CHUYEN DE SHPT: Quy trình tổng quát sàng lọc thuốc hiệu năng cao

ĐH Y Dược TP.HCM
Khoa Dược


CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SINH HỌC PHÂN TƯ

Tên chuyên đề:

QUY TRÌNH TỔNG QUÁT
SÀNG LỌC THUỐC HIỆU NĂNG CAO


Học viên TH:

Lớp:
GVHD:

TP.HCM - 2016

1


.1 Dẫn nhập
Với tình hình bệnh tật ngày càng tăng và diễn biến phức tạp, nhu cầu thuốc sử
dụng vì thế cũng tăng theo. Nhiều bệnh mới xuất hiện mà đến nay vẫn chưa có thuốc
điều trị, cùng với tình hình kháng thuốc đã trở thành những vấn đề thách thức đối với
các nhà nghiên cứu dược phẩm và các chuyên gia y tế.
Việc nghiên cứu một thuốc mới từ ý tưởng ban đầu là một quá trình rất phức tạp,
trung bình cần 10 đến 15 năm và tốn khoảng 1 tỷ USD. Phương pháp sàng lọc để tìm
kiếm thuốc mới, phát triển từ phương pháp truyền thống hay còn gọi là phương pháp
sàng lọc hiệu năng thấp (low-throughput screening – LTS) với hiệu quả thấp, một hợp

chất tại một thời điểm, cho tới phương pháp sàng lọc hiệu năng cao (high-throughput
screening – HTS) liên quan đến hệ thống robot hoàn toàn tự động, cho phép thử
nghiệm một số lượng lớn các hợp chất cho các mục đích khác nhau trong một ngày.
Hiện nay, HTS có khả năng sàng lọc hơn 100.000 mẫu mỗi ngày. So với phương pháp
nghiên cứu thuốc truyền thống, HTS cho thấy nhiều ưu thế vượt trội như: đơn giản,
nhanh, chi phí thấp, hiệu quả cao. HTS giúp đẩy nhanh quá trình tìm kiếm các hợp
chất có tác dụng sinh học, trong đó bao gồm phương pháp tiếp cận thư viện của hàng
chục ngàn hợp chất, sử dụng các xét nghiệm sinh hóa được hổ trợ bởi hệ thống tự động
hóa, bao gồm các xét nghiệm thu nhỏ, sử dụng phát xạ huỳnh quang, cộng hưởng từ
hạt nhân hay phương pháp phân tích các dữ liệu lớn.
Sàng lọc hiệu năng cao đã được ứng dụng trong hai thập kỷ qua và đã trở thành
một phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện thuốc mới trong nghành công nghiệp dược
phẩm. Vì vậy, mục tiêu của chuyên đề là tìm hiểu: “Quy trình tổng quát sàng lọc
thuốc hiệu năng cao”.

2


.2 Tổng quan
2.1. Khái niệm HTS và ứng dụng trong công nghệ dược phẩm:
HTS cơ bản là một quá trình sàng lọc và thử nghiệm số lượng lớn các bộ điều
biến sinh học và cơ quan phản ứng lại kích thích với những mục tiêu xác định. Mục
đích của HTS là để đẩy nhanh phát hiện hoạt chất có tác dụng sinh học, trong đó bao
gồm một cách tiếp cận thư viện các hợp chất bao gồm hàng chục ngàn hợp chất đang
thử nghiệm với một mục tiêu cụ thể bằng cách sử dụng một xét nghiệm sinh học định
lượng thông qua việc sử dụng hệ thống tự động hóa, xét nghiệm thu nhỏ, sử dụng phát
xạ huỳnh quang, cộng hưởng từ hạt nhân, phân tích dữ liệu quy mô lớn.
Hiện nay, kỹ thuật sàng lọc hiệu năng cao (HTS) trong việc tìm kiếm thuốc mới
ngày càng được phát triển rộng rãi. HTS đã được ứng dụng để sàng lọc các hợp chất
hóa học, gen, protein và các chuổi peptid. Có rất nhiều mục tiêu đang được thử

nghiệm. Trong đó, các thụ thể màng tế bào, chủ yếu là protein-G chiếm 45%, enzyme
chiếm 28%, kích thích tố 11%, ion-kênh 5%, các thụ hạt nhân 2% và cuối cùng DNA
2%, khác 7%.
HTS đóng một vai trò thiết yếu trong quá trình phát triển thuốc. HTS cho phép
đánh giá nhanh chóng dược lực của số lượng lớn các hoạt chất. Kết nối các thư viện
hợp chất với sự đa dạng của hoá chất cùng với HTS cho thấy tiềm năng lớn phát hiện
hoạt chất, nhưng để thành công kỹ thuật này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: số lượng và
chất lượng của các mục tiêu đã xác nhận, số lượng và sự đa dạng của các hợp chất
trong các bộ sưu tập, sự kịp thời khi kiểm tra khả năng này và hiệu quả sử dụng các
xét nghiệm ... Xác định các phân tử tiềm năng tốt bằng cách sử HTS có thể hạn chế tối
đa các khoảng thời gian của phát hiện hoạt chất.
Hầu hết các công ty dược phẩm và công nghệ sinh học sử dụng sàng lọc hiệu
năng cao (HTS) là một chức năng trung tâm trong quá trình phát triển thuốc. Ngày
càng tăng các mục tiêu điều trị xác nhận được phát hiện thông qua những tiến bộ trong
nghiên cứu bộ gen của con người, và ngày càng nhiều các hợp chất hóa học được sản
xuất thông qua HTS. [1]
2.2. Ưu điểm của HTS

