Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc berberin của màng bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua đường uống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

PHẠM THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG
BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN
TỪ NƯỚC VO GẠO ĐỊNH HƯỚNG
SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật
Người hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN XUÂN THÀNH

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Xuân đã hướng dẫn,
chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành tốt
khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2,
khoa Sinh - KTNN, Trung tâm Hỗ trợ NCKH & CGCN Trường ĐHSP Hà
Nội 2, phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật, cùng các thầy cô trong tổ
bộ môn Động vật, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quan tâm động viên của bạn bè,
gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Hiền


LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn.
2. Đề tài của tôi không trùng lặp với một đề tài nào khác.
3. Kết quả thu được trong đề tài do tự bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn
đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Hiền


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A. xylinum: Acetobacter xylinum
BC: Bacterial cellulose
BH: Berberine hydrochloride
OD: Optical density
UV - vis: Ultraviolet visible


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Kết quả nhuộm Gram âm của A. xylinum ......................................... 7
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của BH
Sơ đồ 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận BC .................................................... 15
Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn BH .................................................. 16
Hình 3.1. Màng BC trong môi trường nuôi cấy .............................................. 21
Hình 3.2. Màng BC đang xử lý trong nước..................................................... 22
Hình 3.3. Màng BC tinh chế............................................................................ 23
Hình 3.4. a,b Màng BC tinh chế ở các độ dày khác nhau .............................. 24
Hình 3.5. Màng BC đang nạp thuốc ............................................................... 25
Hình 3.6. Thời gian và giá trị OD345nm của thuốc BH giải phóng qua BC trong
các môi trường pH và độ dày màng khác nhau .............................................. 28


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Thành phần và khối lượng các chất trong môi trường nuôi cấy
màng BC .......................................................................................................... 13
Bảng 2.2. Bảng nồng độ BH và giá trị OD345nm .............................................. 15
Bảng 2.3. Dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson ................................ 17
Bảng 3.1. Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng BC ........................................ 25
Bảng 3.2. Tỷ lệ thuốc hấp thụ vào màng BC .................................................. 27
Bảng 3.3. Khối lượng thuốc giải phóng qua màng BC ................................... 29
Bảng 3.4. Tỷ lệ thuốc giải phóng qua màng BC ............................................. 30
Bảng 3.5. Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và các giá trị
mũ số giải phóng (n) từ các môi trường pH và độ dày màng khác nhau ....... 32


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ......................................... 4
4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 4
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Đại cương về vi khuẩn A. xylinum và màng BC ........................................ 5
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum
1.2. Thuốc BH ................................................................................................... 7
1.2.1. Cấu trúc ................................................................................................... 7
1.2.2. Nguồn gốc ............................................................................................... 8
1.2.3. Tính chất vật lý........................................................................................ 8
1.2.4. Tính chất hóa học .................................................................................... 8
1.2.5. Tác dụng dược lý và ứng dụng................................................................ 9
1.2.6. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc BH
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 10
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc .................................................................. 10
1.3.1.1. Trên thế giới
1.3.1.2. Ở Việt Nam
1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ............ Error! Bookmark not defined.
1.3.2.1. Trên thế giới


1.3.2.2. Ở Việt Nam
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 12
2.1.1 Giống vi khuẩn ....................................................................................... 12
2.1.2. Thuốc BH có xuất sứ từ Sigma - Mỹ .................................................... 12
2.1.3. Nguyên liệu - hóa chất .......................................................................... 12

2.1.4. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 12
2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 13
2.3. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 13
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 13
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng BC ..................................................... 13
2.4.2. Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc ........................ 14
2.4.3. Phương pháp xác định khối lượng BC tạo thành ................................. 15
2.4.4. Phương pháp sử dụng đường chuẩn xác định khối lượng thuốc hấp thụ
qua màng BC ................................................................................................... 15
2.4.5. Phương pháp sử dụng đường chuẩn xác định khối lượng thuốc giải
phóng qua màng BC ........................................................................................ 17
2.4.6. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................. 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 20
3.1. Kết quả đạt được ...................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Tạo được màng BC tinh khiết. .............................................................. 20
3.1.2. Khảo sát khối lượng thuốc hấp thụ vào màng ...................................... 24
3.1.3. Khảo sát khối lượng thuốc giải phóng qua màng ................................. 28
3.2. Kiến nghị .................................................. Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 35


