Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào e coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cyp264b1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------------------

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI
TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA
MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------------------

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ
HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA
MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÝ THỊ BÍCH THỦY

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây là do tôi và nhóm
cộng sự nghiên cứu tại phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm
2014 đến tháng 5 năm 2015.
Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201…
Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lý
Thị Bích Thủy – Nghiên cứu viên phòng Sinh hóa thực vật – Viên Công nghệ sinh
học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hƣớng nghiên cứu,

hƣớng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa chất và thiết bị trong suốt thời gian tôi
thực hiện luận văn tại phòng.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Đoàn Hữu Thanh và các cô chú, anh
chị cán bộ phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và đóng góp
nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo
trong nhà trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện
Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Tôi cũng xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia
(NAFOSTED) đã cung cấp kinh phí để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này trong đề
tài mã số 106-NN.02-2013.57.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những
ngƣời đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện luận văn này.
Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201…
Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




CÁC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Giải thích

µg

Micro gram

µM

Micromol

µl

Microlit

AdR

Adrenodoxin reductase

Adx

Adrenodoxin

APS

Amonium persulphate

bp

Base pair

CYP

Cytochrome P450

CPR

Cytochrcome P450 reductase

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

FAD

Flavin adenin dinucleotid

Fdx

Ferredoxin

FdR

Ferredoxin reductase

Fldx

Flavodoxin

FMN

Flavin mononucleotide

GCMS

Gas chromatography mass spectometry

HPLC

High pressure liquid chromatography

IPTG

Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

kDa

Kilo dalton

KppG

Kali phosphate glycerol

LB

Lysogeny broth
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PCB

Polychlorinate biphenyl

PCR

Polymerase chain reaction

SDS – PAGE

Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide
gel electrophoresis

TB

Terrific Broth

TLC

Thin layer chromatography

v/p

Vòng/phút

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... II
MỤC LỤC .....................................................................................................................V
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................VII
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... IX
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3
1.1 Cytochrome P450 ........................................................................................... 3
1.1.1 Định nghĩa và phân loại...................................................................... 3
1.1.2 Cấu trúc của cytochrome P450 ........................................................... 5
1.1.3. Cơ chế xúc tác của cytochrome P450 ............................................... 8
1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 ........................................................ 8
1.2 Nghiên cứu về CYP264B1 ............................................................................. 10

1.3 Hợp chất sesquiterpene .................................................................................. 13
1.3.1 Định nghĩa và nguồn gốc.................................................................... 13
1.3.2 Phân loại sesquiterpene ...................................................................... 13
1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene .............................................. 15
1.4 Hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450 ...... 16
1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene
trên thế giới và ở Việt Nam ........................................................................... 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 20
2. 1 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 20
2.1.1 Vật liệu ............................................................................................... 20
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................. 21
2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 22
2.1.4 Dung dịch và đệm.............................................................................. 22
2.1.5 Môi trƣờng .......................................................................................... 23
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................ 24
2.2.1 Nuôi cấy E.coli ................................................................................... 24
2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




nhiệt .................................................................................................. 24
2.2.3 Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx .................... 25
2.2.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene ...................................................... 27
2.2.5. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone ....................................... 30
2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu ............................. 30
2.2.7 Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene ....................................... 32
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 34
3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa

CYP264B1, AdR và Adx............................................................................... 34
3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene .................................................................. 35
3.2.1 Khả năng biểu hiện gene CYP264B1 ................................................. 35
3.2.2 Khả năng biểu hiện của Adx .............................................................. 36
3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào
C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx .................................................................... 38
3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu ......................................... 39
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng lên khả năng chuyển hóa cơ chất..39
3.4.2 Ảnh hƣởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất ....... 41
3.4.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất ............... 42
3.4.4 Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất ............ 44
3.4.5 Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa .......................... 45
3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp chất
sesquiterpene ................................................................................................. 47
3.5.1 Kết quả chuyển hóa longipinene ........................................................ 48
3.5.2 Kết quả chuyển hóa isolongifolene .................................................... 50
3.5.3 Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa .................................. 51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................................................ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 55
PHỤ LỤC ......................................................................................................................60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH
Nội dung

