Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Cimetidine của màng Bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống

Header Page 1 of 161.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN
--------------------

PHẠM THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ
PHÂN PHỐI THUỐC CIMETIDINE

CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE
LÊN MEN TỪ NƢỚC DỪA GIÀ
ĐỊNH HƢỚNG SỬ DỤNG QUA ĐƢỜNG UỐNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI, 2016

Footer Page 1 of 161.


Header Page 2 of 161.

LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Xuân Thành, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN
cùng các thầy cô tại Trung tâm Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ
trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi

hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân, bạn bè đã luôn ở
bên động viên, giúp đỡ và khích lệ tôi hoàn thành khóa luận này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách hoàn chỉnh
nhất. Tuy nhiên do buổi đầu mới làm quen với công việc nghiên cứu khoa học
cũng nhƣ hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những
thiếu sót nhất định mà bản thân chƣa thấy đƣợc. Tôi rất mong đƣợc sự góp ý
của quý thầy cô để khóa luận đƣợc hoàn chỉnh hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Thúy Hằng

Footer Page 2 of 161.


Header Page 3 of 161.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “Nghiên cứu sự vận tải và phân
phối thuốc Cimetidine của màng Bacterial cellulose lên men từ nước dừa già
định hướng sử dụng qua đường uống” là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi
dƣới sự hƣớng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Xuân Thành, giảng viên khoa
Sinh – KTNN trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. Đề tài này chƣa từng công bố
ở đâu và hoàn toàn không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Thúy Hằng

Footer Page 3 of 161.


Header Page 4 of 161.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1

A. xylinum

Acetobacter xylinum

2

BC

Bacterial cellulose

3

BC – CM

Màng Bacterial cellulose đã hấp thụ thuốc
Cimetidine

4

CM

Cimetidine

5

cs

cộng sự

6

ĐHSP

Đại học Sƣ phạm

7

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm
Hoa Kỳ

8

OD

Mật độ quang phổ

8

Nxb

Nhà xuất bản

9

rpm

Tốc độ quay 100 vòng/phút

Footer Page 4 of 161.


Header Page 5 of 161.

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Thành phần của nƣớc dừa già............................................................. 7
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo màng BC .................................................... 16
Bảng 2.2. Nồng độ CM và giá trị OD tƣơng ứng (n = 3) ................................. 18
Bảng 3.1. Giá trị OD (y) trung bình của thuốc CM sau khi hấp thụ thuốc ở
các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) .......................................... 27
Bảng 3.2. Khối lƣợng và tỉ lệ thuốc CM hấp thụ vào màng BC (n = 3) ........... 28
Bảng 3.3. Giá trị OD (y) tƣơng ứng với nồng độ CM ở các độ dày màng,
môi trƣờng pH và thời điểm khác nhau khi giải phóng từ
màng BC – CM (n = 3) ................................................................... 30
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng BC – CM trong các độ dày,
thời gian và môi trƣờng pH khác nhau (n = 3) ............................... 32
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trƣờng pH khác nhau (n = 3) ......... 34

Footer Page 5 of 161.


Header Page 6 of 161.

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 2.1. Biểu đồ biểu diễn đƣờng chuẩn CM ................................................... 19
Hình 3.1. Màng BC đƣợc nuôi trong môi trƣờng ở ngày thứ 4 .......................... 24
Hình 3.2. Thu màng BC thô ở các khoảng thời gian khác nhau ......................... 25
Hình 3.3. Màng BC đã đƣợc tinh chế ................................................................. 26
Hình 3.4. Màng BC đƣợc cho vào 100 ml dung dịch CM 5%............................ 27
Hình 3.5. Khả năng giải phóng thuốc CM của màng BC – CM trong các độ
dày, thời gian và môi trƣờng pH khác nhau ....................................... 31

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình thu nhận màng BC ............................................................ 17
Sơ đồ 3.1. Quy trình tinh chế màng BC ............................................................. 26

Footer Page 6 of 161.


