Nghiên cứu quy trình vi nhân giống lan hồ điệp mãn thiên hồng (doritaenopsip)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
----------------------

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
LAN HỒ ĐIỆP MÃN THIÊN HỒNG
(DORITAENOPSIP)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Hà Nội, 2016


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Nguyễn Văn Mã, TS.
La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng
góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời
cảm ơn.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội,25 tháng 04 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Thủy


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội, 25 tháng 04 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Thủy


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... 1
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. 3
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa của đề tài.......................................................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Giới thiệu về lan Hồ điệp .......................................................................... 4
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................ 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 4
1.1.3. Điều kiện sinh thái .................................................................................. 6
1.2. Tình hình sản xuất lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước ..................... 7
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa trên thế giới ....................................................... 7

1.2.2. Tình hình sản xuất hoa lan trong nước ................................................... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước .............. 10
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới........................................................ 10
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 13
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 13
2.2. Vật liệu thực vật ....................................................................................... 13
2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ ...................................................................... 13
2.2.2. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 13
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................... 13


2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 14
2.3.1. Tạo vật liệu khởi đầu............................................................................. 14
2.3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng ....... 15
2.3.3. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh .......................................................... 16
2.3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên...................... 17
2.4. Phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm .................................................. 17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 18
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu................................................................................ 18
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng .......... 20
3.2.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ mảnh lá................................... 20
3.2.2. Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân....... 22
3.3. Ra rễ tạo cây lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh................ 24
3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên......................... 26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 30
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 34

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ cành hoa ...................................... 18
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến quá trình tái sinh ..................... 20
và nhân nhanh chồi bất định từ mô lá ................................................. 20
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro ........ 22
từ đốt thân của lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau 6 tuần nuôi cấy ....... 22
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP và nước dừa đến quá trình nhân nhanh chồi in
vitro từ đốt thân của lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau 6 tuần nuôi cấy
............................................................................................................. 23
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của cây lan Hồ
Điệp in vitro sau 4 tuần nuôi cấy ........................................................ 25


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu ..................................................................... 19
Hình 3.2. Quá trình tạo mô sẹo và hình thành chồi từ mô lá........................ 21
Hình 3.3. Nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng từ đốt thân ...
......................................................................................................... 24
Hình 3.4. Cây lan Hồ điệp in vitro ra rễ ........................................................ 26
Hình 3.5. Hình ảnh rèn luyện lan Hồ điệp mãn thiên hồng ........................... 26


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

Tp.HCM:

Thành phố Hồ Chí Minh


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hoa lan, là một trong những họ thực vật có hoa đa dang nhất, bao gồm
25000 loài và 800 chi được xác định [40]. Chiếm 8% thương mại hoa trên thế
giới [28]. Nó không đòi hỏi diện tích trồng quá lớn nhưng lại cho giá trị kinh tế
cao. Lan hồ điệp (Phalaenopsis) thuộc họ Orchidaceae, là một trong những
giống lan rất được yêu thích trên thế giới [29]. Chính màu sắc đa dạng, kiểu
dáng khác lạ đã tạo ra nét đẹp sang trọng và trang nhã cho hoa lan và đặc biệt
là sự bền bỉ lâu tàn đặc trưng của hoa lan càng tôn thêm giá trị cho loài hoa quý
này. Lan hồ điệp (Phalaenopsis) đem lại hiệu quả kinh tế cao ở cả dạng hoa cắt
cành và trồng chậu [37]. Có nhiều nước và khu vực đã thành công với công
nghệ trồng hoa lan Hồ điệp (Phalaenopsis) xuất khẩu như: Thái Lan, Đài Loan,
Trung Quốc [7].
Theo thống kê của trung tâm nghiên cứu hoa, cây cảnh – Viện Nghiên
cứu Rau quả, năm 2008 trở về đây quy mô sản xuất lan Hồ điệp thương mại đã