3


Giảm thiểu chi phí nghiên cứu, giảm chất thải khảo nghiệm bằng cách cho phép
việc sử dụng các xử lý mẫu song song và phương thức phát hiện.
Ngăn chặn sự suy giảm nguồn cung cấp hợp chất, làm giảm lượng thuốc thử sử
dụng.
Để bao quát và thu nhỏ hơn nữa khảo nghiệm có thể tiến hành dựa trên hệ thống
liên quan đến đĩa với mật độ cao hơn và khối lượng nhỏ hơn.
Dễ dàng tự động hóa, kỹ thuật có độ nhạy cao để thực hiện dòng chảy liên tục.
Áp dụng trên cơ sở công nghệ sinh học, nghiên cứu trên tế bào, không thực
nghiệm trên động vật, trên người, không bị ràng buột bởi vấn đề đạo đức trong nghiên

cứu.
2.3. Các thế hệ của HTS:
2.3.1. Phân loại theo Ricardo Macarrón and Robert P. Hertzberg [10]
Kiểu sàng lọc
Low-throughput

Số lượng

Ví dụ

mẫu thử/ ngày
500

Thử nghiệm trên mô hình động vật, các xét
nghiệm thông qua trung gian trao đổi chất của

screening

CYP, kết hợp với LC/MS/MS
500- 10.000

Khảo nghiệm bằng kỹ thuật chụp ảnh bằng

Medium throughput

kính hiển vi sự phát huỳnh quang của tế bào, xét

screening

nghiệm để xác định hoạt tính xúc tác của

enzyme oxy tiêu thụ

High-throughput

10.000-100.000

screening
Ultra-high

Phân tích ức chế phát huỳnh quang thuộc
về enzyme

>100.000

Thử nghiệm β-lactamase di động

throughput screening
2.3.2. Phân loại theo Oliver Kayser and Heribert Warzecha [8]
2.3.2.1. Thế hệ thứ nhất Throunghput: bắt đầu xuất hiện từ năm 1993 với đĩa
có 96 giếng. Đến năm 2000 sử dụng đĩa có 1536 giếng (bội số của 96). Số lượng mẫu
từ 50.000 -200.000. Thể tích mỗi giếng từ 100 – 200 µl giảm xuống còn 2,5 – 10 µl

4


Công cụ
sản xuất

Phát triển KT
khảo nghiệm

Sàng lọc
HTS II

Công cụ
sản xuất

Phát triển KT
khảo nghiệm

Sàng lọc
HTS I

Sàng lọc
ngược

Thẩm định
sàng lọc

Mục tiêu

Thư viện mẫu
> 1,500,000

Sàng lọc
ngược

Thẩm định
sàng lọc

Danh sách trọng tâm
10,000 – 50,000

Tìm ra chất
định hướng

Tối ưu hóa chất định
hướng

Quá trình thực hiện:
Khảo nghiệm

Điều chỉnh PP
khảo nghiệm

Sàng lọc HTS

Tối ưu hóa chất
định hướng

2.3.2.2. Thế hệ thứ hai Efficacy: kích thước thư viện mẫu từ 200,000 đến
1,500,000 mẫu, phát triển từ năm 2001 -2006, số lượng giếng trên mỗi đĩa lên tới 9600
giếng/đĩa, thể tích mẫu 0,2 µl. Nhưng phải đối mặt với một số vấn đề kỹ thuật chẳng
hạn như độ nhạy cảm với nồng độ Dimethylsulfoxide và những hạn chế trong pha chế
thể tích nhỏ và yêu cầu giám sát sự bốc hơi. Sơ đồ thực hiện:
Mục
tiêu

Công cụ
sản xuất

Phát triển PP
khảo nghiệm

Sàng lọc
HTS

Sàng lọc
ngược

Tìm ra chất
định hướng

Tối ưu hóa chất
định hướng

2.3.2.3. Thế hệ thứ ba Flexibility: xuất hiện từ năm 2007 đến nay, số lượng
mẫu có thể thực hiện được từ 1,500,000 mẫu trở lên

5


Hình 2.1. Các thế hệ HTS [7]

6


3. Nội dung
Quy trình tổng quát sàng lọc thuốc hiệu năng cao dựa trên công nghệ sinh học
phân tử gồm các bước cơ bản sau:

3.1. Xác định mục tiêu thử nghiệm [2]
Mục tiêu thử nghiệm là các thành phần cụ thể tồn tại sẵn có trên các tế bào bệnh
lý hoặc trên các cấu trúc phân tử mà chịu trách nhiệm đối với bệnh; Mục tiêu thử
nghiệm có thể là receptor, enzyme, axit nucleic, hormon, các kênh ion… Mục tiêu thử
nghiệm phụ thuộc vào bệnh mà nhà nghiên cứu đó quan tâm. Hiện nay, thụ thể bắt cặp
với protein-G (G protein-coupled receptor - GPCR) là một họ lớn đã được xác định và
mã hóa hơn 600 gen đã được xác định. Trong cơ thể con người, GPCR chịu trách
nhiệm cho khoảng 30 bệnh bao gồm đái tháo nhạt, nhược giáp, cường giáp, viêm võng
mạc sắc tố, một số rối loạn sinh sản và thậm chí cả ung thư. Khoảng 150 họ thụ thể bắt
cặp với protein-G (GPCRs) tìm thấy trong cơ thể con người có chức năng chưa rõ.
3.1.1. Đặc điểm của mục tiêu thử nghiệm: [11]
• Các mục tiêu thử nghiệm là các phân tử sinh học, thông thường là một loại
protein và protein đó có thể ở dạng đơn giản hoặc ở dạng phức hợp.
• Các phân tử sinh học có các vị trí đặc biệt để gắn với các phân tử khác (thường là
những phân tử nhỏ có cấu trúc đặc biệt). Những phân tử này có thể là nội sinh bên
trong cơ thể hoặc những chất bên ngoài cơ thể như phân tử hóa học (thuốc).