Header Page 7 of 161.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1

2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
6. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Tổng quan về đối tƣợng và lĩnh vực nghiên cứu ....................................... 5
1.1.1. Tổng quan về màng BC........................................................................... 5
1.1.2. Tổng quan về thuốc CM.......................................................................... 8
1.2. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế
giới................................................................................................................... 11
1.2.1. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về màng BC ........ 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về CM ................. 12
1.2.3. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về hƣớng
nghiên cứu ....................................................................................................... 13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 15
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.1.1 Giống vi khuẩn ....................................................................................... 15
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 15

Footer Page 7 of 161.


Header Page 8 of 161.

2.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 15
2.2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 15
2.2.2. Dụng cụ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 16
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 16
2.3.1. Phƣơng pháp tạo màng BC ................................................................... 16

2.3.2. Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn của CM ............................................ 18
2.3.3. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc CM hấp thụ vào màng BC ........... 19
2.3.4. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc giải phóng CM từ màng
BC – CM ......................................................................................................... 20
2.3.5. Phƣơng pháp phân tích dƣợc động học giải phóng của CM ................. 22
2.3.6. Phƣơng pháp xử lý thống kê ................................................................. 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 24
3.1. Tạo màng BC của A. xylinum trong môi trƣờng nƣớc dừa già ................ 24
3.2. Thu màng BC thô trong môi trƣờng nƣớc dừa già ................................. 24
3.3. Tinh chế màng BC ................................................................................... 25
3.4. Lƣợng thuốc hấp thụ vào màng BC ......................................................... 27
3.5. Lƣợng thuốc CM giải phóng khỏi màng BC – CM ................................. 29
3.6. Phân tích động dƣợc học giải phóng của CM .......................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 37
1.1.Kết luận ..................................................................................................... 37
1.2.Kiến nghị ................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Footer Page 8 of 161.


Header Page 9 of 161.

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Đau bao tử hay loét dạ dày là bệnh phổ biến, thƣờng gặp ở nƣớc ta cũng
nhƣ trên thế giới, bệnh do hiệu ứng ăn da của acid và pepsin làm mất lớp niêm
mạc dạ dày hành tá tràng có thể lan xuống lớp dƣới niêm mạc, lớp cơ thậm chí
đến lớp thanh mạc và có thể gây thủng dạ dày. CM là thuốc kháng H2 ra đời

đầu tiên và là sự lựa chọn đầu tay của các bác sĩ trong những năm 80 của thế kỉ
trƣớc để chữa đau bao tử hay loét dạ dày. CM lần đầu tiên có mặt tại thị trƣờng
Anh năm 1976, sau 12 năm đƣợc nghiên cứu bởi tập đoàn dƣợc phẩm Smith,
Kline và French (SK & F nay là GlaxoSmithKline). Các nhà khoa học của SK
& F đã nhận thấy vai trò kích thích tiết acid dạ dày của histamin trong cơ thể từ
năm 1964, nhƣng ở thời điểm đó các kháng histamin cổ điển không có tác dụng
để ức chế hoạt động này. Và kể từ khi họ chứng minh đƣợc sự hiện diện của
receptor histamin H2 ở tế bào thành dạ dày, mục đích duy nhất của nhóm
nghiên cứu là tìm ra một chất có khả năng ức chế cạnh tranh với histamin, gắn
vào receptor histamin H2 nhƣng lại ức chế tiết acid. Chất đó chính là chất
kháng histamin H2 [9, 22]. Vào tháng 11 năm 1976, CM sau khi trải qua hàng
loạt các thử nghiệm với kết quả thành công mỹ mãn, đã đƣợc ra mắt trên thị
trƣờng với tên Tagamet. Vào ngày 01 tháng 01 năm 1979, CM chính thức đƣợc
Cục quản lí dƣợc và mỹ phẩm Hoa Kỳ kê đơn [9].
Tuy nhiên, khả năng hòa tan trong nƣớc của CM thấp làm giảm hiệu quả
điều trị, sinh khả dụng thực tế của CM ở ngƣời đau dạ dày khoảng 56 – 68%,
nửa đời thải trừ của CM là 2 giờ [33]. Do đó cần thiết kế hệ thống vận tải và
phân phối thuốc CM để giúp thuốc giải phóng một cách kéo dài.
Uống là một trong những đƣờng ƣa thích nhất và truyền thống để phân
phối thuốc. So với đƣờng tiêm, lợi thế chính của nó chính là an toàn, đơn giản,

1

Footer Page 9 of 161.


