Đông lạnh phôi

Đông lạnh phôi
I. Tổng quan.
1. Khái niệm.
Từ khi đứa trẻ đầu tiên được thụ tinh trong ống nghiệm ra đời (1978) cho đến nay, các kỹ
thuật hỗ trợ sinh sản ngày càng được áp dụng rộng rãi, mang lại niềm hy vọng cho các cặp vợ
chồng vô sinh. Sự áp dụng các loại thuốc kích thích buồng trứng nhằm tăng số lượng phôi hình
thành đã giúp cho tỷ lệ thành công của một quá trình điều trị gia tăng đáng kể. Người ta
thường chọn những phôi có chất lượng tốt nhất trong số các phôi có được để chuyển vào
buồng tử cung (chuyển phôi tươi). Tuy nhiên trong số phôi còn lại vẫn còn một số phôi có chất
lượng tốt, có khả năng làm tổ cao. Những phôi này có thể được trữ lạnh để sử dụng trong các
lần chuyển phôi tiếp theo. Trường hợp có thai đầu tiên từ phôi người trữ lạnh được báo cáo tại
Monash, Úc bởi Trounson và Mohr vào năm 1983. Từ đó đến nay, trữ lạnh phôi đã trở thành
một trong những kỹ thuật không thể thiếu ở bất kỳ một trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm
nào trên thế giới. Công nghệ đông lạnh phôi này ra đời có ý nghĩa trong việc nghiên cứu của
các nhà khoa học, nó đã mở ra một hướng mới trong công nghệ hỗ trợ sinh sản, đặt biệt trong
thụ tinh trong ống nghiệm.
Vậy thế nào là đông lạnh phôi?
Đông lạnh phôi là trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cục thấp (-196
o
C) trong nitơ lỏng sẽ làm ngưng
hoàn toàn các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển … giúp lưu giữ
chúng trong thời gian rất dài, mà sau khi rã đông những phôi này vẫn phát triển bình thường.
2. Các phương pháp.
- Đông lạnh phôi bằng phương pháp làm lạnh chậm.
- Đông lạnh phôi bằng phương pháp làm lạnh nhanh (phương pháp thủy tinh hóa).
II. Nguyên tắc chung.
Để trữ tế bào sống trong một thời gian dài thì tất cả hoạt động chức năng bên trong tế
bào phải ngừng lại. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196
o
C) hầu hết mọi phản ứng hóa học đều
không xảy ra được. Các phân tử nước tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời

gian như ngừng trôi đối với tế bào được trữ. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng đến tế bào trữ
lạnh là bức xạ từ môi trường. Tuy nhiên trong thực tế yếu tố này không quan trọng và một
nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi được chiếu một lượng tia xạ tương
đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi rã đông, và
chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào. Giai đoạn chính ảnh hưởng đến thành công của
trữ lạnh chính là giai đoạn làm lạnh và rã đông.
Các bước cần tiến hành trong việc đông lạnh phôi:
- Chọn phôi: phôi được chọn để trữ lạnh phải có chất lượng cao để chúng sống sót và
phát triển thai tốt sau khi giải đông. Theo Kennedy và cộng sự vào năm 1983, chất lượng phôi
được xếp thành 5 mức độ khác nhau: phôi loại một tốt nhất và phôi loại 5 suy thoái.
- Môi trường đệm: cũng giống như trong nuôi cấy tế bào động vật, trong đông lạnh phôi
cũng cần có môi trường đệm. Đối với phôi của những loài động vật khác nhau thì môi trường
đệm cũng khác nhau. Ví dụ: PBS chứa 20% huyết thanh bê là môi trường đệm thường dùng
cho việc trữ lạnh phôi bò. Ở các loài động vật khác thì môi trường đệm thường dùng là HEPES
với 10-15% huyết thanh bê.
Ở người, môi trường đệm là HEPES 20mM thay thế cho hệ đệm bicarbonate và có thể
thêm 0,5-1% HAS hay 10-15% huyết thanh của chính người nhận.
- Chất bảo quản lạnh: Glycerol, DMSO, ethylene glycon, polyvinyl pyrolydine (PVP) và
sucrose thường được sử dụng bổ sung như các chất bảo vệ chống lại sự đông lạnh phôi. PVP
và sucrose sẽ khử nước tự do bên trong tế bào nhưng chúng không xâm nhập vào tế bào. Trong
khi đó, Glycerol và DMSO, ethylene glycon khử nước tự do trong nội bào và tế bào giúp bảo
vệ cytoplasm đi vào trong
Ở người, chất bảo quản phôi thường được sử dụng là 1,2-propanediol (PROH) và dimethyl
sulfoxide DMSO.
Khả năng sống sót của phôi liên quan đến nồng độ các chất bảo quản đông lạnh được thêm
vào, phương pháp thêm chúng, nhiệt độ mà tại đó được thêm vào và cuối cùng là thời gian cân
bằng.
- Dụng cụ chứa phôi trong đông lạnh: có thể là các ống nhựa nhỏ, ống thuốc tiêm hay
các cọng rạ dùng cho đông lạnh tinh trùng (0.25ml hay 0.5ml).
- Thiết bị làm lạnh và đông: Trong phương pháp làm lạnh và đông, có thể sử dụng