7


• Cấu trúc phân tử sinh học có thể thay đổi khi các phân tử sinh học liên kết với
những phân tử nhỏ và những thay đổi trong cấu trúc thường là thuận nghịch.
• Sau khi có sự thay đổi trong cấu trúc của các phân tử sinh học những phản ứng
sinh lý khác nhau có thể xảy ra và gây ra các điều chỉnh trạng thái của tế bào, mô, cơ
quan hoặc cơ thể.
• Các phản ứng sinh lý gây ra bởi những thay đổi trong cấu trúc phân tử sinh học
đóng một vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh.
• Các biểu hiện, hoạt động và cấu trúc của các phân tử sinh học có thể thay đổi
theo thời gian của quá trình bệnh lý.

• Các phân tử nhỏ liên kết với các phân tử sinh học là thuốc.
3.1.2. Các loại mục tiêu thử nghiệm:
Có 483 mục tiêu thử nghiệm đang được sử dụng, trong đó có các thụ thể (45%),
enzyme (28%), hormon (11%), chưa rõ (7%), kênh ion (5%) thụ thể ở nhân (2%) và
AND (2%) (Drews, 2000)

Hình 3.1. Các loại mục tiêu thử nghiệm
3.1.3. Mục đích của việc xác định mục tiêu thử nghiệm:
Tùy vào các xu hướng tìm kiếm thuốc phân tử nhỏ mà việc xác địch mục tiêu thử
nghiệm có mục đích khác nhau:
3.1.3.1. Sàng lọc dựa vào mục tiêu thử nghiệm (Target-base Screening)
Xác định mục tiêu thử nghiệm là nền tảng của sàng lọc dựa vào mục tiêu thử
nghiệm. Hầu hết các thuốc làm việc bằng cách gắn vào một mục tiêu cụ thể. Vì vậy,
nếu muốn tìm kiếm một loại thuốc mới thật sự, điều đầu tiên cần phải làm là tìm một
mục tiêu mới. Bước tiếp theo là tìm các phân tử nhỏ mà gắn với mục tiêu này, tốt hơn
là càng cụ thể càng tốt. Quy trình này dường như là có tính đổi mới và khoa học mà

8


các cộng đồng nghiên cứu dược phẩm đã mơ ước trong nhiều thập kỷ. Với những nỗ
lực to lớn, một số thậm chí đã thành công trong việc đưa ra các loại thuốc theo cách
này (ví dụ mercaptopurine và cimetidine). Tuy nhiên nhiều nhà khoa học trong lĩnh
vực này, đặc biệt các nhà sinh học phân tử và nhà quản lý trẻ, sẽ thấy một sự bùng nổ
của các loại thuốc mới chống lại bệnh tật trước đây không thể chữa được. Nhưng ngày
nay, hầu hết các bệnh vẫn còn đó, và điều duy nhất mà thực sự bùng nổ là chi phí để
tìm ra và phát triển các loại thuốc mới. Sàng lọc dựa vào mục tiêu thử nghiệm hiện nay
còn nhiều và nhiều hơn nữa câu hỏi. Mặc dù xu hướng này chắc chắn dẫn đến nhiều
thành công tuy nhiên nó đã thất bại nhiều hơn so với dự kiến phương thức này là tuyệt
vời ở in vitro nhưng lại tai hại trong lâm sàng do thiếu hiệu quả hoặc độc tính bất ngờ.

3.1.3.2. Sàng lọc kiểu hình (Phenotypic Screening) [6]
Sàng lọc kiểu hình là một loại sàng lọc được sử dụng trong nghiên cứu và tìm
kiếm thuốc để xác định các chất như các phân tử nhỏ, peptide, hoặc RNAi để can thiệp
làm thay đổi kiểu hình của một tế bào hoặc một cơ quan.
Hầu hết các sàng lọc kiểu hình ngày nay vẫn còn được thực hiện trong các tế bào.
Một lần nữa, chúng ta phải ý thức được rằng tế bào là gần giống với các mô và cơ
quan. Và các tế bào trong phòng thí nghiệm-thường được làm bằng các dòng tế bào
ung thư không chết, có thể thao tác để bắt chước một căn bệnh - có thể hoạt động hoàn
toàn khác biệt so với các tế bào bình thường. Tuy nhiên, những tế bào sàng lọc kiểu
hình có nhiều lợi thế hơn so với sàng lọc sinh hóa.
Một lợi thế lớn là trong một tế bào, mục tiêu ở trong điều kiện sinh học bình
thường của nó: nó hiện diện trong khoang thực sự của các tế bào, ở nồng độ thật và
trong con đường điều hòa và trao đổi một cách hoàn chỉnh.
Một lợi thế thứ hai là các tế bào chứa nhiều mục tiêu. Ngược lại, trong sáng lọc
sinh hóa chỉ kiểm tra một mục tiêu được biết đến vào một thời điểm và nó có thể mất
nhiều năm để thiết lập một thử nghiệm cho một protein thứ hai.
Một lợi thế thứ ba là sàng lọc kiểu hình thành công xác định các tiền chất, mà
không cần phải được chuyển đổi sang các hoạt chất bởi các tế bào chủ hoặc một tế bào
vi khuẩn. Tiền chất không thực hiện được bằng các thử nghiệm sinh hóa.
Trong trường hợp sử dụng sàng lọc kiểu hình để tìm các hoạt chất, việc xác định
xác định các mục tiêu rất hữu dụng. Đầu tiên, xây dựng một SAR dựa trên cách đo

9


bằng một xét nghiệm sinh hóa sẽ cho một kết quả tốt hơn bởi vì bạn loại trừ tất cả các
biến thể gây ra do sự xuyên qua tế bào, ngoài mục tiêu gắn kết, sự phân chia tế
bào....Thứ hai, khi các cấu trúc 3D của các mục tiêu có sẵn, mô hình phân tử có thể hỗ
trợ các SAR. Thứ ba, biết các mục tiêu cũng có thể giúp trong việc tìm ra các độc tính
và đường đi trong các mô hình của con người và động vật. Thứ tư, khó khăn hơn để có