Header Page 10 of 161.

tiện lợi và dễ có sự tuân thủ của bệnh nhân nên làm tăng hiệu quả điều trị thuốc
[32].

Trong những năm gần đây, đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các vật
liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo, tƣơng
thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật liệu sinh
học có những đặc tính trên đƣợc chú ý là cellulose. BC hay màng sinh học là
sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng A. xylinum. BC có cấu trúc
và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật nhƣng có một số tính chất hóa lí
đặc biệt nhƣ: độ bền cơ học và khả năng thấm hút cao, độ polymer hóa lớn, có
khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy bởi enzyme, … Vì vậy
BC đã đƣợc ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ nhƣ: thực phẩm,
công nghệ giấy, công nghệ pin, trong lĩnh vực y học BC đƣợc dùng làm màng
trị bỏng, mặt nạ dƣỡng da [2, 6].
Ngoài ra, BC còn là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản
sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn định về
kích thƣớc và hƣớng, vì thế màng BC còn có ý nghĩa giữ thuốc và kéo dài thời
gian giải phóng thuốc [8, 12]. Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng
sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc,
nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trƣờng acid.
Các nghiên cứu cho thấy màng BC đƣợc tạo ra từ các nguyên liệu rẻ tiền,
dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Môi trƣờng nuôi cấy vi
khuẩn A. xylinum rất đa dạng nhƣ nƣớc dừa già, rỉ đƣờng, nƣớc mía, … Trong
đó nƣớc dừa già đƣợc coi là môi trƣờng kinh điển trong nuôi cấy A. xylinum với
hàm lƣợng chất dinh dƣỡng cao, rẻ tiền, phổ biến, phù hợp với sự phát triển của
loại vi khuẩn này [2].
Với mục đích khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc CM qua
màng BC định hƣớng sử dụng qua đƣờng uống, tôi đã chọn đề tài nghiên cứu:
2

Footer Page 10 of 161.

Header Page 11 of 161.

“Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Cimetidine của màng Bacterial
cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống”.
2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế chế tạo hệ thống vận tải và phân phối thuốc CM nhằm tạo ra hệ
thống kéo dài thời gian hấp thụ thuốc, điều này có thể giúp tăng lƣợng thuốc
hấp thụ vào cơ thể, phát huy đƣợc hiệu quả tốt trong chữa trị bệnh viêm loét dạ
dày ở ngƣời.
3. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng BC lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già.
Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc CM dựa trên màng BC.
Khảo sát, đánh giá khả năng vận tải và phân phối thuốc thông qua hệ
thống đƣợc thiết kế.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: Sự vận tải và phân phối thuốc CM dựa trên màng
BC lên men từ nƣớc dừa già định hƣớng sử dụng qua đƣờng uống.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển
giao công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
* Ý nghĩa khoa học:
Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC. Mở ra những hƣớng
nghiên cứu mới về khả năng vận chuyển và phân phối thuốc của màng BC trên
nhiều các loại thuốc khác nhau nhằm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian
giải phóng của các loại thuốc đó.
* Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng BC từ chủng A. xylinum.
Từ màng BC đã đƣợc tạo ra đƣợc dùng làm hệ thống vận tải phân phối
3

Footer Page 11 of 161.


Header Page 12 of 161.

thuốc CM nhằm xác định lƣợng CM hấp thụ và giải phóng qua màng BC.
6. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phƣơng pháp tạo màng BC từ chủng A. xylinum trong môi trƣờng nƣớc
dừa già.
Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn của thuốc CM.
Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc CM hấp thụ đƣợc vào trong màng
BC.
Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc CM giải phóng từ màng BC – CM.
Phƣơng pháp phân tích động dƣợc học giải phóng của thuốc CM.
Phƣơng pháp xử lý thống kê.

4

Footer Page 12 of 161.