Tên hình

1.1

Trang

Cách gọi tên enzyme P450

3

Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome

5

1.2

P450

1.3

Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam

7

1.4

Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450

8

Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase

10

1.5

GeoA trên cụm 2 gene của myxobacterium Sorangium
cellulosum So ce56

1.6

Cấu trúc của nhóm sắt-lƣu huỳnh

11

1.7

Cấu trúc nhóm FAD

12

1.8

Một số sesquiterpene phổ biến

13

1.9

Một số Sesquiterpene mạch thẳng

14

1.10

Một số sequiterpene mạch vòng đơn

14

1.11

Một số sesquiterpene đa vòng

15

2.1

Plasmid pET C4AA

20

2.2

Sơ đồ nghiên cứu đề tài

24

3.1

Kết quả điện di sản phẩm PCR colony

34

3.2

Cấu trúc đa gene trên vector pETC4AA

35

Phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng 400-500 nm của dịch

36

3.3

chiết tế bào C43DE3/pETC4AA sau 24 giờ cảm ứng

3.4

Kết quả điện di protein ngoại bào

37

Phân tích khả năng biểu hiện Adx với kháng thể đặc hiệu

38

3.5

bằng kỹ thuật Western blot.
Sắc ký đồ HPLC phân tích kết quả chuyển hóa nootkatone

39

3.6

bằng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA

3.7

Chuyển hóa glycerol bởi tế bào vi sinh vật

43

3.8

Cấu trúc của longipinene và isolongifolene

47

3.9

Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene

49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3.10

3.11

Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene

50

Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) và cấu

51

trúc dự đoán bởi GCMS (b)
Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a) và cấu

3.12

trúc dự đoán bởi GCMS (b)

3.13

Cấu trúc phân tử của 15-hydroxy longipinene

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

52

52

DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Nội dung

Trang

2.1

Danh sách thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

21

2.2

Danh sách các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

22

Danh sách các dung dịch và đệm chính sử dụng trong thí nghiệm

22

2.3
2.4

Danh sách các môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm

23

2.5

Thành phần phản ứng PCR

26

2.6

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

26

2.7

Thành phần gel co và gel tách

29

2.8

Bố trí thí nghiệm xác định môi trƣờng tối ƣu

31

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả

40

3.1

năng chuyển hóa cơ chất
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ tế bào đến khả năng

3.2

chuyển hóa cơ chất
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng

3.3

42

44

chuyển hóa cơ chất
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng

3.4

chuyển hóa cơ chất

3.5

Kết quả lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

45

46




MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công thức
phân tử là C15H24. Các dẫn xuất oxy hóa của chúng thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc
học, tính chất hƣơng liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất có giá trị
[11]. Tuy nhiên, trong tự nhiên các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thƣờng tồn
tại với hàm lƣợng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng. Việt Nam là một
quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thác nguồn
sesquiterpenes từ cây cỏ trong nƣớc có ý nghĩa rất thiết thực.
Để tạo ra những dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc bằng
con đƣờng hóa học thƣờng đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao và
tạo ra nhiều chất thải độc hại ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Ngƣợc lại, các chất xúc
tác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiện
phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47]. Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúc
tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông
qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử,
gọi là các redox partner [13]. Để khắc phục điều này, xu hƣớng nghiên cứu gần đây
về P450 là tạo ra hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thời gene mã
hóa P450 và các redox partner của nó. Giải pháp này có lợi thế là có thể tận dụng
nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyển
hóa cơ chất trong môi trƣờng tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh
sạch tốn k m.
Trong nghiên cứu trƣớc, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 có nguồn
gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đã đƣợc phát hiện có
khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes. Hệ thống vận chuyển điện tử

cho enzyme này cũng đã đƣợc xác định, bao gồm NADPH và 2 protein vận chuyển
điện tử là AdR (Adrenodoxin reductase) và Adx (Adrenodoxin). Đặc biệt,
CYP264B1 có khả năng hydroxyl hoá chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và / ionone) ở vị trí mà cho đến nay rất khó thực hiện đƣợc bởi các quá trình chuyển hóa
sinh học khác. Các dẫn xuất này đều có tính chất thú vị hơn so với các chất ban đầu

