PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU TỪ VI SINH VẬT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NÔNG MINH TUẤN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU
VI SINH VẬT (MICROBIAL FUEL CELL) SỬ DỤNG LÀM
CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC THẢI
Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
Mã số: 60420107

TÓM TĂT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014


Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa Học Tự
Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thế Hải

Phản biện 1: TS. Đinh Thúy Hằng
Phản biện 2: TS. Hồ Tú Cường

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp
tại: Phòng 327 nhà T1 – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học
Quốc Gia Hà Nội
Vào 9 giờ 00 ngày 04 tháng 12 năm 2014

Có thể tìm luận văn tại:

Trung tâm Thư viện Đại học Quốc Gia Hà Nội


I. MỞ ĐẦU
Nước là một phần thiết yếu trong quá trình sinh hoạt–sản xuất của con
người. Tuy nhiên, với sự phát triển của dân số, quá trình đô thị hóa, công
nghiệp hóa, lượng nước do con người sử dụng đang ngày càng gia tăng, đi
kèm với nó là hậu quả gây ô nhiễm nước nghiêm trọng. Ảnh hưởng của ô
nhiễm nước đối với sức khỏe con người có thể thông qua hai con đường: (i)
ăn-uống phải nước bị ô nhiễm hay các loại rau quả và thủy sản được nuôi
trong môi trường nước ô nhiễm, (ii) do tiếp xúc với môi trường nước trong
quá trình lao động và sinh hoạt. Ngoài ra ô nhiễm nước còn kéo theo các thiệt
hại về kinh tế do bệnh tật, thiệt hại về thủy sản và nông nghiệp, và ảnh hưởng
tới nguồn cung cấp nước sạch.
Một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm nguồn nước hiện nay
là tình trạng nước thải chưa qua xử lý hoặc xử lý kém được trực tiếp xả vào
môi trường. Để ngăn chặn nguy cơ này thì cần phải có các phương pháp hợp
lý để đánh giá nhanh chất lượng nước thải sau xử lý, nhằm đáp ứng nhu cầu
của người sản xuất cũng như người quản lý.
Phương pháp phân tích hóa-lý là phổ biến hiện nay được sử dụng cho
việc phân tích-đánh giá chất lượng nước thải. Phương pháp này sử dụng mối
tương tác giữa chất cần phát hiện trong nước với một loại hóa chất được thêm
vào dùng làm chỉ thị để định tính cũng như định lượng chất cần kiểm tra, hoặc
áp dụng các kỹ thuật như: sắc ký lỏng cao áp (HPCL), sắc ký phối khổ (GC –
MS), hay phương pháp so màu... Tuy nhiên, tất cả các kỹ thuật này đòi hỏi
người phân tích phải có tay nghề chuyên môn cao, tốn kém trong sử dụng, và
thời gian phân tích dài.
Những nghiên cứu gần đây đã tập trung phát triển phương pháp sử
dụng tác nhân sinh học như một cảm biến hay một hệ thống cảnh báo sớm
chất lượng nước. Cảm biến sinh học (biosensor) là hệ thống phân tích các tác

nhân sinh học như DNA, enzymes, mô, cơ thể sống kết hợp với việc đánh giá
– đo lường các dấu hiệu hóa – lý các tác nhân sinh học đó. Các cảm biến sinh
học tỏ ra thuận lợi trong việc đánh giá chất lượng nước như kiểm tra trực tiếp
nguồn nước, nhạy cảm với chất độc và phát hiện nhiều độc tố cùng một thời
điểm, cảnh báo chất độc, không chỉ theo dõi độc tính mà còn theo dõi tốc độ
thay đổi thành phần-nồng độ chất độc, có thể theo dõi từ xa, dễ dàng sử
dụng... Trong đó, cảm biến sinh học khai thác quá trình trao đổi chất của vi
sinh vật đang được đặc biệt quan tâm nghiên cứu và ứng dụng. Pin nhiên liệu

3


vi sinh vật là một dạng thiết bị cảm biến hoạt động dựa trên hoạt tính điện hóa
của vi sinh vật. Loại thiết bị này được nghiên cứu tại nhiều quốc gia như Hàn
Quốc, Hoa Kỳ, hay Châu Âu, chúng có ưu điểm như có khả năng chỉ dẫn
BOD nước thải, có thời gian phản ứng nhanh, dễ dàng sử dụng, chi phí thấp.
Tại Việt Nam hiện nay những nghiên cứu về pin nhiên liệu vi sinh vật
cũng như ứng dụng chúng làm cảm biến sinh học trong đánh giá chất lượng
nước thải còn khá hạn chế. Nhằm góp phần vào các nghiên cứu về pin nhiêu
liệu vi sinh cũng như phát triển một thiết bị cảm biến có khả năng đánh giá
chất lượng nước thải với thời gian phân tích nhanh và khả năng sử dụng nhiều
lần… chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu phát triển thiết bị pin nhiên
liệu vi sinh vật (Microbial fuel cell) sử dụng làm cảm biến sinh học đánh
giá chất lượng nước thải”.