Header Page 13 of 161.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 . Tổng quan về đối tƣợng và lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Tổng quan về màng BC
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh BC
BC là sản phẩm của một số loài vi khuẩn nhƣ: Acetobacter,

Achromobacter, Agrobecterium. Trong đó Acetobacter xylinum sinh tổng họp
BC hiệu quả nhất và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất vì năng suất BC cao, cấu trúc
BC phù hợp cho nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau [2].
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter.
Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào [2].
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc:
 Lớp: Schizomycetes
 Bộ: Pseudomonadales
 Bộ phụ: Pseudomonadieae
 Họ: Pseudomonadaceae
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc ngang
khoảng 0,6 – 0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhƣng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trƣờng nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [2].
1.1.1.2. Cấu trúc của màng BC tạo bởi A. xilynum
Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polymer β - 1,4 glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của
BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể.

5

Footer Page 13 of 161.


Header Page 14 of 161.

Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đƣờng kính 1,5 nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp
thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [2].

1.1.1.3. Đặc tính của màng BC tạo bởi A. xylinum
Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trƣờng dinh dƣỡng
lỏng thành lớp màng mỏng nhƣ da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tƣơng tự nhƣ giấy da với độ dày 0,01 – 0,5 nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt nhƣ: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và
độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thƣờng, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là
khả năng cản khuẩn [2]. Với các tính chất này BC đƣợc ứng dụng rất nhiều
trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học.
1.1.1.4. Chức năng sinh lý của BC tạo bởi A. xylinum
A. xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharid ngoại bào, những tế bào vi
khuẩn này nằm trong mạng lƣới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt môi
trƣờng và thu nhận chất dinh dƣỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn không
nằm trong mạng lƣới polymer.
Cellulose có các đặc tính nhƣ độ bền cơ học cao, tính thấm và tính hút cao,
trạng thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trƣờng nhƣ
việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lƣợng
nƣớc bị giảm đi, các chất chuyển hóa đƣợc sinh ra [2].
1.1.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum nhằm thu màng BC
Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn
dinh dƣỡng cần thiết nhƣ nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu
tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng.
Nhu cầu sử dụng đƣờng ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng các
6

Footer Page 14 of 161.


Header Page 15 of 161.

sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhau nhƣ: rỉ đƣờng, chất
thải trong công nghệ sản xuất khoai tây và phomat, chất thải của nhà máy sản
xuất bột ngọt, nƣớc dừa già, nƣớc mía, … để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.
xylinum. Trong đó, nƣớc dừa già đƣợc xem là môi trƣờng kinh điển trong nuôi
cấy A. xylinum [2]. Thành phần của nƣớc dừa già [2] đƣợc trình bày nhƣ ở
bảng 1.1:
Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già
Nƣớc (%)

94,99

Đồng (mg/100g)

0,04

Protein (%)

0,72

Mangan (mg/100g)

0,142

Chất béo toàn phần (%)

0,2

Selenium (µg/100g)

1

Carbmkonhydrat (%)

3,17

Vitamin C (mg/100g)

2,4

Đƣờng (%)

2,16

Thiamin (mg/100g)

0,03

Calcium (mg/100g)

24

Riboflavin (mg/100g)

0,057

Sắt (mg/100g)

0,29

Niacin (mg/100g)

0,08

Magie (mg/100g)

25

Acid Panthenic (mg/100g)

0,043

Phosphorus (mg/100g)

20

Vitamin B6 (mg/100g)

0,032

Kali (mg/100g)

250

Folate (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0,1

Nƣớc dừa già là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nƣớc
dừa già chứa rất nhiều chất dinh dƣỡng và chất kích thích tố tăng trƣởng nhƣ
1,3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, … Vì vậy A.
xylinum rất thích hợp phát triển trong môi trƣờng này [2].
Nƣớc dừa sau khi thu hoạch đƣợc sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đƣờng và các chất dinh dƣỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [2].
7

Footer Page 15 of 161.


Header Page 16 of 161.