1


nhƣ tăng hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số dòng tế bào ung thƣ (dẫn xuất
của nootkatone), hay có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp carotenoids (dẫn
xuất của / -ionone) [26]. Vì vậy, CYP264B1 có tiềm năng rất lớn trong việc
chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene thành các dẫn xuất có đặc tính sinh học mới.
Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp để chuyển hóa
các hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vật - Viện
Công nghệ sinh học đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho CYP264B1
và 2 redox partner của nó, đƣợc điều khiển bởi promoter T7. Trên cơ sở đó, chúng
tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h
ên h h ng

ch

nh

c

c

c i

h

ch

i

i

h

n

2. Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống
CYP264B1.
- Ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene.
3. Nội dung nghiên cứu
chuy n h

- Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t

cơ ch t

+ Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene bằng kỹ thuật PCR
colony và giải trình tự gene.
+ Kiểm tra khả năng biểu hiện gene bằng phƣơng pháp đo nồng độ
CYP264B1 và kiểm tra khả năng biểu hiện Adx bằng phƣơng pháp western blot.
+ Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone bằng phƣơng pháp HPLC.
+ Tối ƣu điều kiện chuyển hóa nootkatone.
- Tách chi t và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa
+ Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene và phân tích sản phẩm chuyển

hóa bằng kỹ thuật GCMS.
+ Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cột selicagel.
+ Nhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật NMR.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cytochrome P450
1.1.1 Định nghĩ v

hân

ại

* Định nghĩ
Cytochrome P450 (thƣờng viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzyme
monooxygenease có nhóm heme - thiolate trong trung tâm hoạt động, hấp thụ bƣớc
sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trạng thái khử và tạo phức hợp với
CO (cacbon monooxit) [13].
P450 có mặt trong hầu hết các sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, thậm chí
cả ở virus [20]. P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh và
ngoại sinh. Số lƣợng P450 cao nhất ở thực vật, ở ngƣời có 57 enzyme P450 [13].
E.coli không có enzyme P450 nào.
Tên gọi của các enzyme cytochrome P450 đƣợc quy định bởi chữ CYP, theo
sau nó là một số thứ tự Ả Rập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết hoa chỉ phân
họ và một số Ả Rập chỉ một gen riêng biệt. Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1,
CYP260A1.

Hình 1.1. Cách gọi tên enzyme P450

* Phân loại
Hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã đƣợc tách dòng từ động vật,
thực vật, vi nấm, vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [33].
3


Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn
điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc
một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner. Do P450 rất đa dạng
trong tự nhiên nên các redox partner của chúng cũng rất phong phú.
Dựa vào các kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử,
Hannemann và cộng sự đã phân loại P450 thành 10 nhóm khác nhau.
- Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ty thể của tế bào
nhân chuẩn. Hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 protein riêng biệt: một enzyme
reductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trò chuyển điện tử từ NAD(P)H cho
thành viên thứ 2 là một ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lƣu huỳnh, đến lƣợt
ferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme này thực
hiện chức năng xúc tác.
- Nhóm 2: bao gồm một enzyme cytochrome P450 và một cytochrome P450
reductase (CPR) phụ thuộc NADPH của mạng lƣới nội chất. CPR là một enzyme
chứa 2 nhóm ngoại FAD và FMN có vai trò chuyển điện tử từ NADPH tới P450.
- Nhóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn Citrobacter braakii. Hệ thống
này bao gồm một Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN và một enzyme
cytochrome cytochrome mới là P450cin.
- Nhóm 4: đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm một
Fdx và một enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase.
- Nhóm 5: bao gồm một enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H và một enzyme
cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450).
- Nhóm 6: bao gồm một enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H và

một protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450).
- Nhóm 7: bao gồm một enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450
(PFOR-P450).
- Nhóm 8: bao gồm 1 enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử
tƣơng tự ở tế bào nhân chuẩn là diflavin reductase (CPR-P450).
- Nhóm 9: bao gồm một enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng
NADH làm chất cho điện tử. P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào và không
phụ thuộc vào các protein vận chuyển điện tử khác.
4


- Nhóm 10: bao gồm các P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện
tử nhƣ: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ether
synthase, prostacyclin synthase và thromboxane synthase [13].