4


II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh
vật học - Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, sử dụng các máy
móc, thiết bị chuyên môn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học, Sinh học
phân tử đạt tiêu chuẩn:
- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ).
- Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)
- Máy điện di ngang (BioRad, Mỹ)
- Máy DGGE K-2401 (C.B.S Scientific, Mỹ)
- Bàn soi gel LMW-20 UVP (UK).
- Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)
Hóa chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật: Pepton, các muối (NaCl,
MgSO4, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4…); nguyên tố vi lượng (H3BO3,
CoCl2.6H2O...) có xuất xứ Trung Quốc (Xilong), Agar (Việt Nam), Cao nấm
men (Sigma, Hoa Kỳ).
Hóa chất sử dụng trong phương pháp điện di gel biến tính DGGE:
Acrylamide, Bis-AA, 50x TAE buffer, Formamide, TEMED (tetramethyl
ethylenediamine), APS (Ammonium persulfate) do hãng Affymetric (USB,
Mỹ) cung cấp.
Hoá chất sử dụng trong các thí nghiệm Sinh học phân tử: Bộ hóa chất
sử dụng tách ADN (Glycogen 20 mg/ml, Ethanol 100 %, Ammonium
acetate) , phản ứng PCR (USB Taq PCR Master Mix 2x), điện di kiểm tra sản
phẩm PCR (HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x, Loading Dye 6x,
GeneRuler 1kb ADN Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR
Product Cleanup). Tất cả đều được cung cấp bởi Affymetric USB, Merck và
Fermentas (Mỹ).
Vật liệu cấu tạo pin nhiên liệu vi sinh vật:
- Polyacrylic (Việt Nam)
- Vải than chì (Việt Nam)
5

- Thanh than chì (Việt Nam)
- Màng nafion 117 (Hoa Kỳ)
- Nối nhanh ϕ 4mm (Trung Quốc)
- Ống nước phi ϕ 4mm (Đài Loan)
- Dây chuyền nước (Trung quốc)
Đồng Hồ đo điện:
- Đồng hồ vạn năng Extech (Hoa Kỳ)
- Máy đo điện tự động KEITHLEY (Hoa Kỳ)
2.1.2 Nguồn vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành chọn lựa các nguồn quần xã khác nhau phục vụ cho
việc làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa có khả năng tốt nhất cho việc phát triển
cảm biến sinh học trong MFC từ nguồn tự nhiên và nguồn đã bị ô nhiễm gồm:
-

- Nguồn bùn thải khu dân cư: phố Chùa Láng – quận Đống Đa - Hà Nội
Mẫu đất tự nhiên (ĐT): gồm hỗn hợp các nguồn đất được lấy từ Fansipang –
Sapa – Lào Cai, Đất tại vườn quốc gia Cúc Phương và đầm Vân Long – Ninh

-

Bình.
Mẫu bùn tự nhiên (BT): gồm hỗn hợp của bùn được lấy từ Đầm vân Long –

-

Ninh Bình vàVườn quốc gia Xuân Thủy – Nam Định.
Mẫu bùn hoạt tính (BH): Gồm bùn kỵ khí và hiếu khí (Nhà máy bia Hà Nội –

-

Hưng Yên – Khu Công Nghiệp Phố Nối A – Hưng Yên).
Mẫu Nước Thải (NT): Bùn và nước thải hỗn hợp (Làng giấy Phong Khê – Bắc
Ninh; Làng tái chế kim loại Đan Hội – Bắc Ninh; Cơ sở dệt nhuộn – Hồi Quan

-

– Bắc Ninh; Làng tái chế Ni lon – Văn Giang – Hưng Yên).
Mẫu hỗn hợp (HH): là hỗn hợp của mẫu đất tự nhiên, bùn tự nhiên, bùn hoạt
tính, nước thải được trộn với nhau.