1.1.2. Tổng quan về thuốc CM
1.1.2.1. Công thức
CM là một chất kháng histamin H2 có chứa vòng imidazole và cấu trúc
tƣơng tự histamin [1].
Công thức phân tử: C10H16N6S
Phân tử lƣợng: 252,3
Độ nóng chảy: 142oC
Tên khoa học: N" – cyano – N methyl – N' - [2 - [[(5 – methyl - 1H imidazol – 4 - yl) methyl] thio] - ethyl] - guanidin [1]
Công thức cấu tạo:

1.1.2.2. Tính chất lý hóa
Bột kết tinh trắng hoặc gần nhƣ trắng [1].
Tan trong acid clohydric (HCl), khó tan trong nƣớc [1].
1.1.2.3. Tác dụng của CM
Tác dụng chủ yếu của thuốc CM là ức chế tế bào thành dạ dày tiết acid
với chỉ định rộng rãi trong điều trị chứng ợ nóng và loét dạ dày. Tuy nhiên,
trong quá trình sử dụng CM, các nhà lâm sàng đã phát hiện rất nhiều tác dụng
của nó trong một số bệnh nhờ cơ chế ức chế thụ thể histamin H2 của tế bào T ức
chế. Vì thế, ngoài tác dụng kháng tiết acid trong bệnh viêm loét dạ dày đƣợc
FDA Hoa Kỳ công nhận, CM còn đƣợc sử dụng trong điều trị một số bệnh da
liễu [29].

8

Footer Page 16 of 161.


Header Page 17 of 161.

1.1.2.4. Đặc điểm dƣợc động học
Hấp thu và sinh khả dụng
CM đƣợc hấp thu nhanh chóng, không hoàn toàn ở đƣờng tiêu hóa sau
khi uống thuốc. Theo Pedersen P.U, Miller R (1980), sinh khả dụng của thuốc ở
trong khoảng từ 56 - 68% ở bệnh nhân loét [23].
Nồng độ của CM trong huyết tƣơng đảm bảo làm giảm đến 50% lƣợng
acid tối đa là 0,5-1,0 mcg/ml [13].
Phân phối
Thể tích phân phối của CM ở mức xấp xỉ 0,8 – 1,39 L/kg. Tuổi bệnh
nhân càng tăng thì thể tích phân phối càng giảm. CM phân bố rộng khắp phần
lớn trong dịch cơ thể, các cơ quan và mô ngƣời, không có trong mô mỡ [11].

Tỉ lệ phân phối trung bình của CM giữa dịch não tủy và huyết thanh thay
đổi từ 0,03 – 0,18. Tỷ lệ này là 0,2 – 0,5 ở ngƣời bệnh gan hay thận. Tỉ lệ gắn
protein huyết tƣơng của CM là 18 – 26,3% ở mức nồng độ giữa 0,05 – 50
mcg/ml. Ở những bệnh nhân loét dạ dày tá tràng thì tỉ lệ này đạt khoảng 13 25% (trung bình 19%) [11].
Chuyển hóa và thải trừ
CM và chất chuyển hóa của nó đƣợc đào thải qua thận. Khoảng 50 - 80%
tổng lƣợng CM dùng đƣờng tiêm tĩnh mạch tồn tại dƣới dạng không đổi trong
nƣớc tiểu. Tỉ lệ này là 40% nếu dùng thuốc đƣờng uống. Sự chuyển hóa CM
chỉ chiếm khoảng 25 - 40% tổng lƣợng thải trừ của CM và quá trình này phụ
thuộc vào độ tuổi [11]. Nửa đời thải trừ của CM khoảng 2 giờ, tăng lên khi suy
thận. Sulphoxide cimetidine đƣợc chứng minh là chất chuyển hóa chính của
CM [31].
Độ tuổi đóng một vai trò quan trọng trong dƣợc động học của CM. Tuổi
càng trẻ thì độ thanh thải càng lớn, trừ trẻ sơ sinh, độ thanh thải này giảm một
nửa từ độ tuổi 30 - 65 [11]. Một lƣợng nhỏ liều thuốc tiêm tĩnh mạch đƣợc đào
9

Footer Page 17 of 161.