được sự chấp thuận của các cơ quan trong và ngoài công ty về một hợp chất mà không
có một mục tiêu.
Trong trường hợp sử dụng sàng lọc kiểu hình như là một cách để tìm mục tiêu
mới, vai trò của việc xác định mục tiêu là hiển nhiên. Cách tiếp cận này để tìm kiếm
mục tiêu mới trở thành một lựa chọn hợp lý vì ba lý do. Trước tiên, đó là tăng khả
năng tăng để đọc ra nhiều kiểu hình phức tạp hơn. Thứ hai, phương pháp để xác định
một mục tiêu đang trở nên ngày càng hiệu quả. Và thứ ba, mục tiêu tìm thấy thông qua
sàng lọc kiểu hình có nhiều khả năng thành công hơn.

Hình 3.2. Hai phương pháp xác định mục tiêu thử nghiệm

10


3.1.4. Phương pháp xác định mục tiêu thử nghiệm
Có nhiều phương pháp để xác định các mục tiêu của thuốc và các lĩnh vực là dựa
trên sự phát triển nhanh chóng của những kỹ thuật như sinh học phân tử, kính hiển vi,
tự động hóa và tin học. Không có phương pháp hay hướng dẫn có thể được áp dụng
cho tất cả các mục tiêu.
3.1.5. Thẩm định mục tiêu thử nghiệm: [5]
Thẩm định mục tiêu mới là một quá trình cơ bản, hoàn toàn mới và là bước đầu
để tìm ra thuốc. Thẩm định mục tiêu của thuốc có thể giúp rất nhiều không chỉ để
nghiên cứu và phát triển thuốc mới mà còn cung cấp cái nhìn sâu sắc hơn về cơ chế
bệnh sinh của mục tiêu liên quan đến bệnh. Về cơ bản, quá trình thẩm định mục tiêu
có thể bao gồm sáu bước sau:
1. Phát hiện một phân tử sinh học quan tâm.
2. Đánh giá tiềm năng của phân tử sinh học như là một mục tiêu.
3. Thiết kế một xét nghiệm sinh học để đo lường hoạt động sinh học.
4. Xây dựng một sàng lọc hiệu năng cao.
5. Thực hiện sàng lọc để tìm hits.

6. Đánh giá các hits.
Các mục tiêu của thuốc phải được thẩm định bằng thực nghiệm theo các mô hình
hoạt động. Thẩm định là trực tiếp liên kết dữ liệu với các hiệu quả trên lâm sàng (ví
dụ: các thí nghiệm trong các tế bào/ mô người). Những nghiên cứu về chức năng có
thể áp dụng các quy trình can thiệp làm thay đổi cấu trúc của gen (gene knockdown
hay knockout). Ở In vitro các nghiên cứu về chuyển hóa trên tế bào có thể được sử
dụng để phát hiện hay điều chỉnh các đặc điểm của các mục tiêu và các con đường mà
mục tiêu đã tham gia. Cuối cùng, cần đánh giá mối liên quan của một mục tiêu cụ thể
với các bệnh trên mô hình động vật. Giả sử rằng chức năng di truyền giữa chuột và
con người là như nhau và tồn tại các mô hình bệnh thích hợp thì quy trình can thiệp
làm thay đổi cấu trúc của gen (knockout hay transgenic) động vật có thể được sử dụng
để thẩm định mục tiêu. Tuy nhiên, trên invivo việc thẩm định mục tiêu trên con người
không phải là không rủi ro. Trong khi đó, một số mô hình hứa hẹn là hiệu quả khi sử
dụng ở người, một số mô hình khác cho thấy sự khác biệt lớn. Hơn nữa, một số bệnh

11


bị hạn chế chỉ có trên các loài linh trưởng, trong khi hầu hết các nghiên cứu chuyển
hóa trên động vật được thực hiện ở các loài gặm nhấm.
Chuyển sang sự tìm kiếm thuốc thật sự, các interleukin (IL) -2-cảm ứng tyrosine
kinase (ITK) có thể là một khái niệm mới mẻ trong điều trị các bệnh viêm da. ITK tác
động một cách chọn lọc trong các mô bệnh. Nó hiện diện chủ yếu là trong các tế bào T
và được tăng lên trong các da thương tổn từ bệnh nhân với viêm da. RNA silencing đã
được áp dụng như là một xu hướng để thẩm định mục tiêu và được tiếp tục bởi các
nghiên cứu in vivo (tức là trong một quy trình can thiệp thay đổi cấu trúc gen
knockout của ITK trên chuột). Hơn nữa, một chất ức chế SMOL đã xác định chắc chắn
vai trò của kinase này trong các mô hình bệnh tật.
Đánh giá Druggability
Các phương pháp để đánh giá druggability protein bao gồm các phương pháp tìm