Hình 1.2. Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome P450 ở
microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) và (D).
Trong đó:
CPR: NADPH-P450 reductase

FDX: ferredoxin

FDR:NAD(P)H-ferredoxin

ADX: Adrenodoxin

reductase

RH: Cơ chất

ADR: NADPH -

ROH: Sản phẩm.

adrenodoxin reductase

1.1.2

c củ cytochrome P450
P450 là một họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lƣợng phân tử khoảng 45-

60 kDa, trong phân tử có chứa một nhân heme ở dạng Fe protoporphyrin IX và một
chu i polypeptide.
Cấu trúc bậc I của P450 cho thấy trình tự amino acid trong phân tử của m i
chu i isozyme thƣờng có thể khác nhau rất nhiều (có trƣờng hợp khác đến 70%),
hơn nữa đoạn amino acid đầu N thƣờng không giống nhau giữa các P450. Sự khác
biệt về trình tự amino acid của các isozyme trong cùng loài dao động từ 30% đến
hơn 95%. M i isozyme đƣợc mã hóa bởi một gene riêng biệt và sự khác biệt về
trình tự amino acid trong phân tử là do trình tự của các nucleotide trong gene mã
hóa protein quy định [6].
Đến nay ngƣời ta đã biết đƣợc 1200 cấu trúc bậc I của P450. Các trình tự
amino acid của các P450 cũng nhƣ trình tự của các nucleotide mã hóa chúng đƣợc
5


lƣu trong GenBank. Trung tâm hoạt động của P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liên
kết bởi lực hydro kỵ nƣớc. Vị trí thứ 5 của vòng porphyrin liên kết với aminothiol
thƣờng của gốc cysteine. Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nƣớc có khả năng trao
đổi. Mặc dù có sự khác biệt về trình tự amino acid nhƣng một số cấu trúc đƣợc bảo
toàn ở tất cả các isozyme, ví dụ nhƣ gốc cysteine gắn với heme bao giờ cũng ở gần

đầu carboxyl.
Trong số những cytochrome đã đƣợc tách chiết, cytochrome P450cam là
enzyme P450 đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc bậc I một cách hoàn chỉnh bởi Poulos và
cộng sự [2]. Hình dạng tổng thể của P450cam tƣơng tự nhƣ một hình lăng trụ tam
giác với đƣờng kính cực đại khoảng 60 Ǻ.

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam
Vùng liên kết hem đƣợc mô tả bằng màu đen.
Một nguyên tử sắt hình cầu ở trung tâm của heme

Cấu trúc bậc II của P450 cũng đã đƣợc nghiên cứu, kết quả cho thấy cả chu i
-helix và phiến β đều tồn tại trong phân tử enzyme này. Sự khác biệt trong cấu trúc
không gian của trung tâm hoạt động của P450 là nguyên nhân cho sự đặc hiệu cơ
chất của các isozyme.
Vào đầu những năm 1990, ngƣời ta đã xác định đƣợc cấu trúc của một số enyme
cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF
(CYP107) và P450nor (CYP55) [6]. Cho đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấu
trúc tinh thể đã xác định đƣợc cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn.
Mặc dù sự tƣơng đồng về trình tự của các enzyme P450 thuộc cùng một phân