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Berberine hydrochloride (BH) đã được biết đến như một chất
kháng khuẩn tự nhiên trong việc điều trị các bệnh lý như tiêu chảy, viêm
đường tiêu hóa do vi khuẩn tả, E. coli, amip đường ruột 23, 31. Theo một
vài nghiên cứu gần đây, BH còn có tác dụng tốt trong việc điều trị một số
bệnh mãn tính như tiểu đường, viêm khớp, hạ lipid, cholesterol máu, đặc biệt
là bệnh viêm đại tràng. BH sở hữu tính chất dược khác nhau bao gồm cả tác

dụng chống ung thư 23.
Tuy nhiên sinh khả dụng đường uống của nó thấp và có khả năng gây tác
dụng phụ cho vận chuyển thuốc ngoài đường tiêu hóa 23.Trong quá trình sử
dụng có thể bị các tác nhân khác gây ảnh hưởng làm giảm hiệu quả hấp thụ
23.
Bacterial cellulose (BC) là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là
chủng Acetorbacter xylinum (A. xylinum) 2, 5. BC có cấu trúc và đặc tính rất
giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau
bằng liên kết β - 1, 4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở
chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và
sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ bền sức căng, độ đàn
hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút
nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề dày của vi sợi lớn hơn
100 nm, bị phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển
hóa, không độc và không gây dị ứng 2, 5. Trên thế giới màng BC đã được
ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng BC
làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc
biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt

1


trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học,
thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc
và rất nhiều ứng dụng khác 19. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã
được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét
da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da
cho con người 9, 19. Amin et al. 18 đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm
màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho
thấy màng BC có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại làm tăng

hiệu quả sử dụng của thuốc. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng
BC mới được quan tâm gần đây và đã đạt được kết quả bước đầu. Đề tài của
Nguyễn Văn Thanh 5 – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2006 đã “Nghiên
cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Theo kết quả
nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ
kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp 5. Về mặt tính chất BC có độ
tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy
sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn 5. Ngoài ra BC còn có độ bền tinh
thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, khả năng thấm hút lớn, đường kính
sợi nhỏ, chứa nhiều dưỡng chất. Đồng thời là một hàng rào cản oxi và các
sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản
tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, màng BC còn có ý nghĩa
giữ thuốc và giải phóng thuốc từ từ 17, 24. Bên cạnh đó, các sợi cellulose có
cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh
khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường
axít. Do đó, cần thiết kế một loại thuốc uống vận tải phân phối thuốc để làm
tăng độ hòa tan và khả dụng sinh học của BC 23.
Uống là một trong những đường ưa thích nhất và truyền thống để phân
phối thuốc. So với đường tiêm hệ thống phân phối thuốc, lợi thế chính của nó

2


vĩ đại nhất là an toàn, đơn giản, tiện lợi và tuân thủ của bệnh nhân, trong đó
tăng hiệu quả điều trị thuốc uống 23. Nó cũng ngăn chặn nguy cơ lây truyền
bệnh, làm giảm chi phí và cho phép linh hoạt hơn hoặc kiểm soát liều lượng
23.
Nhờ những đặc tính độc đáo trên của BC nhằm duy trì hiệu quả thời
gian chữa bệnh tăng khả năng phân phối thuốc có kiểm soát , tăng thời gian
cư trú của thuốc trong đường ruột đạt hiệu quả cao. Cách tiếp cận này có thể

được sử dụng để tăng cường khả dụng sinh học đường uống của thuốc. Với
mục đích thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc dựa trên màng BC để
khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng qua màng BC của thuốc BH, chúng
tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc
Berberin của màng Bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng
sử dụng qua đường uống”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tạo được màng BC từ chủng A. xylinum.
Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua màng BC định sử dụng
qua đường uống để tăng cường sự giải phóng kéo dài của thuốc, tăng hàm
lượng thuốc được hấp thụ.
Khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH thông qua hệ thống
vận tải được thiết kế.
Đánh giá khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH thông qua hệ thống
vận tải được thiết kế.
Sử dụng màng để bảo vệ thuốc BH tránh tác nhân gây ảnh hưởng tới
thuốc trong quá trình sử dụng.
3. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng BC từ chủng A. xylinum.