tăng lên đáng kể và tăng dần đều qua các năm cả về diện tích, số lượng, cũng
như mức độ đầu tư: Diện tích toàn miền bắc trước năm 2005 là 1.200m2 và
23.000 cây, năm 2012 diện tích toàn miền bắc đã tăng lên 24.100m2 và 333.000
cây. Tuy thế lượng cung vẫn không đủ cầu và vẫn phải nhập 230.000 cây từ
Trung Quốc và Đài loan. Nhu cầu cây giống và cây lan thương mại của Việt
Nam cao như vậy nhưng thực tế phương thức sản xuất hoa lan Hồ Điệp ở miền
Bắc Việt Nam chủ yếu vẫn là hình thức nhập cây con, cây nhỡ và cây đã có
cành hoa về chờ hoa nở để tiêu thụ. Như vậy việc sản xuất giống ở Việt Nam
còn rất hạn chế, không chủ động nguồn giống trong sản xuất cả về số lượng
cũng như chủng loại. Lan hồ điệp là cây đơn thân, việc nhân giống trong tự
nhiên gặp nhiều khó khăn. Để sản xuất lan Hồ điệp theo quy mô công nghiệp,

1


bắt buộc phải nhân giống bằng con đường vô tính thông qua nuôi cấy mô. Trên
thế giới đã có nhiều tác giả thành công trong nhân giống vô tính lan Hồ điệp.
Trước đây, các nghiên cứu thường tập trung vào lai tạo giống mới, số lượng và
kích thước hoa, và đã có trên 100.000 giống lai được sản xuất công nghiệp
trong đó bao gồm lan Hồ điệp mãn thiên hồng (Doritaenopsip Queen Beer “
Red Sky” là giống lai giữa Doritis pulcherrima và Phalaenopsis Meteor [36].
Lan Hồ điệp mãn thiên hồng là loài được đánh giá cao nhất về cả sắc đẹp lẫn
thời gian chơi hoa. Cây phong lan Mãn thiên hồng (Doritaenopsis sp.) là loài
có giá trị kinh tế cao cả ở trong nước lẫn nước ngoài [32]. Tuy nhiên, các giống
lan Hồ điệp lai thường khó nhân giống vô tính và không đồng nhất [37].
Các phương pháp in vitro một số loài thuộc chi này thường sử dụng mẫu
đỉnh chồi [31], cành hoa được cắt đốt [39], đầu rễ [41], mảnh lá [32], nuôi cấy
lớp tế bào biểu bì [37], hoa [45] nhằm cung cấp lượng cây giống cho thị trường.
Sử dụng mảnh lá có nguồn gốc từ tái sinh từ cành hoa sẽ không gây ảnh hưởng
đến cây mẹ [38], [42].

Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình vi nhân
giống lan Hồ điệp mãn thiên hồng (Doritaenopsip)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nhân nhanh lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ mảnh lá và đốt thân
bắt nguồn từ cành hoa.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu khởi dầu lan Hồ điệp mãn thiên hồng
- Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ mô lá
- Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân
- Ra rễ tạo cây lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh
- Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên

2


4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa lí luận
Nhằm góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu quy trình nhân
giống in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô góp phần
vào ứng dụng sản xuất giống hoa lan Hồ điệp mãn thiên hồng nhằm cung cấp
đủ số lượng hoa trong nước có chất lượng cao. Từ đó khắc phục dịch bệnh trên
hoa thương phẩm do nhập khẩu.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về lan Hồ điệp
1.1.1. Vị trí phân loại
Cây hoa lan Hồ điệp thuộc:
Ngành

: Magnoliophyta

Lớp

: Liliopsida

Bộ

: Orchidales

Họ

: Orchidaceae

Mãn thiên hồng là loại lan lai giữa lan Hồ điệp Phalaenopsis Meteor và
Kim hồ điệp Doritis pulcherrima nên rất khó phân loại. Chúng mang cả hai đặc
điểm của bố và mẹ: hoa to, nhiều và đẹp, cây dễ trồng.
1.1.2. Đặc điểm hình thái
1.1.2.1. Cơ quan sinh dưỡng
 Thân
Lan hồ điệp thuộc loại đơn thân, ngắn, không có giả hành nên trong tự
nhiên chúng sinh trưởng chậm. Ở điều kiện thuận lợi mọc ra các lá mới theo
phương thẳng đứng còn cành hoa thì mọc ở rìa thân hoặc nách lá. Vì lan rất khó
ra chồi nhánh nên không dùng phương pháp tách cây để nhân giống. Thân lan
Hồ điệp ngoài tác dụng giữ cây thẳng đứng còn có chức năng tích trữ chất dinh