6


họ chỉ dƣới 20%, nhƣng các enzyme này lại có sự tƣơng đồng lớn về phƣơng thức
cuộn xoắn và hình học. Nhìn chung, có khoảng 13 chu i xoắn

và 4 phiến β trong

một phân tử protein P450. Cấu trúc trung tâm bảo thủ của P450 đƣợc tạo nên bởi 1
bó gồm 4 chu i xoắn xung quanh nhân heme (3 chu i xoắn song song là D, L, Ihelix và một chu i xoắn ngƣợc là E-helix). Nhóm heme định vị giữa chu i I-helix

xa và một chu i L-helix gần và liên kết với phân tử cystein liền kề tạo thành một
vùng khoanh chứa đoạn trình tự amino acid bảo thủ của P450 là FxxGx(H/R)xCxG.
Phân tử cystein liền kề là tuyệt đối bảo thủ và nằm trên liên kết “thứ năm” của
nguyên tử sắt. Đặc biệt, phân tử cysterin tạo thành 2 liên kết hydrogen với các bộ
nhóm amide gần kề [9]. Chu i xoắn dài I-helix tạo thành 1 bức tƣờng giữa khoang
chứa nhóm hem và trình tự amino acid tín hiệu (A/G)-Gx(E/D)T tập trung ở giữa
các chu i xoắn. Chu i xoắn I-helix cũng chứa phân tử threonine có tính bảo thủ cao
định vị ở trung tâm hoạt động và đƣợc tin rằng có tham gia vào quá trình xúc tác
[13], [29], [17]. Dựa vào trình tự amino acid của các thành viên của nhóm CYP2 và
P450cam, Gotoh và cộng sự đã cho rằng có 6 vùng tham gia vào việc nhận biết cơ
chất. Các vùng protein này đƣợc xem là rất linh hoạt và chuyển động theo sự liên
kết với cơ chất trƣớc khi sẵn sàng cho phản ứng xúc tác [36], [9].

Hình 1.4. Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450
Trong đó: nguyên tử sắt (III) protoporphyrin-IX
liên kết với một phối tử cysteine ở gần

7


1.1.3

ơ ch

c

c củ cytochrome P450

Có hơn 20 phản ứng khác nhau đƣợc xúc tác bởi các enzyme P450 nhƣ phản
ứng hydroxyl hóa liên kết C-H, N-dealkyl hóa, N-hydroxyl hóa, O-dealkyl hóa, Soxy hóa và epoxy hóa. Trong đó, phản ứng phổ biến nhất đƣợc thực hiện bởi các

enzyme này là phản ứng monooxy hóa: một nguyên tử oxy đƣợc chuyển vào cơ
chất (RH) và nguyên tử oxy còn lại đƣợc khử thành nƣớc [28].
RH + O2 + NAD(P)H + H+→ ROH + H2O + NAD(P)+
Ngoài phân tử oxi, hệ thống enzyme này còn cần có NAD(P)H cung cấp H2
cho phản ứng. Cơ chế của phản ứng này đƣợc Coon và cộng sự đã tìm ra và mô tả
chi tiết vào năm 1979 [29].
Cơ chất muốn chuyển hóa đƣợc cần phải gắn vào enzyme P450 (ở dạng oxi
hóa) tạo thành một h n hợp enzyme - cơ chất. Sau đó một điện tử từ pyridine
nucleotide dạng khử đƣợc chuyển đến hợp chất này nhờ phân tử cytochrome P450 –
reductase. Phức hệ enzyme cơ chất bị khử này lại gắn với một phân tử oxi và tiếp
nhận điện tử thứ hai. Qua sự chuyển điện tử (e-) nội phân tử, phân tử oxi đƣợc hoạt
hóa sau khi một phân tử nƣớc tách ra thì nguyên tử oxi thứ hai đƣợc gắn vào cơ
chất. Sau đó là sự tái lập lại cytochrome P450 dạng oxi hóa.
1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450
Hiện nay, các enzyme P450 đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu về nhiều
lĩnh vực: hóa sinh, y dƣợc học, sinh lý học, hóa học nội bào, công nghệ sinh
học và môi trƣờng.
Bộ gen của con ngƣời có 57 gen mã hóa cho P450, trong đó hơn một phần
tƣ các enzyme này tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất xenobiotics,
P450 còn tham gia vào quá trình tổng hợp sterol, vitamin, acid béo và
eicosanoids. Chính vì vậy, P450 có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp
dƣợc phẩm đặc biệt là trong nghiên cứu chế tạo thuốc chữa bệnh. Ngoài ra,
P450 còn xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa các hydrocarbon béo, các hợp
chất có khối lƣợng phân tử lớn hơn và phức tạp hơn nhƣ hydrocarbons
polyaromatic (PAHs); các hợp chất halogen nhƣ polychlorinated biphenyls
8