ancohol đặt vào vật chứa như là một môi trường làm lạnh, sau đó đưa vào đá khô hay nitơ
lỏng. Trong các thiết bị chuyên dùng chất làm lạnh chủ yếu là nitơ lỏng, nhưng nguồn điện
cũng thường được sử dụng để hạ nhiệt. Một số thiết bị hiện đại có thể được chương trình hóa
tốc độ giảm nhiệt nên việc đông lạnh trở nên dễ dàng và hiệu quả cao.
- Tốc độ làm lạnh: Dựa vào những nguyên tắc trình bày trong phần trên, những phác đồ
trữ phôi được đưa ra và hoàn chỉnh dần. Hai phác đồ được sử dụng rộng rãi hiện nay áp dụng
cho phôi giai đoạn sớm (trước phôi nang) và cho giai đoạn muộn (phôi nang).
1. KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH HẠ NHIỆT ĐỘ CHẬM( SLOW FREEZING)
Dựa vào nguyên tắc của đông lạnh phôi chúng ta có thể trữ lạnh phôi vào các giai đoạn khác
nhau:
1.1 Trữ phôi giai đoạn sớm
 Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay cho giai đoạn này là 1,2 propanediol (PROH).
Mặc dù dimethyl sulfoxide (DMSO) là loại chất bảo quản lạnh được sử dụng thành công
đầu tiên ở người nhưng phác đồ dùng DMSO thường đòi hỏi nhiều thời gian để làm lạnh
cũng như rã đông nên ít được dùng hơn. Với PROH, kết quả đạt được tốt nhất khi dùng
kèm với sucrose để làm chất bảo quản bên ngoài tế bào.
 Môi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có môi trường cơ bản là môi trường đệm
phosphate (PBS) hoặc môi trường cấy phôi có bổ sung 20% huyết thanh. Trước khi làm
lạnh, phôi được cho tiếp xúc với môi trường có chất bảo quản để rút bớt nước ra khỏi tế
bào. Nồng độ PROH và sucrose trong từng môi trường là:
• Làm lạnh 1: 1,5M PROH (15 phút)
• Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucrose (5 phút)
 Sau đó phôi được cho vào các ống trữ thể tích khoảng 0,25ml và trữ theo chương trình:
• Từ nhiệt độ phòng xuống -7
o
C: giảm 1-2
o
C/phút
• Tạo mầm tinh thể: Dùng một vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước khi chạm vào
thành ống trữ phôi

• Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30
o
C: giảm 0,3
o
C/phút
• Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-50
o
C/phút, hoặc có thể cho trực tiếp vào nitơ
lỏng
 Ðến lúc này phôi được giữ liên tục trong nitơ lỏng. Chỉ đến lúc sử dụng phôi mới được rã
đông. Với chất bảo quản lạnh là PROH, ống chứa phôi có thể được làm rã đông bằng cách
giữ trong không khí trong 30 giây, sau đó nhúng vào nước ấm 37
o
C trong 60 giây. Ngược
với trước khi làm lạnh, sau khi rã đông, phôi lại được chuyển lần lượt qua các môi trường
khác nhau để rửa sạch chất bảo quản lạnh vốn có thể gây độc cho phôi. PROH có nồng độ
giảm dần để tránh sự thoát nước quá nhanh ra khỏi phôi. Thời gian phôi được giữ trong
mỗi môi trường rã đông là 5 phút:
• Rã đông 1: 1M PROH - 0,2M sucrose
• Rã đông 2: 0,5M PROH - 0,2M sucrose
• Rã đông 3: 0,25M PROH - 0,2M sucrose
• Rã đông 4: 0M PROH - 0,2M sucrose
 Sau môi trường rã đông 4, phôi được cho trở lại vào môi trường cấy. Chất lượng phôi sau
khi rã đông được kiểm tra sau 1 giờ. Ở một số trung tâm, phôi sau khi rã đông được nuôi
cấy 1 ngày để xem khả năng phát triển của phôi trước khi chuyển trở lại vào buồng tử
cung.
1.2 Trữ phôi giai đoạn muộn
 Các bước trữ phôi cũng tương tự như trữ phôi giai đoạn sớm. Tuy nhiên chất bảo quản
lạnh là Glycerol. Nồng độ glycerol dùng trước khi làm lạnh là:
• Làm lạnh 1: Glycerol 5% (10 phút)