3


Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua màng BC định hướng
sử dụng qua đường uống.
Xây dựng được đồ thị đường chuẩn BH từ đó xác định khối lượng thuốc
được hấp thụ và giải phóng qua màng BC.
Khảo sát, đánh giá khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH thông qua
hệ thống vận tải đã thiết kế.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học
Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC (dựa vào màng BC để
thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc).
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Từ màng BC đã được tạo ra được dùng làm hệ thống vận tải phân phối
thuốc nhằm khảo sát được lượng thuốc BH hấp thụ và giải phóng qua màng
BC.
Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về vi khuẩn A. xylinum và màng BC
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey 20 thì A. xylinum
thuộc giống Acetorbacter, họ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc
phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi A. xylinum
như một loài phụ của Acetobacter Acei 20.
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay
không di động, không sinh bảo tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc
điểm nhuộm Gram như hình 1.1. có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều
kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi 20.

Hình 1.1. Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum
Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2
- 5 mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn
và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn 28.
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum

5


Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 35C, pH = 4 - 6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả ở trong môi trường tối ưu 8.
A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ 8.
Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của A. xylinum bao gồm: oxy hóa
ethanol thành acid acetic, CO2, H2O, phản ứng catalase dương tính, không
tăng trưởng trên môi trường Hoyer. Chuyển hóa glucose thành acid, chuyển
hóa glycerol thành dihydroxyaceton, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp
cellulose 8.
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A.
xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp
bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng BC 28.
* Cấu trúc của màng BC
Cellulose vi khuẩn tạo bởi những chuỗi polimer β - 1, 4 glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản
của BC giống cellulose của thực vật (plant cellulose – PC), tuy nhiên chúng
khác nhau về cấu trúc đại thể 5, 19. Theo AJ. Brown (1886) 18, BC gồm
nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1.5 nm, kết hợp
với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng
khoảng 3 – 8 nm 2, 19.
Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0.01 – 0.5 nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh

6


và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt
là khả năng cản khuẩn 5. Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều
trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học 17 Almeida, IF. et
al 18 màng BC như hệ thống phân phối thuốc. Trường Đại học Y dược TP.
Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng
trị bỏng ở thỏ 3. Kết quả cho thấy màng BC giúp vết thương mau lành và
ngăn không cho vết thương nhiễm trùng 5. Ngoài ra, sản phẩm BC còn được
ứng dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan 2, 23.
1.2. Thuốc BH
1.2.1. Cấu trúc
BH là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có khung
protoberberin 1. Isoquinolin còn được gọi là benzo pyridin hay 2 - benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic 33.
Công thức cấu tạo

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của BH

7


Công thức phân tử : C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lượng phân tử: 371.82
Tên khoa học : 5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6aazoniaindeno(5,6-a) anthracen clorid dihydrat 1.
1.2.2. Nguồn gốc
BH thường có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi
Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis 10, 14. BH có nhiều trong

thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5 - 3%, BH chiếm ít nhất là 82% so với
alkaloid toàn phần 10, 14.
BH thường có lẫn các tạp chất alcaloid khác như: palmatin, jatrorrhizin.
Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5% 1, 3,
14.
1.2.3. Tính chất vật lý
Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng. Độ chảy
khi ở dạng base là 145C (bị phân hủy) 32. Độ tan dạng base tan chậm trong
nước 1/500 23, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether 32. Dạng muối
sulfat dễ tan trong nước ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol. BH không có C bất đổi
nên không có đồng phân quang học 10, 32.
1.2.4. Tính chất hóa học
Tính chất hóa học của N: BH có tính chất như một base yếu, tạo muối
bằng cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối BH không giống như các
alkaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là
có loại phân tử nước 3, 14.
Tính chất hóa học của oxy: BH kém ổn định trong môi trường kiềm
mạnh, N không bền vững, trong môi trường kiềm mạnh dễ biến mở vòng, cho
chức aldehyd gọi là Berberinal 3, 14.