2.2 CÁC THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Lựa chọn thiết kế tối ưu cho MFC

6


Chúng tôi tiến hành nghiên cứu, tổng hợp, đánh giá các ưu nhược điểm
của các dạng thiết kế MFC- và các vật liệu sử dụng cho MFC đã được công
bố, qua đó chúng tôi tiến hành lựa chọn dạng vật liệu-thiết kế phù hợp nhất
cho việc thiết kế MFC có khả năng làm cảm biến sinh học trong điều kiện Việt
Nam.
2.2.2 Thiết kế, lắp đặt hệ thống MFC
Pin nhiên liệu vi sinh vật được thiết kế dựa trên thiết kế của Kim và
cộng sự [26]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thử nghiệm hai dạng
thiết kế MFC (dạng khoang hình hộp chữ nhật và khoang hình trụ) và ba thể
tích khoang anode (5 ml; 7,5 ml; và 10 ml) .
2.2.3 Quy trình làm giầu vi sinh vật trong các MFC:
Phục vụ thí nghiệm lựa chọn thiết kế MFC tối ưu: Quần xã vi sinh vật

thí điểm được làm giàu từ mẫu nước thải khu dân cư tại phố Chùa Láng - quận
Đống Đa - thủ đô Hà Nội. Quần xã được tiến hành làm giầu với dung dịch
anode mô phỏng nước thải có nồng độ BOD = 50 ppm với tốc độ dòng 0,3
ml/phút. Song song với quá trình làm giầu, chúng tôi tiến hành chạy MFC đối
chứng hóa học (MFC không được bổ sung vi khuẩn).
Phục vụ thí nghiệm lựa chọn nguồn vi sinh vật tối ứu: Sau khi lựa chọn
được thiết kế MFC tốt nhất cho việc phát triển cảm biến sinh học đánh giá
chất lượng nước thải, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các MFC với thiết kế đó
và hệ vi sinh vật làm giàu từ các nguồn quần xã vi sinh vật khác nhau (Mục
2.1.2). Các MFC được làm giàu với dung dịch anode mô phỏng nước thải có
nồng độ BOD 30 ppm với tốc độ dòng 0,3 ml/ phút tại điều kiện nhiệt độ
phòng. Ban đầu hai khoang anode và cathode của các MFC bị ngăn bởi 1 lớp
màng nilon (không có khả năng cho các ion đi qua) trong thời gian 14 ngày,
sau đó chúng tôi tiến hành đổi chúng bằng lớp màng nafion117.
2.2.4 Vận Hành Hệ Thống MFC
Hệ thống MFC của chúng tôi được vận hành liên tục: Với khoang
cathode chứa nước bão hòa oxy được chảy tuần hoàn nhờ bơm (Boyu FP2000,
Trung Quốc) dẫn nước từ bồn chứa có sử dụng sục khí (HEIBAO aquarium
7


HB-248A, Trung Quốc), nước tại bồn được thay hàng ngày. Tại khoang anode,
dung dịch mô phỏng nước thải theo Kim và cộng sự (2006) và thêm dung dịch
có chứa nồng độ BOD cẩn kiểm tra gồm glucose và glutamat được tính toán
nồng độ theo Ủy ban đo lường tiêu chuẩn và sức khỏe cộng đồng của Hoa Kỳ
(1995), dung dịch được đựng trong bình Duran 2 lít và chảy vào khoang anode
thông qua dây chuyền dịch (Human Luzhou Huikang Development Co., Ltd,
Trung Quốc), và tốc độ dòng vào được điều chỉnh nhờ có van điều tiết [26,
54].
Với các thí nghiệm làm giàu vi sinh vật anode và đánh giá hoạt động

của các MFC, các MFC được vận hành với dung dịch nước thải mô phỏng có
giá trị BOD là 30 ppm.
Với các thí nghiệm lựa chọn thiết kế ưu việt hơn, các MFC được vận
hành với các dung dịch nước thải mô phỏng có các giá trị BOD là 5 và 50
ppm, thay đổi luân phiên.
Với các thử nghiệm khả năng đánh giá chất lượng nước thải của các
thiết bị, các MFC được vận hành với các dung dịch nước thải mô phỏng có các
nồng độ BOD khác nhau (0, 5, 15, 30 và 50 ppm).
2.2.5 Đo đạc và xử lý số liệu
Hiệu điện thế của các MFC được đo bằng đồng hồ vạn năng EX MN 35
(Extech, Hoa Kỳ), với thời gian 30 phút/ lần-đo một ngày 8 tiếng hoặc bằng
cách sử dụng máy đo điện KEITHLEY (Hoa Kỳ) với thời gian đo 10 phút/lần,
hiệu điện thế của MFC được xử lý và vẽ đồ thị bằng phầm mền Microsoft
Excel 2010. Dòng điện của MFC sẽ được tính bằng công thức I = U/ R (Định
luật ôm), trong đó: I là cường độ dòng điện (Ampe: A), U là điện áp ở hai đầu
đoạn mạch (Vol: V), R là điện trở của mạch (ohm).
2.2.6 Phương pháp phân tích vi sinh vật theo phương pháp truyền thống
Phân lập hệ vi sinh vật trên điện cực anode: Sau khi làm giàu vi sinh
vật trong MFC thành công, tiến hành cắt 5 x 1 x 5 mm điên cực anode cho vào
9 ml nước muối sinh lý và tiến hành vortex, sau đó dịch điện cực anode được
tiến hành pha loãng theo dày nồng độ giảm 10 lần đến 10 4 bằng nước muối
sinh lý, tiếp đó tiến hành cấy trải dịch điện cực anode trên môi trường C, LB,
BG11, Hansen, PDA. Các khuẩn lạc thu được sẽ được chọn lựa và làm thuần
bằng phương pháp cấy ria ba pha trên môi trường cùng loại. Mẫu vi sinh vật