(PCBs), chất thải từ thuốc nổ quân sự và thuốc diệt cỏ [45]. Nhiều loại P450
còn đƣợc nghiên cứu phục vụ cho các ứng dụng xử lý sinh học.

Do khả năng thực hiện nhiều phản ứng khác nhau trên nhiều nhóm cơ chất
khác nhau, đặc biệt là khả năng oxy hóa chọn lọc ở các vị trí allyl, liên kết đôi hoặc
thậm chí cả ở liên kết C-H không đƣợc hoạt hóa và rất khó thực hiện bởi xúc tác
hóa học, nên cytochrome P450 có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc chuyển hóa
các hợp chất tự nhiên thành các sản phẩm có giá trị [7]. Ngoài ra, P450 có thể ứng
dụng trong xử lý môi trƣờng để chuyển hóa các chất độc hại thành các chất thân
thiện hơn hay ứng dụng để tạo các biosensor nhằm phát hiện sự có mặt của một chất
nào đó trong mẫu nghiên cứu. Trên thực tế, P450 đƣợc ứng dụng nhiều nhất để sản
xuất thuốc, vitamin, hƣơng liệu, nƣớc hoa hay thuốc trừ sâu. Chẳng hạn, P450 đã
đƣợc ứng dụng thành công ở qui mô công nghiệp trong việc sản xuất pravastatin thuốc có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol, dùng để điều trị cho những bệnh
nhân bị xơ vữa động mạnh. Pravastatin đƣợc chuyển hóa từ compactin bởi
CYP105A3 thông qua sự hydroxyl hóa carbon ở vị trí 6β. Một ví dụ khác nữa là
ứng dụng của P450 trong sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi P450 qua phản
ứng hydroxyl hóa ở vị trí 11-β, đã đƣợc sản xuất bởi công ty Schering AG
(Germany) ở qui mô công nghiệp [39].
Trong chuyển hóa các hợp chất terpene, sự thêm vào bộ khung carbon một
hoặc một vài nhóm hydroxyl làm thay đổi đáng kể các tính chất nhƣ khả năng hòa
tan, hoạt tính sinh học hay tăng đặc tính mùi của hợp chất đó. Chẳng hạn một dạng
đột biến của P450cam có thể xúc tác phản ứng oxi hóa monoterpene (þ)-a-pinene
thành (þ)-cis-verbenol hoặc h n hợp của (þ)-verbenone và (þ)-cis-verbenol.
Verbenol và verbenone là các pheromones hoạt động chống lại rất nhiều loại bọ
cánh cứng do đó có thể sử dụng trong chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp.
Sinh tổng hợp sesquiterpene albaflavenone có hoạt tính kháng sinh đƣợc thực hiện
bởi (CYP170A1) qua hai bƣớc oxy hóa allyl hợp chất epi-isozizaene [51]. Sự
hydroxyl hóa chọn lọc „regio‟ valencene ở vị trí allyl C2 bởi CYP109B1 tạo ra
nootkatone, một hợp chất có giá trị trong công nghiệp thực phẩm và hƣơng liệu.