8


Tính chất hóa học mạch kép: BH có thể mất mạch kép tại nhân giữa để
cho các hydro alkaloid không màu 3, 14.
1.2.5. Tác dụng dược lý và ứng dụng
BH có tác dụng kháng khuẩn được dùng chủ yếu trong các bệnh rối loạn
đường tiêu hóa 25. Ngoài ra, BH với liều nhỏ có tác dụng kích thích tim,
làm giãn động mạch vành, với liều lượng lớn ức chế hô hấp làm tê liệt trung
khu hô hấp trong khi tim vẫn đập. BH còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê, lợi

mật, kháng lợi niệu, đối với đường huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao và sau
đó thì hạ 25. BH đem khử hóa cho tetrahydroberberin có tác dụng an thần và
mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ 25, 32.
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: BH có khả năng hạ đường
huyết như hiệu quả như metformin, cơ chế hoạt động bao gồm việc ức chế
aldosereductase, làm giảm đường và ngăn ngừa sự kháng insulin 16, 25, 32.
BH làm giảm mạnh lượng chlesterol, LDL cholesterol, triglycerid xơ vữa
nhưng cơ chế hoạt động khác biệt với statin làm cho BH không gây ra tác
dụng phụ điển hình như statin 32. Ngoài ra BH còn có tác dụng chống co
giật nên có thể dùng tronng bệnh động kinh, bảo vệ các tế bào thần kinh trong
các trường hợp tổn thương não do tắc mạch máu não gây ra, có tác dụng
chống trầm cảm 31. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tác dụng chống ung thư
của BH, nó có thể ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư, bao
gồm ung thư vú, ung thư biểu mô, ung thư tụy, ung thư dạ dày mà không làm
ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào bình thường ở nồng độ nhất định
25, 32.
1.2.6. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc BH
Chỉ định: nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ trực trùng, hội chứng lỵ,
viêm ống mật, đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết mạc, các
trường hợp ngứa mắt do dị ứng 33.

9


Chống chỉ định: quá mẫn cảm, phụ nữ có thai. Phụ nữ mang thai và cho
con bú: không uống BH nếu bạn đang mang thai. Các nhà nghiên cứu cho
rằng BH có thể đi qua nhau thai và có thể gây hại cho thai nhi. Vàng da nhân
(kernicterus), một loại tổn thương não, đã phát triển ở trẻ sơ sinh tiếp xúc với
BH. Không uống BH nếu bạn đang cho con bú. BH có thể đi vào cơ thể trẻ sơ
sinh qua sữa mẹ, và có thể gây ra hại cho trẻ sơ sinh 33.

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc
1.3.1.1. Trên thế giới
Đã có những công trình nghiên cứu về thuốc BH trên thế giới như:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của
Berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 21.
Ryan Bradley, ND, MPH, và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về Berberin
trong bệnh tiểu đường 27.
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của Berberin
trong điều trị bệnh tiểu đường 22.
1.3.1.2. Ở Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc BH ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu
sau:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam 13.
Nguyễn Liêm - chiết xuất Berberin bằng áp lực nóng 11.
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình
sản xuất Berberin từ cây vàng đắng 11.
Hồ Đắc Trinh - chiết Berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch
acid sulfuric loãng 4.