dưỡng và nước.
 Lá
Lá lan Hồ điệp đơn, mọng nước hình bầu dục, mọc đối xứng có bẹ ôm
thân lá dưới cùng héo rụng thì lá mới mọc lên từ ngọn, một cây có 4-5 lá. Căn
cứ vào màu sắc của lá có thể phân biệt được màu sắc hoa của chính nó, lá màu
xanh thường ra hoa màu trắng hoặc hoa màu nhạt, còn các lá màu khác thường

4


cho hoa màu đỏ. Thông thường bề mặt trên của lá không có khí khổng, lan Hồ
điệp là loài thực vật CAM, nên khí khổng thường mở ra vào ban đêm để thu
nhận CO2 dự trữ trong cơ thể, vào ban ngày, CO2 được giải phóng để tham gia
vào quá trình quang hợp. Do đó ban ngày cây ít bị mất nước, thoát hơi nước.
Nếu gặp phải điều kiện khô hạn thì khí khổng sẽ đóng lại, quá trình quang hợp
chỉ xảy ra vừa đủ cho lượng CO2 tạo ra trong quá trình hô hấp. Đây chính là
nguyên nhân làm cho lan Hồ điệp mặc dù không có giả hành nhưng lại có khả
năng chịu hạn tốt.
 Rễ
Rễ lan Hồ điệp không phân nhánh rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh, rễ dạng
hình tròn, to, mập, có lông hút rõ ràng. Lan có rễ khí sinh phát triển mạnh, màu
xanh có khả năng quang hợp. Số lượng rễ khá nhiều, rễ to, bám chặt vào giá thể
có lớp mô xốp, dễ dàng cho việc hút nước, muối khoáng và chất dinh dưỡng.
1.1.2.2. Cơ quan sinh sản
 Hoa
Cành hoa của lan Hồ điệp thường mọc ở nách lá trưởng thành thứ 3 hoặc
thứ 4 [34]. Cành hoa đơn hay phân nhánh, mang hoa ở hai bên, hoa đính vào
trục nhờ cuống hoa. Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh
vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có sắc khác hẳn gọi
là cánh môi. Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật. Nhị và nhụy

dính liền thành cột nhị nhụy. Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn, có
chuôi và gót dính ở phía dưới. Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới. Bộ
nhụy gồm ba lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang nhiều noãn, đính bên
(Hoàng Thị Sản, 2003).
Trong giai đoạn trổ hoa sự phát triển của cơ quan dinh dưỡng bị chậm
lại nhưng nếu tưới nước và chất dinh dưỡng đầy đủ thì cây vẫn tăng trưởng tốt.
Những đoạn lóng mang mầm hoa thay kích thước chiều dài khác nhau, tùy
thuộc vào giống và chế độ trồng trọt (Troll, 1974).

5


 Quả
Quả của lan Hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo
hai bên đường của giá noãn. Quả có nhiều hạt, hạt nhỏ li ti không chứa nội nhũ,
phôi không phân hóa, tùy vào giống, loài hạt có thể từ vài trăm đến vài nghìn
hạt. Hạt cần trải qua 130-150 ngày để trưởng thành, hạt mở sau 90 ngày. Hạt
nhỏ được gió mang xa như hạt bụi, phần lớn hạt bị chết vì chứa phôi chưa phân
hóa. Người ta có thể đánh thức các “phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc
thẩm thấu bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường sucroser [9].
1.1.3. Điều kiện sinh thái
Hồ điệp là một loại lan của vùng nhiệt đới mà sự tăng trưởng của chúng
chịu hai mùa mưa, nắng rõ rệt. Tuy nhiên Hồ điệp chỉ xuất hiện ở các vùng
rừng ẩm hoặc ven suối. Không có sự biến động rõ rệt về độ ẩm giữa mùa mưa
và mùa khô, nơi Hồ điệp sinh sống, vì thế cây lan Hồ điệp không có mùa nghỉ,
mặc dù do dự bất lợi về thời tiết trong mùa khô. Cây Hồ điệp có sự tăng trưởng
chậm hơn chút ít so với mùa mưa trong điều kiện tự nhiên [5].
 Nhiệt độ
Nhiệt độ lí tưởng tối thiểu từ 22-25oC vào ban ngày và 18oC vào ban
đêm. Tuy nhiên Hồ điệp là loài lan chịu nóng hơn so với đa số loài lan khác,