Header Page 18 of 161.

thải qua mật (Spence và cs, 1977) và phân (Griffiths và cs, 1977; Taylor và cs
1978). CM có thể qua hàng rào nhau thai, đƣợc bài tiết qua sữa mẹ và ở những
ngƣời mẹ cho con bú, thuốc vào đƣợc cơ thể trẻ nhiều mg/ngày [11].
1.1.2.5. Dƣợc lực học của CM
Các thử nghiệm trong ống nghiệm cho thấy CM là một chất đối kháng
cạnh tranh chọn lọc với thụ thể histamin H2 mà không có tƣơng tác có ý nghĩa
nào với catecholamin, thụ thể β, thụ thể histamin H1, thụ thể muscarinic và
không có tác dụng kháng cholinergic. CM làm giảm bài tiết và giảm nồng độ

acid dạ dày cả ở điều kiện cơ bản (khi đói) và khi đƣợc kích thích bởi thức ăn,
histamin, pentagastrin, insulin và cafein [33]. Vì quá trình tiết acid cơ bản dài
nhất xảy ra vào ban đêm nên việc dùng thuốc sau ăn tối hoặc trƣớc khi ngủ sẽ
đạt hiệu quả tối ƣu. CM cũng ức chế enzym cytochrome P - 450, cytochrome P
- 448 trong gan đồng thời với các hệ thống chức năng oxidase, đối kháng
dihydrotestosterone (hoạt động kháng androgen).
Ngoài ra, CM tăng cƣờng sự bảo vệ niêm mạc dạ dày và có khả năng
chữa khỏi các rối loạn liên quan đến acid, đặc biệt là loét và chảy máu dạ dày
do stress, bằng cách tăng sản xuất chất nhầy dạ dày, tăng tiết chất nhầy do
bicarbonat, tăng lƣu lƣợng máu ở niêm mạc dạ dày, tăng tổng hợp
prostaglandin nội sinh và tăng tốc độ tái tạo tế bào biểu mô [33].
1.1.2.6. Tác dụng phụ của CM
- Đƣờng tiêu hóa: Tiêu chảy (nhẹ), tần suất 1/100 bệnh nhân [18].
- Hệ thần kinh trung ƣơng: Đau đầu (nhẹ đến nặng), chóng mặt và buồn
ngủ (nhẹ). Các rối loạn tâm thần nhƣ kích động, trầm cảm, lo âu, ảo giác, mất
phƣơng hƣớng, mất đi sau 3 - 4 ngày ngừng thuốc [20].
- Nội tiết: Chứng vú to đã đƣợc báo cáo. Theo báo cáo của L.A. Garcia
Rodriguez và Hershel Jick tác dụng phụ này gặp ở những ngƣời dùng CM > 1
g/ngày trong thời gian từ 7 - 12 tháng, hiện tƣợng này thƣờng trở lại bình
10

Footer Page 18 of 161.


Header Page 19 of 161.

thƣờng khi ngừng điều trị [30, 31]. Theo S.M. Sabesin, nếu uống CM kéo dài
với liều > 5 g/ngày mới có thể gây bất lực và chứng vú to ở nam giới [27].
- Quá mẫn: Sốc phản vệ và viêm mạch máu quá mẫn.
- Thận: Tăng creatinin huyết thanh (tăng nhẹ). Có thể gặp viêm thận kẽ

và bí tiểu phải ngừng điều trị.
- Tim mạch: Nhịp tim chậm, nhanh và block nhĩ thất đã đƣợc báo cáo với
thuốc đối kháng thụ thể H2. S.Saltissi (1981) cho thấy không có sự thay đổi
đáng kể nào lên hệ tim mạch của 24 bệnh nhân dùng 400 mg CM/ngày trong 4
tuần [28].
- Cơ xƣơng khớp: Đau khớp và đau cơ tự hồi phục.
- Da và phần phụ: Phát ban nhẹ, hội chứng Stevens - Johnson, hoại tử
thựợng bì nhiễm độc, hồng ban đa dạng, đỏ da bong vảy toàn thân, rụng tóc.
1.2. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế
giới
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về màng BC
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu về màng BC tại Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng đƣợc quan tâm. Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [2] đã tiến
hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng BC từ A. xylium đạt hiệu cao. Đồng thời
nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng
màng BC điều trị bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô
và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng BC có cho thêm hoạt chất tái
sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ƣu điểm mà các loại
màng khác trên thế giới không có.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ
Quỳnh [5] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả
11

Footer Page 19 of 161.


