PCRqPCR slide KỸ THUẬT PCR

PCR và real-time PCR
các vấn ñề cơ bản
Phạm Hùng Vân


Nguyên tắc PCR
DNA ñích
4
1 Biến tính (94oC )

1

2

2 Bắt cặp (55-65o C)

3
5’

3’
3’

5’

3 Kéo dài (72o C)

n

2n

Tại sao cần phải có primers?
5’

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’


Mồi
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl2
DNA ñích (Template)

PCR
MIX


30X-40X
94oC/15s-1min

55-65oC/15s-1min
72oC/30s-3min


30X-40X
94oC/15s-1min
55-65oC/15s-1min
72oC/30s-3min

Phát hiện trình tự ñặc hiệu
bằng kỹ thuật lai


Các chìa
khoá kỹ thuật
giúp hoàn
thiện PCR


(1) Phát hiện ñược polymerase chịu nhiệt

72oC

từ vi khuẩn Thermus aquaticus
(Taq polymerase). Hiện nay men
polymerase chịu nhiệt là trích từ vi
khuẩn E. coli tái tổ hợp


(2) Sự phát triển và hoàn thiện các

loại máy luân nhiệt
t T

Máy luân nhiệt dùng bloc

Peltier effect
HOT

COLD

t T
MJ research

Reverse Peltier



Máy luân nhiệt dùng buồng khí (Idaho)


(3) Kỹ thuật chống ngoại nhiễm sản
phẩm khuếch ñại (PCR carry-over)


Các loại PCR
q Monoplex PCR

q Nested PCR

q Multiplex PCR

q Nonstop-nested
PCR

q Touch down PCR
q Touch up PCR

q RT-PCR 2 step
q RT-PCR 1 step


Monoplex PCR

PCR

40X

94oC for 30”
55oC for 30”
72oC for 01’


Multiplex PCR

PCR

40X

94oC for 30”
55oC for 30”

72oC for 01’


Touch-down PCR

05X
PCR

05X
40X

94oC for 30”
65oC for 30”
94oC for 30”
60oC for 30”
94oC for 30”
55oC for 30”
72oC for 01’


05X
05X
40X

94oC for 30”
65oC for 30”
94oC for 30”
60oC for 30”
94oC for 30”
55oC for 30”

72oC for 01’


Nested PCR

PCR 40X

94oC for 30”
55oC for 30”
72oC for 01’

PCR 40X

94oC for 30”
55oC for 30”
72oC for 01’


Non-stop nested PCR

PCR 10X

94oC for 30”
65oC for 30”
72oC for 01’

PCR 40X

94oC for 30”
55oC for 30”

72oC for 01’


RT- PCR (two-step)
RNA

RNA

RT
(reverse
transcription)
RT with specific primers

PCR

RT
(reverse
transcription)
RT with random primers

PCR


RT- PCR (one-step)
RNA

RNA

RT
(reverse

transcription)

PCR

RT
(reverse
transcription)

PCR


Real-time PCR
Chạy PCR và ñồng thời phát hiện kết quả
Ct curve

Melt curve

Standard
curve


Camera

Laser or
UV

Thiết bị: Real-time PCR phát hiện ñược
sản phẩm PCR trong tube

Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl2

Fluorescent agent
Target DNA (Template)

Real-time
PCR MIX

Hóa chất:

Real-time PCR mix phát quang
ñược khi có sản phẩm PCR