do đó cũng có thể sinh trưởng khá tốt ở nơi có nhiệt độ ban ngày là 35oC và
ban đêm là 25oC [8]. Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự ra hoa của lan Hồ điệp, khi
nhiệt độ lên đến 30oC cây không ra hoa. Tình trạng này có thể liên quan đến sự
suy giảm của các axit Giberinic và các Cytokinin của thân cây [26], [27].
 Độ ẩm và ánh sáng
Độ ẩm tối thiểu cần thiết là 60%, với độ ẩm này nước ta đủ thoả mãn với
điều kiện yêu cầu tốt nhất, vì đây là độ ẩm thấp nhất trong những ngày mùa
khô.

6


Giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng: ẩm độ 70 – 75%, ánh sáng 50008000lux [8].
Giai đoạn nở hoa: ẩm độ 65 – 75%, ánh sáng 8000 – 12000lux [8].
1.2. Tình hình sản xuất lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa trên thế giới
Hiện nay tình hình sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách
mạnh mẽ và trở thành một ngành thương mại có lợi ích kinh tế các nước trồng
và xuất khẩu hoa. Diện tích trồng hoa trên thế giới ngày được mở rộng và không
ngừng tăng lên, nhiều tạp chí về hoa lan được xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về
lan được tổ chức. Trước đây việc nuôi trồng và xuất khẩu chủ yếu là lan rừng
nên nguy cơ khoảng 13 loài tuyệt chủng, ngày nay việc trồng lan đã đạt dần
theo quy mô công nghiệp, việc xuất khẩu hoa lan đạt đến hàng trăm ngàn giỏ,
hàng vạn cành lan trong một năm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị
trường.
Việc sản xuất hoa lan ngày càng tăng với quy mô lớn, nhiều nước đã trở
thành cường quốc xuất khẩu hoa lan như Thái Lan, Đài Loan... Nhờ khả năng
thực hiện công nghệ mới trong nuôi cấy mô và lai tạo, Thái Lan là nước đứng
đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan. Năm 2012 tổng diện tích trồng 7420 mẫu
với sản lượng xuất khẩu đạt 2403 kg/mẫu cho 148 nước thu về 17,8 triệu

USD, trong đó thị trường xuất khẩu chính là Nhật Bản, Mỹ, Ý và Trung Quốc
[33].
Đài Loan là Quốc gia có khí hậu ấm áp, mưa nhiều và gần giống với khí
hậu Việt Nam nên có thể sản xuất hoa tươi quanh năm, Đài Loan đang tăng
nhanh sản xuất Phalanenosis và cho tạo nhiều giống mới, hiện nay đã tạo ra
được một số giống lan quý có khả năng cắt hoa và trồng trong chậu (Segrback,
1985). Hiện nay, Đài Loan có diện tích sản xuất lan Hồ Điệp khoảng 200 ha
chiếm 1/3 tổng diện tích trồng lan. Vùng sản xuất chính tập trung ở Đài Nam,