Header Page 20 of 161.

cho thấy màng BC tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợ có sợi cellulose nhỏ, dai,
độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nƣớc tốt có triển vọng ứng dụng làm màng
trị bỏng.
1.2.1.2. Tình hình nghiên về màng BC trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng của
nó đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả Brown (1989), dùng
màng BC làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và
Farad, 1998, dùng màng nhƣ là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi
truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm [2].
BC đƣợc ứng dụng trong ngành dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả
Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon
(2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thƣơng hở, vết
bỏng đã thu đƣợc kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đƣợc đăng kí
bản quyền về làm màng BC từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và
Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, mặt nạ
dƣỡng da cho phụ nữ [2].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về CM
1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về CM
Ở Việt Nam, phần lớn CM đƣợc sử dụng là một loại thuốc để chữa trị
bệnh viêm loét và trào ngƣợc dạ dày, ngăn ngừa tái phát sau khi bị viêm loét dạ
dày.
Ngoài ra, CM còn đƣợc ứng dụng trong chữa các bệnh về da liễu, Hà
Nguyễn Phƣơng Anh của trƣờng Đại học Y dƣợc đã thành công với luận án:
Nhiễm Human papillomavirus trên bệnh nhân bị nhiễm trùng lây truyền qua
đƣờng tình dục và tác dụng của CM trong phòng tái phát bệnh sùi mào gà [1].

12

Footer Page 20 of 161.

Header Page 21 of 161.

1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về CM
Fukuda M và cs đã chứng minh hiệu quả của CM là một chất đối kháng
thụ thể histamin H2 điều trị tổn thƣơng dạ dày cấp tính, ung thƣ đại trực tràng
[15].
Arisawa T và cs có công trình nghiên cứu sự kết hợp CM và Rabeprazole
đơn trị liệu điều trị các tổn thƣơng dạ dày cấp tính thông qua đƣờng uống tái
tạo mô liên kết [12].
Nghiên cứu của Franco I. (2000) dùng CM với liều 30 – 40 mg/ngày, dùng
trong 3 tháng liền để chữa mụn cóc trên bốn trẻ em. Kết quả là bốn trẻ đều khỏi
mụn cóc [14].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về hƣớng nghiên
cứu
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng BC
làm hệ thống vận tải và phấn phối thuốc đƣợc báo cáo [17], trong đó có 9
nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng
BC và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite. Nhƣ vậy, trong lĩnh vực
này cần tiếp tục đƣợc tiến hành nghiên cứu.
M. C. I. Mohd Amin và cs đã nghiên cứu đánh giá tiềm năng của BC
hydrogels nhƣ là một hệ thống phân phối thuốc qua đƣờng uống. Nghiên cứu
đƣợc thử nghiệm trong dịch dạ dày mô phỏng và dịch ruột mô phỏng. Kết quả
cho thấy hidrogels phân phối chậm ở dịch dạ dày mô phỏng hơn so với dịch
ruột mô phỏng. Nhƣ vậy, BC hydrogels có thể thích hợp cho việc phân phối
thuốc qua đƣờng uống [21].
Amin và cs đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng phân phối thuốc
bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy màng BC có thể làm
thành một màng phim dẻo, trong suốt để phân phối thuốc, giúp cho thuốc đƣợc

giải phóng một cách kéo dài, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc [10]. Gần
13

Footer Page 21 of 161.


Header Page 22 of 161.