hiểu trình tự liên quan đến các protein cũng như các cấu trúc 3D của protein. Những
mục tiêu của thuốc đã biết cấu trúc 3D có thể được tìm thấy trong cơ sở dữ liệu mục
tiêu thuốc tiềm năng (http: //www.dddc.ac.cn/pdtd/). Biết cấu trúc 3D là một thuận lợi
để đánh giá mục tiêu của thuốc vì nó cho phép dự đoán điểm gắn liên kết tiềm năng
cho SMOL, việc dự đoán này được thực hiện bởi công cụ tìm kiếm druggability dựa
trên cấu trúc cung cấp bởi EMBL-EBI ( />Bên cạnh dự ðoán của druggability, ðánh giá một SMOL mục tiêu tiềm nãng gồm các
phân tích các mặt xúc tác và/hoặc các chức nãng và phân tích các vấn đề chọn lọc so
với các protein khác với các điểm gắn tương tự
3.2. Thành lập thư viện sàng lọc [9]:
3.2.1. Đĩa thử nghiệm
Các đĩa thử nghiệm (microplate) được biết đến với nhiều tên khác nhau như
microtiter plate (MTP) hoặc multiwell đều có nghĩa là các đĩa với nhiều giếng. Đĩa đầu
tiên được tìm ra vào năm 1951 như một thiết bị nhỏ được sắp xếp 8x12. Đĩa đầu tiên
được đúc gồm 96 giếng đã được thực hiện vào năm 1963. Các đĩa đã được sử dụng
phổ biến vào cuối những năm 1960s. Đến những năm 1990s, các đĩa có nhiều định
dạng cũng như hình dạng khác nhau. Năm 1996, Hiệp hội sàng lọc sinh học phân tử
(SBS) đã đề xuất tiêu chuẩn hóa kích thước đĩa với khoảng cách từ trung tâm đến
trung tâm của các giếng là 9 mm đối với bản mỏng 96 giếng, chân bên ngoài 127,76 x

12


85.47 mm và chiều cao tiêu chuẩn của giếng là 14,35 mm. Năm 2003, Tiêu chuẩn SBS
được ANSI chấp thuận. Các đĩa là nền tảng chính cho nghiên cứu phân tích sinh học,
xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng và HTS ngày nay
Các đĩa sử dụng ngày nay:
Bảng 3.1. Định dạng, kích thước và thể tích sử dụng của đĩa
Loại đĩa

Định

Khoảng cách

Bội số của Thể tích sử

dạng

trung tâm (mm)

96

dụng (µL)

96

8 x 12

9.0

1 x 96

100 – 300

384 thể tích bình thường

16 x 24

4.5

4 x 96

5 – 100

384 thể tích thấp

16 x 24

4.5

4 x 96

1 – 10

1536

32 x 48

2.25

16 x 96

1 – 10

3456

48 x 72`

1.5

36 x 96

0.2 – 3

Đĩa 384 giếng (thể tích bình thường) là loại đĩa được sử dụng phổ biến nhất hiện
nay (2005) để sàng lọc và dự kiến sẽ tiếp tục như vậy đến năm 2008. Tuy nhiên, đến
năm 2008 sử dụng đĩa 1536 giếng và 384 giếng thể tích thấp cũng được dự kiến sẽ
vượt qua bản mỏng 96 giếng. Và vào năm 2008, nhiều hơn sáu trong số 10 người dùng
sẽ sử dụng một sự kết hợp giữa đĩa 384 (thể tích bình thường) hay 384 giếng (thể tích
thấp) và các bản mỏng 1536 cho thử nghiệm của họ. Chỉ có 5% sẽ sử dụng đĩa 3456
giếng và khoảng 10% các định dạng khác (chủ yếu là hệ thống vi lỏng).
3.2.2. Cơ chế phân phối chất lỏng vào các đĩa
Hiện nay có bảy cơ chế phân phối được sử dụng trong ứng dụng sàng lọc tự
động:
3.2.2.1. Air-dispalement
Bơm pit tông và không khí là cơ chế phân phối sử dụng phổ biến nhất trên pipet.
Những hệ thống này dựa trên một pit tông hoặc cán piston vận hành bằng sự giữ lại
của một ống tiêm, hình trụ hoặc một đầu khóa rắn với nhiều lõi. Chuyển động của pit
tông ra khỏi ống tiêm làm cho chất lỏng được hút vào và đảo ngược hướng pít tông
làm chất lỏng bị tống ra (phân phối). Trong một hệ thống dịch chuyển khí (airdispalement) chất lỏng không bao giờ chạm vào pit tông, có một khoảng không khí
giữa chất lỏng và pit tông. Trong một hệ thống bơm pit tông tích cực có thể không có
khoảng cách không khí giữa pít tông và các chất lỏng được phân phối, toàn bộ khoảng
13


không khí hoặc phần lớn có thể được thay thế bằng một hệ thống chất lỏng không trộn
lẫn được với chất lỏng mà được phân phối. Cơ chế phân phối dịch chuyển khí được sử
dụng phần lớn trong các 96- và 384 kênh pipetters
3.2.2.2. Tool pin
Tool pin dựa trên sự di chuyển giọt chất lỏng mà bám chặt vào đầu của đinh
ghim (pin). Diện tích bề mặt của đầu xác định thể tích của giọt, trong đó khoảng tương

đương với thể tích di chuyển. Công cụ Pin đại diện cho một phương pháp phân phối
tiếp xúc, đòi hỏi phải có sức căng bề mặt để loại bỏ các giọt từ mũi của đầu ghim. Bên
cạnh các ghim bằng chất rắn, còn có các loại khác như rãnh, khe và ghim với các lõi
mao quản rổng để giữ chất lỏng mà được phân phối. Sự phân phối khác nhau giữa các
pin từ lâu đã là một vấn đề và nó thường được công nhận là chính xác [Hệ số biến
thiên (CV)] của pin pha chế là ở phía cao. Sự thay đổi khác nhau của pin như chất phủ
bề mặt đầu và trục pin). Công cụ pin không phù hợp với khối lượng lớn hơn 500 nL và
khối lượng phân phối tối thiểu là khoảng 5 nL.
3.2.2.3. Nhu động (Peristaltis pump)
Bơm nhu động hoạt động theo cơ chế liên quan đến một ống được nén và kẹp
giữa một hình trụ quay với mái chèo và một bề mặt cố định. Khi xi lanh quay, các mái
chèo di chuyển dọc theo ống nén và làm cho các chất lỏng chạy dọc theo ống.
3.2.2.4. Solenoid-syringe
Trong một phân phối solenoid-syringe, ống tiêm được sử dụng để hút mẫu. Việc
hút chất lỏng xảy ra thông qua các van mở. Một vòi phun hoặc đầu dùng một lần được
sử dụng cho các van để hướng dòng và điều chỉnh kích thước giọt. Áp lực mở van tạo
ra các giọt chất lỏng có kích thước nanolit. Kiểm soát chính xác về thời gian mở van
cho phép điều chỉnh thể tích phân phối. Thông thường một hệ thống bao gồm 1-8
solenoid-syringe để dẫn lưu chất lỏng. Mỗi solenoid-syringe có khả năng phân phối
một cách độc lập một chất lỏng và / hoặc một thể tích khác nhau. Solenoid- syringe
chủ yếu được sử dụng để phân phổi khoảng 5 nL-50 L, nhưng thể tích phân phối chính
xác tùy thuộc vào dung tích bơm tiêm và kích thước của lỗ vòi phun.
3.2.2.5. Capillary Sipper
Cơ chế của phương pháp này đó là nhúng một mảng gồm 96 hoặc 384 mao quản
thủy tinh polyamide vào trong một bản mỏng nguồn, mao quản được làm đầy bằng sự