7


Gia Nghĩa, Vân Lâm và Đài Đông. Sản lượng trung bình hàng năm đạt 150
triệu cây. Theo số liệu số liệu thống kê của uỷ ban nông nghiệp và tổng cục
thuế - Bộ tài chính Đài Loan cho thấy, kim ngạch xuất khẩu mặt hàng hoa năm
2010 đạt 149 triệu USD, trong đó lan Hồ Điệp chiếm 55% tổng kim ngạch
ngành hoa tương đương 82,55 triệu USD tăng 32% so với 2009 (62,68 triệu
USD). Các dạng sản phẩm xuất khẩu là cây giống đã ra ngôi, cây con nuôi cấy
mô chưa ra ngôi và hoa cắt cành. Cây giống thương phẩm có giá trị xuất khẩu
cao nhất, năm 2010 ước đạt 80% tổng kim ngạch xuất khẩu (Lê Đặng Trung
Tuyến, 2007).
Malaysia là Quốc gia có được sự quan tâm của chính phủ và sự phát triển
nhanh chóng của nghề trồng hoa, đến nay đã có đủ khả năng cạnh tranh với thế
giới và chiếm phần đáng kể ở Châu Á, công nghiệp lan cắt cành tăng khoảng 7
triệu USD năm 1998 và 20 triệu USD năm 1994, thị trường xuất khẩu chủ yếu
là Singapore, Nhật, Úc…[10].
Hà Lan là nước đã đầu tư 20 triệu USD vào Ấn Độ để lắp đặt các thiết bị
máy móc đầu tư cho sản xuất hoa lan xuất khẩu. Tính đến năm 2003, kim ngạch
xuất khẩu hoa phong lan của Hà Lan đạt 1,8 tỷ USD. Hoa phong lan của Hà
Lan được trồng trong nhà kính với tổng diện tích là 3081,75ha.

Nhật Bản là Quốc gia đã đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng
cơ sở sản xuất với công suất 10 triệu cây lan mỗi năm và hiện nay Nhật cũng
là khách hàng lớn nhất của Singapore với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan của
nước này [2].
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa lan trong nước
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh
năm rất thuận lợi cho việc trồng hoa, cây cảnh. Tuy nhiên chưa được đầu tư
thích đáng nên ngành trồng hoa nói chung và ngành trồng lan nói riêng vẫn
chưa thực sự phát triển, sản xuất lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở

8


các tỉnh phía Nam, đặc biệt là Đà Lạt và Thành phố Hồ Chí Minh. Thành phố
Hồ Chí Minh có khí hậu ấm áp quanh năm là trung tâm văn hóa kinh tế, chính
trị, khoa học kỹ thuật của miền Nam có một tiềm năng lớn về nuôi trồng và
kinh doanh hoa lan. Từ năm 1980 Việt Nam đã xuất khẩu lan sang Liên Xô,
Tiệp Khắc. Hội Hoa Xuân là nơi hội tụ những tác phẩm đặc sắc và độc đáo nhất
của các vườn lan. Mới đây thành phố Hồ Chí Minh dự kiến, giai đoạn 2005 –
2006 thực hiện đầu tư 20ha nuôi trồng hoa lan và 20ha trồng cây cảnh (Dự án
đầu tư, cây và cá cảnh tại thành phố Hồ Chí Minh, T7/2005), đặc biệt là phải
kể đến trang trại Risun tại Gia Hiệp – Di Linh – Lâm Đồng đã đầu tư trang thiết
bị hiện đại có thể tự tạo ra nguồn cây giống để sản xuất, sản phẩm đặc biệt ở
đây là lan Hồ Điệp với 16 – 17 màu khác nhau. Ở Hà Nội, mười năm gần đây,
khi đời sống người dân thủ đô nâng cao, nhu cầu thưởng thức hoa lan tăng,
nhiều khi cung không đủ cầu và phong trào nuôi trồng lan tự phát lan rộng cả
đến các vùng phụ cận khiến các nhà khoa học phải vào cuộc, đi sâu nghiên cứu
và sản xuất, kinh doanh hoa lan. Tại Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Trường
Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã cho ra đời hàng vạn cây giống hoa lan có giá
trị kinh tế như: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), lan Thái

(Dendrobium)… Ngoài ra viện còn làm cố vấn kỹ thuật, chuyển giao quy trình
nuôi trồng một số giống lan có hiệu qủa kinh tế ở các tỉnh như Hải Phòng, Bắc
Giang, Lạng Sơn… và tại Trung tâm Kỹ thuật Rau – Hoa – Quả Hà Nội, 2 năm
trở lại đây, phòng nuôi cấy mô hoạt động cho ra đời mỗi năm hàng vạn cây lan
Hồ điệp giống và hàng vạn cây giống khác, đặc biệt đã thành công trong việc nhân
giống (Lê Đặng Trung Tuyến, 2007).
Ngành sản xuất hoa lan ở các tỉnh, thành phố phía Nam phát triển mạnh
hơn miền Bắc. Nói chung vấn đề sản xuất – kinh doanh – xuất khẩu hoa lan ở
Việt Nam từ trước đến nay vẫn còn ở mức tiềm tàng, trong khi đó sức cạnh
tranh thị trường trên thế giới là rất lớn, những hoạt động, kinh doanh và xuất