8


thu được sẽ được bảo quản trên ống môi trường thạch nghiêng tương ứng với
nhiệt độ 4oC và glycerol 15% tại nhiệt đô -20oC.

Quan sát hình thái vi khuẩn: Các chủng phân lập được tiến hành
nhuộm gram và đem soi dưới kính hiển vi quang học (Zeiss - Đức), ở vật kính
100 x và được chụp ảnh bằng máy ảnh Canon G10 (Nhật Bản) ở các độ phóng
đại 8.5 x; 11.5 x; 14 x. Với quy trình: lấy một khuẩn lạc thuần của chủng vi
khuẩn và khuẩn lạc của Bacillus subtilis hoặc E. coli trộn với nhau và cố định
hai vết bôi trên lam kính sạch, sau đó tiến hành nhuộm mẫu với dung dịch tím
kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút, tiếp ta rửa mẫu bằng nước cất, mẫu được
nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút. Vết bôi được rửa lại bằng
ethanol 96% trong 30 giây, sau đó được rửa lại bằng nước cất. Mẫu được
nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm bổ sung màu đỏ Safranin (hay Fuchsin Ziehl)
trong 30 giây. Cuối cùng, mẫu được rửa bằng nước cất, để khô và soi dưới
kính hiển vi quang học.
2.2.7 Phương pháp DGGE
Quy trình tách chiết DNA [30]: Mẫu điện cực anode hoặc dịch vi khuẩn
được tách chiết DNA theo quy trình sau: Các ống Eppendorf có chứa 1 ml
mẫu được ly tâm trên máy Eppendorf 5417R (Đức) ở 8000 rpm, 20oC trong 10
phút. Gạn bỏ dịch nổi; phần lắng được mix đều với 0,5 mL nước vô trùng MQ.
Sau đó, các dung dịch này được bổ sung 500 µL hỗn hợp Phenol: Chloroform:
Isoamyl alcohol (25: 24: 1) và vortex khoảng 20 giây trước khi ly tâm trên
máy Eppendorf 5417R (Đức) ở 14.000 rpm, 20°C trong 10 - 15 phút. Tiếp
đến, thu dịch nổi và chuyển vào một ống Eppendorf vô trùng khác. Các ống
này tiếp tục được bổ sung lần lượt 1 µL glycogen, 100 µL 7,5 M ammonium
acetate và 750 µL ethanol 100% trước khi ủ qua đêm ở nhiệt độ -20 °C. Hỗn
hợp này tiếp tục được ly tâm trên máy Eppendorf 5417R (Đức) với điều kiện
14.000 rpm, 30 phút, 4 °C thu DNA, DNA thu được được rửa lại ba lần trong
dung dịch ethanol 70%. Cuối cùng, DNA được để khô tự nhiên qua đêm trước
khi pha loãng với 50 µL nước PCR. Sản phẩm tách chiết DNA được kiểm tra
trên máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa thuốc
nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch
TAE 1x với hiệu điện thế 100 V-thời gian 20 phút, và được quan sát trên máy

soi gel LMW-20 UVP (UK).
Quy trình khuếch đại đoạn gen 16s rRNA: DNA thu được từ điện cực
anode hoặc chủng nuôi cấy thuần sẽ được đưa vào chạy PCR trên máy PCR
9700 (Applied Biosystems, Mỹ) với mục đích khuếch đại gen 16s rRNA (1400