đây hơn, Lin Huang và cs [19] nghiên cứu việc sử dụng màng BC cho việc kiểm
soát in vitro của Berberin. Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm soát sự giải
phóng thuốc qua màng BC còn đƣợc thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột.
Các kết quả thu đƣợc cho thấy thuốc đã đƣợc giải phóng với một tốc độ chậm.
Jayswal BD, Yadav VT, Pater KN, Patel BA đã sử dụng Sodium alginate
– một polymer tự nhiên, đƣợc sử dụng làm hệ thống phân phối thuốc CM qua
đƣờng uống. Nghiên cứu đã xây dựng và đánh giá các Sodium alginate và
pectin dựa trên In situ gel của CM. Kết quả nghiên cứu cho thấy các thí nghiệm
có chứa 1,2% natri alginate và 1,5% pectin có khả năng hấp thụ thuốc tốt hơn
và thời gian giải phóng thuốc dài hơn [16].
Nghiên cứu của A. K. Srivastava và cs liên quan đến việc đánh giá các vi
cầu khuẩn nổi với CM nhƣ mô hình kéo dài thời gian cƣ trú thuốc tại dạ dày.
Các vi cầu đƣợc chuẩn bị bằng phƣơng pháp bay hơi dung môi sử dụng polymer
hydroxyporyl methyl celllulose và ethyl cellulose. Hình dạng và bề mặt hình
thái của vi cầu đƣợc quan sát bằng kinh hiển vi quang học và kính hiển vi điện
tử quét. Kết quả cho thấy nồng độ polymer, kích thƣớc vi cầu khuẩn, thành
phần dung môi ảnh hƣởng tới thời gian giải phóng thuốc. Kích thƣớc hạt vi cầu
khuẩn tăng lên, nồng độ polymer cao hơn thì thời gian cƣ trú CM tại dạ dày
tăng lên [7].
Hiện chƣa có đề tài nào nghiên cứu việc sử dụng màng BC làm hệ thống
vận tải và phân phối thuốc CM qua đƣờng uống.

14

Footer Page 22 of 161.


Header Page 23 of 161.

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng đƣợc cung cấp bởi phòng thí
nghiệm vi sinh trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
 Nguyên liệu: Nƣớc dừa già
 Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và các hóa chất thông thƣờng
có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam:
 CM dạng tinh khiết > 99%
 Đƣờng glucose
 Pepton
 (NH4)2SO4
 Acid acetic
 NaOH, HCl
 Nƣớc cất
 KH2PO4
2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
 Bể ổn nhiệt 1013
 Bể rung siêu âm S60/H
 Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
 Cân kĩ thuật TE412

 Cân phân tích (Sartorius – Thụy sỹ)
 Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)
 Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)

15

Footer Page 23 of 161.


Header Page 24 of 161.

 Nồi hấp khử trùng HV – 110/ HIRAIAMA
 Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)
2.2.2. Dụng cụ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Bình định mức loại 100 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet chính xác 1 ml, 5 ml,
10 ml, ... giấy bạc, giấy thấm và một số dụng cụ khác.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp tạo màng BC
Tạo màng BC có cải tiến từ môi trƣờng chuẩn Hestrin – Schramm [32]
bằng cách thay cao nấm men bằng nƣớc dừa già nhƣ đƣợc trình bày trong bảng
2.1
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng BC
Đƣờng Glucose
Nƣớc dừa già

20 g KH2PO4

2g

1000 ml Acid axetic

2%

Pepton

4 g Dịch giống A. xylinum

(NH4)2SO4

3g

10%

Môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 113oC trong 15 phút. Tiếp tục khử
trùng bằng tia UV trong 30 phút.
Để nguội môi trƣờng sau đó bổ sung 10% dịch giống và 2% acid axetic.
Sau đó nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 26oC trong 6 – 14 ngày [2].
Sau khi nuôi cấy tĩnh 6 – 14 ngày ở 26oC, màng BC đƣợc nhúng vào
nƣớc cất. Sau đó màng BC đƣợc tinh chế nhiều lần theo quy trình đƣợc trình
bày trên sơ đồ 1 [2]

16

Footer Page 24 of 161.


Header Page 25 of 161.

Tách màng BC
Ép loại nƣớc

Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nƣớc
48 giờ, kiểm tra tạp
chất
BC tinh chế
Sơ đồ 2.1. Quy trình thu nhận màng BC
- Tách BC: Trong môi trƣờng nuôi cấy tĩnh BC tạo thành màng dày ở mặt
môi trƣờng nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trƣờng.
- Ngâm NaOH: Trong màng chƣa một lƣợng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm
màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội
độc tố của vi khuẩn.
- Ngâm HCl: Màng BC sau khi đƣợc ngâm bằng NaOH rửa nƣớc rồi ép
màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
- Ngâm nƣớc: Màng sau khi ngâm với nƣớc rửa rồi ép màng. Ngâm nƣớc
đến trung hòa hết acid, thời gian khoảng 48 giờ ta thu đƣợc BC tinh chế.
- BC sau khi đƣợc tinh chế sấy 90oC trong 4 giờ để loại bỏ nƣớc.

17

Footer Page 25 of 161.