9


khẩu trong thời gian qua chỉ có ý nghĩa khởi động và hứa hẹn sự phát triển
trong tương lai.
1.3. Tình hình nghiên cứu lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nhân giống Mãn thiên hồng bằng cách tạo cây con trên cành hoa. Chồi
của Mãn thiên hồng được tạo ra ngay trên cành hoa có mang mầm ngủ bằng cách
bao quanh đốt một lớp rêu nước để giữ ẩm (Shara, 1938, 1952). Trong những
năm gần đây, chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng để cảm ứng tạo
cây con trên cành hoa trong in vitro.
Cành hoa có mang mầm ngủ của cây Mãn thiên hồng được cắt thành
từng đoạn được khử trùng và đặt trên môi trường nuôi cấy. Kết quả ghi nhận
được từ nuôi cấy đoạn cành hoa có mang mầm ngủ của nhiều tác giả cho thấy
từ các mầm ngủ của đoạn cành hoa sẽ phát triển tạo cây con trực tiếp [25], [39].
Khi dùng phương pháp này không phá hủy và gây nguy hiểm đến cây mẹ,
phương pháp này bị giới hạn chỉ có giá trị cho nhân giống tạo chồi từ cành hoa
nên hệ số nhân giống không [25].

Năm 1993, Tokuhara và Mii kết luận rằng BAP kết hợp NAA cùng muối
khoáng đa lượng và vi lượng ảnh hưởng đến quá trình vi nhân giống lan Hồ
điệp. Tuy nhiên, tác giả Tse và cộng sự, (1971) [44] cho rằng NAA hiện diện
trong môi trường nuôi cấy làm giảm sự hình thành chồi. IAA, KNA (auxin –
potassium α naphtaleneacetate) và 2,4D làm tăng chiều dài của chồi sơ cấp
nhưng lại ức chế các giai đoạn sau đó (Koch, 1974). Để kích thích tăng lượng
số chồi thì các mầm ngủ trên các đoạn của cành hoa được cảm ứng khi nuôi
cấy trên môi trường REM có bổ sung 25mg/l BA.
Park et al (2003) đã nghiên cứu về sự hình thành chồi bất định từ rễ lan
Hồ điệp. Rễ được cảm ứng khi chuyển chúng sang môi trường không chứa chất
điều hòa sinh trưởng thực vật nhưng có chứa 10% dịch chiết chuối [25].

10


Nhân giống lan Mãn thiên hồng thông qua việc tạo mô sẹo. Protocorm
các mảnh lá của chồi được tạo thành từ cành hoa [37], [44]. Một vài chồi hoa
lan Mãn thiên hồng không tăng trưởng tiếp tục mà được cảm ứng để tạo thành
mô sẹo [30], [44]. Mỗi đoạn mang chồi trước khi đặt vào môi trường Knudson
C hay môi trường Mureshige – Skoog có hoặc không bổ sung 2,0 mg/l NAA,
phải gây viết thương bằng cách cắt theo hướng chéo và song song với trục thân
hoặc đâm vào đỉnh chồi mầm ngủ bằng dao cấy vô trùng. Kết quả mô sẹo được
hình thành [25]. Takana (1976), nuôi cấy chóp rễ từ cây gieo hạt in vitro và thu
nhận được dạng mô sẹo màu vàng, các mô sẹo tếp tục phát triển thành PLB và
tái sinh tạo cây con. Sakawa (1990), đã tạo được mô sẹo Phalaenopsis và đề
nghị quy trình nhân giống. Kim và cộng sự (1994) đã thu được dạng mô sẹo tơi
xốp có màu vàng sáng khi nuôi cấy lát cắt mỏng của cành hoa Phalaenopsis,
các mô sẹo này tiếp tục phát triển PLB và tái sinh thành cây con.
Ngoài ra còn các công trình nghiên cứu khác: Sử dụng mẫu đỉnh chồi
(Intuwong và Sagawa, 1974); nuôi cấy lớp tế bào biểu bì (Park, 2002), dùng