14


mao dẫn và được phân phối (phóng chất lỏng) vào bản mỏng đích bằng cách sử dụng

áp lực suất đến từ phía sau của mao quản. Thể tích phân phối được xác định bằng thể
tích của các mao quản và kỹ thuật sử dụng. Ưu điểm của kỹ thuật này là sự đơn giản;
không có bộ phận chuyển động như trong bơm tiêm và không pha loãng hoặc mất mẫu
trong quá trình truyền.
3.2.2.6. Piezoelectric
Piezoelectric thường bao gồm một ống mao quản thủy tinh hay thạch anh được
nối với một máy áp điện. Một đầu của các mao mạch được mở và kéo dài vào trong
một đầu nhỏ và đầu kia được gắn vào hệ thống chất lỏng (bơm tiêm hay hồ chứa). Khi
cơ chế áp điện được kích hoạt thông qua một xung điện và cảm ứng sóng nén tạo ra
giọt có kích thước nanolit từ đầu mao quản. Sử dụng một điện áp cụ thể cho phép phân
phối và điều chỉnh một thể tích chính xác đến nanolit.
3.2.2.7. Acoustic Transducer
Các thiết bị này phân phối theo cơ chế phân phối không tiếp xúc (tức là sự phóng
thích của giọt chất lỏng từ một nguồn mà các yếu tố phân phối không xâm nhập vào
nguồn hoặc tiếp xúc với các chất nền). Kỹ thuật này tạo ra giọt chất lỏng trong phạm
vi thể tích từ 0,1 pL đến hơn 1 mL. Những ưu điểm của cơ chế này là không ô nhiễm
chéo và không có chất thải.

15


Hình 3.3. Kỹ thuật phân phối chất lỏng [3]
3.2.3. Kỷ thuật phân phối và những ứng dụng xử lý chất lỏng trong HTS
3.2.3.1. Sự thêm vào hàng loạt thuốc thử và tế bào
Bổ sung số lượng lớn thuốc thử được yêu cầu khi một thử nghiệm sinh hóa hoặc
tế bào có 2-5 thành phần giống với nhau. Các khoảng thể tích thử nghiệm và thể tích
thêm vào cho các định dạng đĩa được đưa ra trong bảng 3.2. Thông thường tất cả các
giếng nhận các thành phần tương tự; Tuy nhiên, phân phối trong những hàng hoặc cột
được chọn có thể được điều chỉnh khác nhau.

16


Bảng 3.2. Tổng thể tích thử nghiệm và thể tích thêm vào của các loại đĩa
Loại đĩa

Tổng thể tích thử nghiệm

Thể tích thêm vào

(µL)

(µL)

96

25 – 300

5 – 100

384 thể tích bình thường

10 – 100

5 – 50

384 thể tích thấp

2 – 20

0.5 – 5

1536

2 – 10
0.5 – 3
Hiện nay có 2 loại phân phối thuốc thử số lượng lớn:
(1) 96- và 384 đầu dựa trên cơ chế phân phối air-displacement - có khả năng hút

và phân phối vào tất cả các giếng của đĩa cùng một lúc. Nếu nguồn của thuốc thử cần
hút là một đĩa (không phải là một hồ chứa chung), nó có thể phân phối theo một mô
hình thuốc thử cụ thể của các bản mỏng.
(2) 8, 16 và 24 đầu dựa trên cơ chế phân phối nhu động, syringesolenoid hoặc
solenoid-pressure bottle. Chất lỏng thường được cung cấp từ một hồ chứa hoặc chai và
đầu phân phối được cố định bằng các vòi phun có đường kính phù hợp với thể tích
phân phối mong muốn. Chúng ta có thể thay đổi đầu / vòi phun có dung tích khác (ví
dụ thấp). Các thiết bị thường phân phối vào một cột hoặc một hàng cùng một thời
điểm và di chuyển ngang hoặc xuống trên bản mỏng. Nhiều đầu có thể được nhóm lại
và phân phối song song với nhau, với các đầu/chất lỏng phân phối riêng biệt sẽ phân
phối cho mỗi thuốc thử hoặc các thành phần thử nghiệm riêng biệt.
3.2.3.2. Compound Reformatting và phân phối Nanolite
Compound Reformatting là việc chuyển giao một hợp chất (mẫu) từ một kho thư
viện bản mỏng. Những mẫu dự trữ, được hòa tan trong 100% DMSO, được bảo quản
trong những bản mỏng 96 hoặc 384 giếng mà thường được gọi là những "bản mỏng
mẹ". Những bản mỏng thử nghiệm hoặc bản mỏng pha loãng thường được gọi là "bản
mỏng con". Sự phân phối thể tích thấp (<50 nL) là điều cần thiết cho Compound
Reformatting vì những lý do sau đây: (1) ngành công nghiệp hiện đang tập trung vào
việc sử dụng ít hóa chất trên điểm dữ liệu thử nghiệm; (2) hầu hết các phòng thí
nghiệm muốn chuyển mẫu từ bảo quản DMSO nguyên chất sang thử nghiệm thể tích
thấp (<5 L); (3) nồng độ DMSO cần được giữ ở mức thấp (thường <1% là mong muốn