9

1.2 Nghiên cứu về CYP264B1
CYP264B1 là một enzyme cytochrome P450 có trọng lƣợng phân tử xấp xỉ 47
kDa, có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56.
Năm 2007, trình tự toàn bộ genome của vi khuẩn này đƣợc công bố. Thông tin trình
tự đã chỉ ra rằng, vi khuẩn này có tất cả 21 P450s. Sau đó, gene mã hóa cho toàn bộ
các enzyme P450 này, trong đó có CYP264B1, đã đƣợc tách dòng bởi nhóm nghiên
cứu của GS. Rita Bernhardt trƣờng đại học Tổng hợp Saarland.
Trên genome của myxobacterium Soce, gene mã hóa cho CYP264B1 nằm ở vị
trí locus sce8551 ngay tiếp sau gene mã hóa cho một enzyme terpene cyclase
GeoA ở vị trí locus sce8552 (NCBI). Khoảng cách giữa 2 gene này rất gần, chỉ là
63 bp. Khoảng cách này gợi ý rằng 2 gene CYP264B1 và terpene cyclase GeoA
dƣờng nhƣ nằm trên cùng 1 operon và cùng nhau tham gia vào quá trình tổng hợp
terpenoid trong So ce65 [16].

Hình 1.5. Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase GeoA trên cụm
2 gene của myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56

 Hệ thống chuyển điện tử cho CYP264B1
Hầu hết các P450 đều cần điện tử từ NADPH hoặc NADH và nhận điện tử
gián tiếp thông qua các đối tác vận chuyển điện tử (gọi là các redox partner) –
thƣờng có bản chất protein [13]. Các đối tác vận chuyển điện tử có thể cùng nguồn
gốc (autologous electron transfer) với enzyme P450 hoặc khác nguồn gốc
(heterologous electron transfer ) với enzyme P450. Trong nghiên cứu trƣớc, khả
10


năng chuyển điện tử cho CYP264B1 bởi các redox protein có cùng nguồn gốc
myxobacterium So ce56 (bao gồm 8 ferredoxin (Fdx) và 2 feredoxin reductase
(FdR) đã đƣợc thử nghiệm [10]. Kết quả là đã tìm ra 2 cặp redox protein có thể
chuyển điện tử cho CYP264B1 là Fdx2-FdR_B và Fdx8-FdR_B. Tuy nhiên, khi thử

khả năng chuyển điện tử của các redox protein có nguồn gốc từ tuyến thƣợng thận
bò là Adx (Adrenal ferredoxin) và AdR (Adrenodoxin reductase) cho CYP264B1,
TS. Lý Thị Bích Thủy và cộng sự đã nhận thấy rằng khả năng vận chuyển điện tử
của cặp protein này hiệu quả hơn nhiều. Chính vì vậy, Adx và AdR đã đƣợc sử
dụng làm đối tác vận chuyển điện tử cho CYP264B1 [26].
Adx có 128 amino acid, thuộc nhóm protein ferredoxin chứa nhóm sắt-lƣu
huỳnh (2Fe-2S), có khả năng vận chuyển điện tử từ NADPH tới enzyme cytochrom
P450 và thông qua một enzyme ferredoxin reductase. Trong nghiên cứu về
CYP264B1, Adx đƣợc sử dụng ở dạng đã đƣợc cắt ngắn bớt (truncated protein) 3
amino acid ở đầu N và 19 amino acid đầu C, là dạng bền vững hơn nhƣng vẫn giữ
nguyên hoạt tính so với dạng nguyên bản.

Hình 1.6. Cấu trúc của nhóm sắt-lƣu huỳnh [33]

AdR có 492 amino acid, là một enzyme thuộc nhóm mitochondrial
flavoprotein, có coenzyme là FAD. Enzyme này là protein chuyển điện tử đầu tiên
trong hệ thống mitochrondrial P450. Nhóm FAD coenzyme nhận 2 electron từ
NADPH và chuyển cùng một lúc hai điện tử này cho protein vận chuyển điện tử
tiếp theo là Adx [34].