môi trường MS lỏng bổ sung IAA – ala và BAP để tạo ra số lượng lớn PLB từ
chồi con có hai lá được phát triển từ mầm ngủ. Kết quả PLB được phát triển từ
phần gốc lá [25]...
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cytokinin được trộn với chất mang và xử lí trực tiếp lên cành hoa (Võ
Thị Bạch Mai, 1996). Năm 2011, Nguyễn Thị Nga cùng các cộng sự nghiên
cứu nuôi cấy mầm ngủ cành hoa lan Hồ điệp (Phalanenosis), cành hoa sau khi
khử trùng được cắt thành mẫu cấy là những đoạn dài 1-1,5 cm có mang mầm
ngủ; mẫu cấy được nuôi trên môi trường tạo chồi và rễ. Kết quả, các vị trí khác
nhau của mầm ngủ trên cành hoa ảnh hưởng khả năng tạo chồi và sau 2 giai
đoạn tạo chồi và ra rễ hình thành cây hoàn chỉnh.

11


Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong giống
lan Hồ Điệp lai – Phalaenopsis hybrid (Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn
Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xô, 2007) kết quả cho thấy trong giai
đoạn nhân chồi ở hệ thống TIS cao gấp 3,6 lần so với nuôi cấy trên thạch, từ đó
giúp gia tăng tỉ lệ cây con lên đếm 10,3 lần so với phương pháp truyền thống
[6].
Nguyễn Thị Sơn và cộng sự (2014) đã nghiên cứu thăm dò khả năng phát
sinh hình thái soma từ các vật liệu khác nhau của lan Hồ điệp hoa trắng nhị
vàng. Kết quả cho thấy các mảnh lá và đầu rễ in vitro có khả năng hình thành
protocorm.
Ngoài ra còn nghiên cứu của các tác giả khác như: Tạo phôi từ vài cơ
quan Phalanenopsis trong nuôi cấy in vitro (Lê Văn Hướng, 2005)...

12

CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ 10/2014 – 11/2015, tại phòng Sinh lí Thực
vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2. Vật liệu thực vật
Cây lan Hồ điệp mãn thiên hồng do phòng Sinh lí Thực vật, khoa Sinh –
KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị:
Cân kĩ thuật: GM612 (Đức), tủ lạnh sâu: FRIGO, máy đo pH:
HM30G/TOA (Đức), nồi hấp khử trùng: HV – 110/HIRAYAMA (Nhật), máy
cất nước hai lần (Trung Quốc), buồng cấy vô trùng: AV-100/TELSTAR,
micropipet Jinson các loại 200-1000µl (Pháp), máy khấy từ ra nhiệt
ARE/VELP (Italia).
Dụng cụ: các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml,
15ml...), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, panh,
kéo...
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962).
Chất điều hòa sinh trưởng: BAP, NAA do hãng Duchefa của Hà Lan cung cấp.
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
- Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 50008000lux.
- Quang kì: 16 giờ/ngày.

13

- Nhiệt độ phòng: 250C – 270C.
- Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Chọn cành hoa có chồi ngủ, cắt thành các đoạn (2-3 cm) chứa mắt ngủ.
Rửa sạch dưới vòi nước, khử trùng bề mặt của mẫu cấy bằng etanol 70% và
dung dịch javel (5%, 7%, 10%, 15%) trong thời gian (5 phút và 7 phút ), cuối
cùng rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần. Mẫu được nuôi cấy trên môi
trường ½ MS (Murashige và Skoog, 1962), sacarozơ 30g/l và agar 6 g/l. Theo
dõi tỷ lệ mẫu sạch-sống sau 7 ngày nuôi cấy.
Bảng 2.1. Công thức khử trùng bề mặt các đoạn của cành
hoa lan Hồ điệp mãn thiên hồng
Công thức