cho các thử nghiệm liên quan đến tế bào); (4) trong hầu hết các trường hợp, nồng độ
mẫu càng cao càng tốt; (5) mẫu không chắc chắn tồn tại mếu được pha loãng trong
17


dung dịch đệm là nước; và (6) chuẩn bị các bản mỏng thử nghiệm bằng cách pha
loãng trực tiếp thì tốt hơn vì tiết kiệm được hóa chất, các bước pha loãng, tiền.
3.2.3.3. Cherry Picking
Cherry Picking là khả năng hút mẫu từ một giếng của bản mỏng được lựa chọn
và phân phối đến một giếng được xác định trước trong bản mỏng khác. Cherry picking
được sử dụng để chọn lựa những chất tiềm năng từ một bản mỏng mẹ dự trữ và chuyển
chúng vào một bản mỏng để kiểm tra lại trong quá trình xác nhận lại những chất tiềm
năng.
3.2.4. Những kỹ thuật phát hiện
Những phương thức phát hiện chính được sử dụng trong HTS: Huỳnh quang
(52% của tất cả các thử nghiệm sàng lọc), Sự phát quang - Luminescence (19%), đo
bức xạ (13%), hấp thụ - trắc quang hoặc so màu (8%), các phương thức phát hiện khác
(8%)
3.2.5. Những kỹ thuật sàng lọc tự động (Chen, 2010)
3.2.5.1. Bảo quản đĩa hợp chất và đĩa thử nghiệm trong tủ ấm:
Những hợp chất sàng lọc sơ cấp thường được hòa tan trong DMSO và lưu trữ
trong những đĩa 96-, 384-, và 1536 giếng. Các đĩa cần được giữ trong tủ đông -70 oC để
lưu trữ lâu dài và có thể kéo dài đến 10 năm. Các đĩa hợp chất, được bao phủ với nắp
hàn kín khí hoặc hàn kín nóng, được lưu giữ trong một đơn vị đĩa lưu trữ ở nhiệt độ
phòng sẵn sàng để hệ thống robot sàng lọc sử dụng. Thông thường, các hợp chất trong
dung dịch DMSO có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 3-6 tháng mà không
ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của các hợp chất. Những chu kỳ đông-tan rã thường
xuyên và lưu trữ ở 4oC đến -40oC nên tránh cho các hợp chất trong dung dịch DMSO
vì những điều kiện này đẩy nhanh tiến độ phân hủy các hợp chất. Những hợp chất có
trong dung dịch nước nên được sử dụng khi vừa mới pha loãng và không nên được lưu

trữ trong bất kỳ điều kiện nào, vì nhiều hợp chất sẽ bị phân hủy.
3.2.5.2. Các thiết bị đọc các đĩa thử nghiệm
Sau khi những đĩa thử nghiệm được ủ với các hợp chất và thuốc thử phát hiện,
chúng được chuyển đến một đầu đọc đĩa để đo lường kết quả. Việc lựa chọn các chế
độ phát hiện tại một đầu đọc đĩa được xác định bởi bản chất của thử nghiệm sàng lọc.

18


Hiện nay, hơn 95% các xét nghiệm sàng lọc sử dụng hệ thống phát hiện cũng dựa trên
đo tín hiệu từ toàn bộ giếng trong một thử đĩa nghiệm.
Cường độ huỳnh quang, huỳnh quang phân cực, huỳnh quang phân giải thời
gian, hấp thụ, và độ sáng là những phương pháp phổ biến để phát hiện trong các thử
nghiệm sàng lọc. Thiết bị đọc nhiều đĩa cùng một lúc là một lựa chọn phổ biến cho
sàng lọc thử nghiệm mà đòi hỏi phải thường xuyên thay đổi các chế độ phát hiện. Dựa
trên trên các thiết bị phát hiện tín hiệu, đầu đọc đĩa cũng có thể chia thành hai loại: dựa
trên đèn nhân quang điện (PMT-Photomultiplier tube) và dựa trên linh điện tích điện
kép (CCD-charge-coupled device)
Thiết bị đọc dựa trên PMT gồm các tia đi qua qua một bộ lọc ánh sáng kích thích
và được chiếu đến giếng mẫu thông qua một gương lưỡng sắc. Các tia phát xạ đi qua
gương lưỡng sắc và bộ lọc sau đó được đọc bởi máy dò. Trình tự này lặp đi lặp lại cho
mỗi giếng mẫu. Các thiết bị đọc đĩa dựa trên PMT có chi phí tương đối thấp và cung
cấp độ nhạy phát hiện cao hơn.
Các thiết bị CCD (cảm biến chuyển đổi hình ảnh quang học sang tín hiệu điện
trong các máy thu nhận hình ảnh) được coi là công cụ "cao cấp" cho phép tốc độ phát
hiện nhanh và tính biến thiên của các giếng thấp, vì các thiết bị này ghi lại hình ảnh
của toàn bộ đĩa. Dụng cụ này là một lựa chọn tốt cho những thử nghiệm thu nhỏ (1536
giếng)