11


Hình 1.7. Cấu trúc nhóm FAD [34]

M ts

ặc tính thú vị của CYP264B1:

Do gene mã hóa cho CYP264B1 nằm thành cụm với enzyme terpene cyclase

nên enzyme này đã đƣợc dự đoán là có khả năng chuyển hóa một nhóm hợp chất
terpenoid nào đó. Sau khi sàng lọc một số nhóm terpenoid khác nhau nhƣ:
monoterpene, sesquiterpene, diterpene, steroid, ketone và aroma, các tác giả đã xác
định đƣợc CYP264B1 có khả năng hydroxy hóa nhiều hợp chất thuộc nhóm
sesquiterpene và sesquiterpenoid (nhƣ nootkatone, valencene,

-longipinene,

clovene, humulene, isolongifolene-9-one) và norisoprenoids (nhƣ -ionone và βionone). Hơn nữa, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hóa cơ chất rất chọn lọc chỉ ở
một vị trí. Cụ thể, khi chuyển hóa ionone (β và -ionone), CYP264B1 chỉ hydroxyl
hóa ở vị trí là nguyên tử C3, tạo thành 3-OH-ionone. Sản phẩm 3-OH-ionone có thể
sử dụng làm chất trung gian để tổng hợp các carotenoid nhƣ astaxanthin, zeaxanthin
hay axit deoxyabscisic [24]. Khi chuyển hóa nootkatone, CYP264B1 tác động chủ
yếu tới vị trí C13 để tạo thành 13-OH-nootkatone. Đây là sản phẩm đƣợc xác định là
làm tăng khả năng kìm hãm một số dòng tế bào ung thƣ so với cơ chất ban đầu của
nó là nootkatone.Trong tổng hợp hóa học, phản ứng oxi hóa chọn lọc rất quan trọng
do loại bỏ đƣợc khả năng hình thành các sản phẩm phụ. Đặc biệt, CYP264B1 có
khả năng hydroxyl hóa ở vị trí mới. Cụ thể, sản phẩm hydroxyl hóa của CYP264B1

12


là 3-OH-β-ionone và 13-OH-nootkatone chƣa đƣợc quan sát thấy ở bất kỳ hệ thống
chuyển hóa sinh học nào [26].
1.3 Hợp chất sesquiterpene
1.3 Định nghĩ v ng ồn g c
* Định nghĩ
Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene gồm ba đơn vị isoprene, có công thức
phân tử là C15H24 [31].
* Nguồn g c

Sesquiterpene rất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là trong thành phần của tinh
dầu. Chẳng hạn nhƣ isocaryophyllene chiếm 19,22% trong tinh dầu ngải cứu, βselinen chiếm 68,54% trong tinh dầu lá cúc tần...

Hình 1.8. Một số sesquiterpene phổ biến

1.3.2 hân

ại sesquiterpene

Mặc dù cơ sở hóa học của sequiterpene đã có từ thế kỷ 19, nhƣng những
nghiên cứu hóa học về sesquiterpene chỉ đƣợc thực sự thúc đẩy với tốc độ nhanh
chóng bởi những công trình đầu tiên của Wallach, Semmler và nhất là của Ruzicka
song song với sự phát triển của các phƣơng pháp hiện đại để tách chiết, tinh chế,
xác định cấu trúc và tổng hợp [4].
Có khoảng 1000 sequiterpene thuộc khoảng 100 khung. Với số lƣợng chiếm
khoảng một phần tƣ tổng số các chất terpenoid tự nhiên mà ta biết ngày nay, các
13


sesquiterpene là nhóm chất terpenoid lớn nhất. Ở đây ta chỉ đề cập đến những
khung chính hoặc những loại chất lý thú về phƣơng diện thực tiễn [15].
 Sesquiterpene mạch thẳng
Điển hình của nhóm sesquiterpene này là β-farnesene chiếm 2,3% trong tinh
dầu cỏ hôi trị bệnh viêm xoang, trị gàu, rong huyết…

Hình 1.9. Sesquiterpene mạch thẳng

 Sesquiterpene mạch vòng đơn
- Curcumen có trong dầu nghệ, có tác dụng diệt khuẩn, làm vết thƣơng chóng thành
sẹo, chữa loét tá tràng.

- Zingiberen là thành phần chủ yếu của dầu gừng, có 2 nối đôi liên hợp có thể nhận
biết bằng quang phổ hấp thụ hoặc bằng hydro hóa với Na/ancol.

Hình 1.10. Một số sequiterpene mạch vòng đơn

14