10


Trần Công Khánh - góp phần nghiên cứu phương pháp sản xuất Berberin
từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre 15.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng BC
1.3.2.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown 19, 1989,

dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm
chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989) và
cộng sự 19, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các
sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc
thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989) 19, đã dùng BC làm vải đặc
biệt, để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protein hay cho
sắc kí.
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Harmlyn và cộng sự
(1997) 30, Cienchanska (2004) 19, Legara và cộng sự (2004) 22, Wan và
Millonn(2005) 32, Czaja và cộng sự (2006) 20 sử dụng màng BC đắp lên
các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan
(Canada) 32 đã được đăng kí bản quyền về làm màng BC từ A. xylinum
dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998) 33, Czafa 20 và cộng sự
(2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
1.3.2.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải tiến.
Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng
trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng các chất
có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng, … Từ năm 2000 nhóm
nghiên cứu các tác giả Nguyễn Văn Thanh 5 và cộng sự đã có một số công

11


trình nghiên cứu về màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học
dùng trong trị bỏng ở Việt Nam 5.
Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp dụng
từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong tự nhiên
và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết thương, vết

loét, 5 …

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí
nghiệm Vi sinh vật Khoa Sinh – KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Thuốc BH có xuất sứ từ Sigma - Mỹ
2.1.3. Nguyên liệu- hóa chất
Nguyên liệu: nước vo gạo (được lấy theo tỷ lệ 1 gạo: 2 nước)
Chứa nhiều vitamin B, các chất khoáng như sắt, đồng, ...
Hóa chất: sử dụng các hóa chất đặc biệt (peton) và các hóa chất thông
thường có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam như: đường glucose,
pepton, amoni sulfat, diamoni phosphat, acid acetic, NaOH, HCl đđ, nước cất
và một số hóa chất khác.
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ
Nồi hấp Tommy (Nhật), máy ép màng, tủ ấm, tủ sấy Blinder (Đức), máy
lắc TEIO TRCH (Hàn Quốc), máy rung siêu âm, máy quang phổ tử ngoại khả
kiến UV - vis 2450 (Nhật), máy gia nhiệt, tủ lạnh Electrolux, ...

12


Thiết bị phân tích: cân phân tích, cân kĩ thuật (Precisa XT 320M – Thụy
Sỹ).
Hộp nhựa có kích thước 15  10  4, hộp lồng, ống nghiệm, bình định
mức, bình tam giác, pipet các loại từ 1 – 50 ml.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm Hỗ trợ NCKH & CGCN Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.3. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện ở môi trường bên ngoài cơ thể.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng BC
Chuẩn bị môi trường để lên men tạo màng BC. Dựa vào môi trường
chuẩn 4, có cải tiến bằng cách thay thế cao nấm men bằng nước vo gạo có
thành phần chứa nhiều vitamin B, các chất khoáng như sắt, đồng, ...
Môi trường lên men tạo màng BC 4, bao gồm các thành phần và tỷ lệ
các thành phần như bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần và khối lượng các chất trong môi trường nuôi
cấy màng BC
STT

Nguyên liệu

Khối lượng

1

Nước vo gạo

1000 (ml)

2

Đường glucose

30 (g)

3

Điamoni sunfat

3 (g)

4

Điamoni photphat

2.7 (g)

5

Pepton

10 (g)

Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, sử dụng hàm lượng glucose
30 g/l cho các nghiên cứu trên chủng A. xylinum, (NH4)2SO4 nồng độ 3 g/l
môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất. Các hợp chất hữu cơ chứa cả

13


cacbon cả nitơ như pepton, nước vo gạo có thể vừa sử dụng làm nguồn
cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật.
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110C
trong 20 phút để tránh phân dã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong
15 phút. Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bổ sung dịch giống
đã hoạt hóa vào theo tỷ lệ 1/10, lắc 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào
hộp nhựa đã được hấp tiệt trùng. Nuôi cấy tĩnh trong 7 ngày, thu được sản

phẩm màng BC thô.
2.4.2. Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc
Màng BC sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và
các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì vậy, trước khi hấp thụ
thuốc cần phải xử lý màng để quá trình tiến hành thí nghiệm hấp thụ và giải
phóng được chính xác.
Quy trình xử lý màng 4 được trình bày trên sơ đồ 2.1.
Tách màng BC thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%