19

Hình 3.4. Cơ chế của hệ thống đọc đĩa thử nghiệm PMT và CCD
3.2.5.3. Những nền tảng sàng lọc hợp chất: Máy trạm và hệ thống robot tự
động hoàn toàn
Dựa trên số lượng hợp chất sàng lọc mỗi ngày, một phòng thí nghiệm sàng lọc có
thể chọn một máy trạm hoặc hệ thống sàng lọc tự động hoàn toàn (Hình 11.3)
(Hamilton, 2002). Một sàng lọc dựa trên nền tảng máy trạm có thể được thiết lập một
cách nhanh chóng và chi phí thấp. Các sàng lọc hiệu năng với một nền tảng máy trạm
là tương đối nhỏ, thường là 20 đến 100 đĩa mỗi ngày trong 8 giờ. Một hệ thống robot
sàng lọc tự động hoàn toàn đòi hỏi 6-12 tháng để thiết lập đầy đủ và đầu tư tối thiểu
của hàng triệu đô la. Và chúng hoạt động liên tục (24 giờ mỗi ngày, 7 ngày mỗi tuần)
và đạt được lưu lượng của 100 đến 600 đĩa trong 24 giờ.

20


Hình 3.5. Các cấp độ của hệ thống sàng lọc tự động
3.3. Thu thập dữ liệu và phân tích để tìm các Lead
Mục tiêu của HTS là xác định chất hóa học dễ làm điểm khởi đầu cho chương
trình phát triển thuốc. Hình 3.6 là một minh họa đơn giản của quá trình khám phá Lead
trong điều kiện HTS. Nó bắt đầu với sàng lọc một tập hợp hay thư viện các hợp chất
để tìm các Hit. Sau đó loại bỏ các hit không mong muốn bằng các thử nghiệm hoặc
phát hiện những thành phần lạ, những cơ chế không mong muốn, thiếu đặc hiệu,...
Tiếp theo là thực hiện các thử nghiệm thứ cấp bằng các thử nghiệm lặp lại hoặc đáp
ứng nồng độ.
Các thiết kế của một quá trình sàng lọc theo thứ tự sau xác định các Hit, thử
nghiệm sơ cấp, thử nghiệm thứ cấp. Các quá trình này được thực hiện kết hợp với
phân tích các dữ liệu trung gian khác nhau. Phương pháp sàng lọc sơ cấp phổ biến hiện
nay là sàng lọc sơ cấp một nồng độ. Tuy nhiên một phương pháp đổi mới gần đây của

sàng lọc thông lượng cao định lượng (qHTS), trong đó mỗi hợp chất được sàng lọc tại
nhiều nồng độ. Một lợi thế của phương pháp này là hàng loạt cấu trúc hoạt động có thể
được xác định trực tiếp mà không cần phải phản ứng và xác định nồng độ. Hình 3.6
cũng minh họa quá trình nhóm cấu trúc các hợp chất hit và thực hiện phân tích mối
liên hệ cấu trúc-hoạt động (SAR) để tìm ra các Lead thích hợp nhất.

21


Nhóm cấu trúc

Hàng loạt Hit

Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tìm ra Lead bằng HTS

22


4. Kết luận
Sàng lọc thuốc hiệu năng cao là một trong những bước quan trọng để tìm ra
thuốc mới hiện nay. Quá trình sàng lọc thuốc hiệu năng cao trải qua nhiều giai đoạn và
ứng dụng công nghệ của nhiều ngành khoa học khác như sinh học, hóa học, tin học…
Quá trình sàng lọc thuốc trải qua nhiều giai đoạn bao gồm, xác định mục tiêu thử
nghiệm, thẩm định và đánh giá mục tiêu thử nghiệm, thực hiện HTS, thu thập và phân
tích dữ liệt, tối ưu hóa các bước. Mỗi giai đoạn lại có nhiều phương pháp và ứng dụng
để lựa chọn. Vì vậy để thực hiện tốt quá trình sàng lọc thuốc đòi hỏi người nghiên cứu
phải tìm hiểu và lựa chọn phương pháp thích hợp với mục tiêu nghiên cứu.
HTS có nhiều ưu điểm như: Tự động, quy trình đáng tin cậy, cơ sử dữ liệu đầy
đủ toàn diện, kiểm tra nhiều mẫu trong khoảng thời gian ngắn, giảm thiểu chi phi cho
mỗi mẫu. Tuy nhiên phương pháp này cũng tồn tại một số nhược điểm như chi phí đầu

tư cao, có thể xuất hiện dương tính giả.

23


Tài liệu tham khảo
[1] Ashok A. Hajare, S. S. (2014). Review On: High-Throughput Screening Is
An Approach To Drug Discovery. American Journal of PharmTech Research, 121 129.
[2] Athar Mohd, D. A. (2012). Current trends in drug discovery: Target
identification to clinical development of the drug. International research journal of
pharmacy, 23-27.
[3] Chen, T. (2010). A practice guide to assay development and high throughput screening in Drug Development. CRC Press.
[4] Drews, J. (2000). Drug Discovery: A Historical Perspective. Science.
[5] Isabella Gashaw, P. E. (2012). What makes a good drug target? Drug
Discovery Today, S24-S30.
[6] J, K. (2012). Phenotypic screening, take two. Science-Business exchange.
[7] Lorenz M Mayr, D. B. (2009). Novel trends in high-throughput screening.
Current Opinion in Pharmacology, 580 - 588.
[8] Oliver Kayser, H. W. (2012). Pharmaceutical Biotechnology: Drug
Discovery and Clinical Applications. Wiley-Blackwell.
[9] R.Mannhold, H. G. (2006). High Throughput-Screening in Drug Discovery.
Wiley-VCH.
[10] Szymański P, M. M.-O. (2012). Adaptation of high-throughput screening
in drug discovery-toxicological screening tests. International Journal of Molecular
Sciences, 427 - 452.
[11] Xiu-Ping Chen, G.-H. D. (2007). Target validation: A door to drug
discovery. Drug Discov Ther , 23-29.

24