(
Vi khuẩn Bacillus subtilis có dạng trực khuẩn nhỏ và ngắn, hai đầu tròn, bắt
màu Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo
thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có từ 8 - 12 chiên mao, sinh bào tử
nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,9 - 0,6 µm. Vị trí của bào tử trong tế bào sinh
dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng
không chính tâm (trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng,1983).
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện nuôi cấy: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37
0
C.
- Nhu cầu O
2
: Bacillus subtillis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển
trong môi trường thiếu oxy.
5
- Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7 - 7,4.
- Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có
tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng sám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày
bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẩm.
- Trên môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu hơi xám, rìa gợn
sóng.
- Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng
nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều
khi lắc lên.
- Dinh dưỡng: cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác.
2.1.5. Đặc điểm sinh hóa
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose,
xylose, arabinose.
Indol (-), nitrate (-), MR-VP (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).
Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác
động của hemolysine.
6
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus sutilis
Phản ứng sinh hóa Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh indol -
MR +
VP +
Sử dụng citrate +
Khử nitrate +
Tan chảy gelatin +
Di động +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
Mantose +
(Theo Holt, 1992)
2.1.6. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên
Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L
của acid glutamic.
Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-
.
Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh.
7
2.1.7. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử vi khuẩn là một kết cấu do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai
đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Mỗi tế bào chỉ tạo thành một
bào tử (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Bào tử
Hình 2.2: Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
(
2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có
nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất
hòa tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một
khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì
vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai phương, 2004).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hóa học và tính chất sinh
lý.
8
Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào dinh dƣỡng của Bacillus subtilis
Đặc tính Tế bào sinh dƣỡng Bào tử
Cấu trúc Tế bào G+, điển hình Vỏ bào tử dày, khó thấm
nước
Thành phần hóa học
Canxi Thấp Cao
Protein Thấp hơn Cao hơn
Hoạt tính enzyme Cao Thấp
Khả năng chịu nhiệt Yếu Cao
Chịu bức xạ Kém Mạnh
Hoạt tính các chất hóa học
và acid
Yếu Cao
Khả năng bắt màu chất
nhuộm
Dễ nhuộm Phải dùng phương pháp đặc
biệt
(trích dẫn bởi Tô Minh Châu, 2000)
2.1.7.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử
Bào tử vi khuẩn không phải là một bộ phận làm chức năng sinh sản mà chỉ là
một thể biến đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn.
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân tố bất
lợi của ngoại cảnh.
Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử là do
chúng có các đặc tính sau:
- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm
biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
- Do trong bào tử có một lượng lớn ion Ca
++
và acid dipicolinic. Protein trong
bào tử kết hợp với dipicolinat canxi tạo thành một phức chất có tính ổn định cao đối
với nhiệt độ.
- Các enzyme và các họat chất sinh học khác trong bào tử đều tồn tại dưới dạng
không hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của bào tử với môi trường bên ngoài
9
- Sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặt biệt là cysteine giúp bào tử
đề kháng với tia cực tím .
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng ,
làm cho các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào tử .
Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào
mới có sức sống mạnh mẽ hơn (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh
Mỗi loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau,
sinh khuẩn lạc khác nhau.
Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là thay đổi điều
kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế, khi môi trường
nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra
sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh không gian giữa vi khuẩn và nấm. Do vi
khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng
trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm
bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn Lý Kim Hữu,
2005).
Phương thức diệt nấm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus subtilis
như sau:
- Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây
bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh.
- Sau đó, Bacillus tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi là serenade)
để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn
sự phát triển của chúng. Serenade có thể được bảo quản, sử dụng như một loại thuốc
trừ sâu hóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm là
không gây độc đối với cá hồi, ong mật, chim cút, sâu đất và nhiều loài khác. Serenade
gồm 3 nhóm lipopeptid có tên là surfactin, agrastatin và iturin. Ba nhóm này kết hợp
với nhau để làm tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nấm mốc
và cả bào tử gây bệnh của chúng.
10
Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid. Bản thân
surfactin không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất
diệt nấm. Surfactin có khả năng làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây bệnh và
bào tử của chúng, giúp cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng.
Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống như
surfactin và iturin.
Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng hất trong quá trình diệt nấm, bản
chất là lipopeptide được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis. Inturin
diệt nấm bằng cách tác dụng lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành những lỗ
thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng.
Ngoài nấm gây bệnh ra thì Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh như Escherichia coli. Khi nuôi cấy chung trên môi trường TSB thì Bacillus
subtilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên sẽ ức chế quá trình sinh
trưởng và phát triển của Escherichia coli, điều đó được thể hiện trong bảng 2.3 qua số
lượng Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cấy (trích dẫn bởi
Nguyễn Huỳnh Nam, 2006).
Bảng 2.3: Số lượng của Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cấy
(CFU/ml)
Thời gian (giờ)
Mẫu
0
12 24 36
Mẫu thí nghiệm 1 4,45.10
10
29,80.10
8
15,75.10
7
<10
6
2 4,45.10
10
19,95.10
8
9,55.10
7
<10
6
3 4,45.10
10
17,26.10
8
8,30.10
7
<10
6
4 4,45.10
10
19,95.10
8
13,67.10
7
<10
6
5 4,45.10
10
23,40.10
8
2,60.10
7
<10
6
Mẫu đối chứng 4,45.10
10
22,15.10
11
61,76.10
11
23.10
12
Ghi chú:
- Mẫu thí nghiệm: môi trường TSB chứa Bacillus subtilis và Escherichia coli.
- Mẫu đối chứng: môi trường TSB chứa Escherichia coli.
11
2.1.9. Những nghiên cứu về tác dụng đối kháng Aspergillus của Bacillus subtilis
Trong nuớc
Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của
chủng Bacillus subtilis AO
1
với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết
quả là có sự ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995).
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis
để ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus, Aspergillus
parasiticus trên đậu phộng (trích dẫn bởi Lâm Thanh Thúy Trân, 1995).
Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của
chủng Bacillus subtilis AO
1
(do Trung tâm công nghệ sinh học thuộc liên hiệp sản xuất
hóa chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch khoai tây-glucose và
kết quả đạt được rất khả quan.
Ngoài nƣớc
Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của một số chủng
vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thực hiện với Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus.
Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát
triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên đậu
phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát
triển của nấm mốc và tống hợp aflatoxin.
Khả năng ức chế aflatoxin B
1
của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong thí
nghiệm của Norio Kimura.