48h, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
14
BC tinh chế


Sơ đồ 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận BC
2.4.3. Phương pháp xác định khối lượng BC tạo thành
BC sau khi được tách ra khỏi môi trường, xử lý qua công đoạn hóa học
4 thu được BC tinh chế. BC tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 1050C, thu
được khối lượng BC tạo thành.
2.4.4. Phương pháp sử dụng đường chuẩn xác định khối lượng thuốc hấp
thụ qua màng BC
Chuẩn bị mẫu dung dịch chuẩn (7 mẫu) 12: dùng cân kỹ thuật cân
chính xác 8.10-4 g BH vào bình có dung tích 50 ml, cho vào bình đó 20 ml cồn
96 hòa tan BH ta được C1 bằng 5%.

Tiếp tục pha loãng C1 ở các nồng độ C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với
nồng độ của BH là 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%.
Sử dụng 7 bình tam giác dung tích 500 ml để đựng các mẫu. Dẫn dung
dịch thuốc đã pha ở các nồng độ lần lượt vào từng bình tương ứng đến 100
ml. Dán nhãn lên bình để đánh dấu các nồng độ thuốc khác nhau.
Chuẩn bị màng: màng BC tinh chế, đem sấy ở 120C để loại bỏ nước
trong thời gian 20 phút. Sau đó, cắt các màng với diện tích bằng nhau, đưa
màng BC đã cắt vào các môi trường thuốc đã chuẩn bị sẵn ở trên.
Sử dụng máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV - vis 2450 12 để đo
cường độ quang phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 345 nm.
Kết quả sau khi đo, được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Bảng nồng độ BH và giá trị OD345nm (n=3)
STT

Nồng độ (mg/ml)

OD345nm

1

0.5

0.342  0.0017

2

1

0.579  0.0013

15


3

1.5

0.851  0.002

4

2

1.15  0.0025

5

3

1.633  0.0011

6

4

2.173  0.0019

7

5

2.713  0.0026

Sử dụng Microsoft Office Excel 2007 29, 23 để xử lý số liệu, xây
dựng đồ thị biểu diễn đường chuẩn BH, dựng đường chuẩn dựa theo kết quả
đo được. Kết quả sau khi dựng thu được đồ thị 2.1.

Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn BH
Phương trình đường chuẩn (I)
y = 0.527x + 0.067 (R2 = 0.999)
Trong đó: x - nồng độ BH (mg/ml), y - giá trị OD tương ứng

16


Từ phương trình đường chuẩn (I), xác định được khối lượng thuốc hấp
thụ vào màng BC theo công thức (01).

mhấp thụ = mtrước - msau

(01)

Trong đó :
mtrước: khối lượng thuốc trước khi nạp vào màng BC (mg)
msau: khối lượng thuốc sau khi nạp vào màng BC (mg)
mhấp thụ: khối lượng thuốc hấp thụ vào màng BC (mg)
Sau đó áp dụng công thức (02) tính phần trăm lượng thuốc BH hấp thụ
vào.
EE = (mhấp thụ/5)  100%

(02)

Trong đó:
EE: phần trăm thuốc nạp vào màng (%)
mhấp thụ: khối lượng thuốc hấp thụ vào màng BC (mg)
2.4.5. Phương pháp sử dụng đường chuẩn xác định khối lượng thuốc giải
phóng qua màng BC
Chuẩn bị dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson 23.
Dung dịch gốc (a): axit axetic (CH3COOH) 0.04M, axit photphoric
(H3PO4) 0.04M, axit boric 0.04M
Dung dịch NaOH 0.2M (b): 8 g NaOH hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml
Cách pha: dung dịch đệm phụ thuộc vào 100 ml dung dịch gốc (a) khi
thêm X ml dung dịch (b) và dẫn nước đến 200 ml.
Cách pha thêm X như bảng 2.3.
Bảng 2.3. Dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson
X (ml)

5.0

50.0

100.0

pH

2

6.8

12

Kết quả sau khi pha, được các dung dịch đệm pH = 2; 6.8; 12.

17