• Làm lạnh 2: Glycerol 9% trong môi trường chứa sucrose (10 phút)
 Môi trường sau khi rã đông là:
• Sucrose 0,5M (10 phút)
• Sucrose 0,2% (10 phút)
1.3 Đánh giá hiệu quả trữ phôi
Hiệu quả của việc trữ phôi được đánh giá trước tiên qua khả năng sống của phôi sau khi rã
đông. Cấp độ thứ hai là khả năng phát triển của phôi trong môi trường nuôi cấy và cấp độ thứ
ba là khả năng phát triển của phôi sau khi được chuyển vào tử cung người mẹ. Ở cấp độ 1,
phôi được đánh giá về hình dạng 1 giờ sau khi rã đông. Chỉ số sống (survival index) tính bằng
tỷ lệ tế bào còn sống trên tổng số tế bào. Cấp độ 2 đánh giá phôi sau 24 giờ, biểu hiện bằng tỷ
lệ sống (survival rate) tính bằng tỷ lệ phôi sống trên tổng số phôi được rã đông. Cấp độ 3, cũng
là cấp độ quan trọng nhất, là tỷ lệ phôi làm tổ sau khi chuyển.
So với trữ phôi giai đoạn sớm, trữ phôi giai đoạn muộn có tỷ lệ sống sau trữ lớn hơn do thể
tích tế bào trong phôi nhỏ hơn. Tuy nhiên khó khăn cơ bản là phải có được phôi giai đoạn
muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi đến được giai đoạn phôi nang (blastocyst). Để đạt
được điều này, một mặt bệnh nhân phải có nhiều phôi, mặt khác quy trình nuôi cấy phôi phải
thật tốt. Hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu đối chứng đủ mạnh để so sánh hiệu quả của trữ phôi
giai đoạn sớm và giai đoạn muộn. Thực tế cho thấy ở những quốc gia không cho phép trữ phôi
giai đoạn muộn như Đức, việc trữ phôi ngay cả ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus) vẫn có giá
trị lâm sàng.
1.4 Ưu, khuyết điểm của phương pháp
1.4.1 Nhược điểm
Tỷ lệ phôi sống không cao, mất nhiều thời gian, cần sử dụng máy khi trữ lạnh, sử dụng nhiều
nitơ, chương trình không ổn định. Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trình mất nước cần được diễn
ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá. Do đó, thời gian cần thiết để hoàn tất một
quy trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ
nhiệt độ cực nhanh. Để có thể đảm bảo được tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp đông lạnh
chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng. Chi phí đầu tư cho một hệ
thống này rất cao, chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa hằng năm.
Khó khăn cơ bản là phải có được phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi

đến được giai đoạn phôi nang(blastocyst).
1.4.2 Ưu điểm
Do sử dụng chất bảo quản ở nồng độ thấp nên ít gây tổn thương về cấu trúc tế bào.
2. KỸ THUẬT THỦY TINH HOÁ (VITRIFICATION)
2.1 Khái niệm
Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh.Trong suốt
quá trình hạ nhiệt độ toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng
khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể
đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình đông lạnh. Sau khi
được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao (4 – 8M), mẫu
trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, không qua
quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong đông lạnh chậm. Tốc độ làm lạnh của phương
pháp này rất lớn, khoảng 2000 – 2500
0
C / phút.
2.2 Kỹ thuật:
2.2.1 Chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant)
Nhìn chung, các chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống
như trong kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một
dung dịch dùng để thủy tinh hóa luôn bao gồm 1 hoặc 2 chất bảo vệ đông lạnh có khả năng
thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nước bên trong tế bào và 1 chất bảo
vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm
đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn.
Chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol,propylene
glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH).
Chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose
và galactose.
Trong thành phần môi trường thủy tinh hóa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glycol
và 1 chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thường là DMSO
hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm được khả năng thẩm thấu qua

màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của
từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao.
2.2.2 Dụng cụ
 Lưới đồng (copper grid): kỹ thuật thủy tinh hóa sử dụng lưới đồng trong đông lạnh phôi
được thực hiện đầu tiên. Kích thước giọt môi trường chứa phôi rất nhỏ và phần lớn lượng
môi trường này đều đi qua các lỗ nhỏ trên bề mặt lưới, chỉ còn tế bào trứng hoặc phôi được
giữ lại bên trên mặt lưới một cách an toàn. Các lưới đồng chứa trứng/phôi được bảo quản
trong những tube nhỏ chứa đầy nitrơ lỏng trước khi đưa vào thùng lưu trữ.
 OPS (open-pulled straw): đây là một loại straw có đường kính trong nhỏ hơn rất nhiều so
với đường kính nguyên thủy của các loại straw 0,25ml thường dùng trong đông lạnh chậm.
Người ta tạo ra OPS bằng cách làm nóng chảy straw 0,25ml và kéo dãn bằng tay, sau đó