Chất xử lí/thời gian

ĐC

Xử lí sơ bộ

CT1

Xử lí sơ bộ+Javen5%(v/v)/5 phút

CT2

Xử lí sơ bộ+Javen5%(v/v)/7 phút

CT3

Xử lí sơ bộ+Javen7% (v/v)/5 phút

CT4

Xử lí sơ bộ+Javen7% (v/v)/7 phút

CT5

Xử lí sơ bộ+Javen10% (v/v)/5 phút

CT6

Xử lí sơ bộ+Javen10% (v/v)/7 phút

CT7

Xử lí sơ bộ+Javen15% (v/v)/5 phút

CT8

Xử lí sơ bộ+Javen15% (v/v)/7 phút

14


Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%): (tổng số mẫu nhiễm/ tổng số mẫu cấy vào)x100
- Tỷ lệ mẫu sống (%): (tổng số mẫu sống/ tổng số mẫu cấy vào)x100
- Tỷ lệ mẫu chết (%): (tổng số mẫu chết/ tổng số mẫu cấy vào)x100
2.3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng

2.3.2.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ mô lá
Lá của chồi tái sinh từ cành hoa 12 tuần tuổi được sử dụng. Mảnh lá được
cắt với kích thước 1,0-1,5cm2, được nuôi cấy lên môi trường ½MS, sacarozơ
30g/l, agar 6 g/l, bổ sung BAP và NAA với các nồng độ khác nhau như bảng
2.2.
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến quá trình nhân nhanh
chồi in vitro từ mô lá lan Hồ điệp mãn thiên hồng
Môi trường

BAP(mg/l)

NAA(mg/l)

L1

9,0

1,0

L2

9,0

1.5

L3

10,0

1,0

L4

10,0

1,5

L5

11,0

1,0

L6

11,0

1,5

Đánh giá quá trình phát sinh hình thái chồi, hệ số nhân nhanh chồi sau 12 tuần
nuôi cấy.
2.3.2.2. Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân
Chồi tái sinh từ cành hoa được đặt sang môi trường nhân nhanh. Đối với
đốt thân, kích thước 3 cm được nuôi cấy lên môi trường ½MS, sacarozơ 30g/l,
agar 6 g/l và BAP với các nồng độ khác nhau (2,5mg/l, 5mg/l, 8mg/l, 10mg/l)

15


hoặc BAP (2,5mg/l, 5mg/l, 8mg/l, 10mg/l) kết hợp nước dừa 10%(v/v) (bảng

2.3)
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BAP và nước dừa đến quá trình
nhân nhanh chồi lan Hồ điệp in vitro từ đốt thân
Môi trường

Có nước dừa

Không có nước dừa

T1

B2,5 (mg/l)

B2,5 (mg/l)

T2

B5,0 (mg/l)

B5,0 (mg/l)

T3

B8,0 (mg/l)

B8,0 (mg/l)

T4

B10,0 (mg/l)

B10,0 (mg/l)

Đánh giá các chỉ tiêu sau 8 tuần nuôi cấy:
- Số chồi/mẫu
- Số lá/chồi
- Chiều cao chồi (cm)

2.3.3. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung NAA với
các nồng độ khác nhau như bảng 2.4. Nhằm xác định nồng độ NAA thích hợp
cho quá trình tạo rễ của cây.
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ của cây
lan Hồ điệp in vitro hoàn chỉnh
Môi trường

NAA(mg/l)

R0

0,0

R1

0,5

R2

1,0

R3

1,5

R4

2,0

16


Đánh giá khả năng ra rễ của chồi in vitro và chiều dài rễ sau 4 tuần
nuôi cấy.
2.3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
Cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh được đưa vào rèn luyện thích nghi
với điều kiện tự nhiên trên các giá thể, xơ dừa sấy khô, xơ dừa + than tỉ lệ 1:1,
than.
Đánh giá tỷ lệ sống sót (số cây sống/ số cây chết) của cây trên các giá
thể sau 4 tuần rèn luyện.
2.4. Phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm
Số liệu được thu thập và xử lí thống kê bằng chương trình Excel 2010
theo mô tả của Nguyễn Văn Mã và cộng sự, 2013 [3].

17