9


bp) bằng cặp mồi p63F (5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC3′, mồi xuôi) và
p1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG3’, mồi ngược) [19] với
thành phần phản ứng và chu trình như Bảng 13, sản phẩm PCR được kiểm tra
trên máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa thuốc
nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch
TAE 1x với hiệu điện thế 100 V-thời gian 20 phút, và được quan sát trên máy
soi gel LMW-20 UVP (UK). Sau khi nhân đoạn 16s rRNA của mẫu thành
công, chúng tôi tiếp tục sử dụng sản phẩm PCR khuếch đại gen 16s rRNA làm
khuôn nhằm khuếch đại vùng V3 (200 bp) bằng cặp mồi p338F-GC (với một
kẹp GC được thêm vào) (5’ ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3’, mồi xuôi)
và p518R (5’ATTACCGCGGCTGCTGG 3’, mồi ngược) [47] theo quy trình ở
Bảng 14 để phục vụ cho quá trình phân tích trên DGGE. Sản phẩm PCR được
kiểm tra trên máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa
thuốc nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung
dịch TAE 1x với hiệu điện thế 100 V-thời gian 20 phút, và được quan sát trên
máy soi gel LMW-20 UVP (UK).
Quy trình điện di DGGE: Quá trình điện di được tiến hành trên gel
polyacrylamide 6% với gradient biến tính Urea/ formamide từ 45% đến 60%
(Bảng 15, 16). Ta tiến hành trộn 15 µl mỗi mẫu với 10 µl Loading Dye 6x và
tra vào mỗi giếng. Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di DGGEK –
2401 (C.B.S Scientific - Mỹ), trong đệm TAE 1x, ở nhiệt độ 60 oC, hiệu điện
thế 38V, thời gian 16 giờ. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung

dịch HydraGreen Safe ADN Stain 1x trong 30 phút, sau đó rửa lại bằng nước
cất trong 10 phút và quan sát bằng máy soi LMW-20 UVP (UK).
Quy trình thôi gel: Những băng phân tách trên bản gel DGGE được cắt
bằng dao cắt gel vô trùng, sau đó được rửa lại bằng nước MQ và bổ sung thêm
50 µl nước MQ, để qua đêm ở 4 oC. Dịch thôi ADN được dùng làm khuôn để
thực hiện phản ứng PCR tương tự như phản ứng PCR cho DGGE Bảng 15 với
cặp mồi 338F và 518R. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit ExoSAP –
IT (Affymetric) và giải trình tự bởi FirstBase (Singapore).
10


Phân tích kết quả DGGE: Kết quả điện di DGGE sẽ được phân tích
nhờ phần mềm NTSYSpc2.0 dựa trên phân tích ma trận tương đồng – ma trận
khoảng cách của mẫu từ số lượng băng thu được, sau đó tiến hành phân tích
nhóm (cluster analyses) để xác định tương quan giữa các quần xã. Trình tự gen
16S rRNA của các đơn chủng và trình tự của các băng thu được trên điện di
DGGE được phân tích trên phần mềm clustalx 2.0, và BioEdit Sequence
Aligment Editor, sau đó được tiến hành tìm kiếm so sánh trình tự tương đồng
trên công cụ BLAST của NCBI ().

11


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 LỰA CHỌN THIẾT KẾ MFC PHÙ HỢP
3.1.1 Lựa chọn vật liệu cho MFC
Chúng tôi tiến hành so sánh ưu nhược điểm của từng loại vật liệu phục
vụ cho thiết kế MFC đã được công bố trong những nghiên cứu trước đây
(Bảng 17; 18; 19). Qua đó, chúng tôi lựa chọn sử dụng vải than chì (0,8 Ω)
làm điện cực, chúng được nối với thanh gom điện làm bằng than chì đường

kính 0,6 cm (0,2 Ω) thông qua keo epoxy (Thái Lan) có trộn với bột than chì.
Tiếp theo, chúng tôi lựa chọn màng CEM nafion 117 làm màng ngăn cách
giữa hai khoang MFC, vì loại màng này cho dòng điện phát sinh cao, tạo pH
ổn định trong khoang anode. Cuối cùng, qua so sánh, chúng tôi chọn vật liệu
polyacrylic làm khung MFC, vì đây là vật liệu có thể khử trùng và dễ dàng cải
biến hình dạng.
3.1.2 Lựa chọn thiết kế MFC nhằm phát triển cảm biến sinh học
Sau khi lựa chọn được vật liệu để chế tạo MFC, chúng tôi tiếp tục
nghiên cứu các dạng thiết kế MFC đã được công bố trên thế giới và so sánh
phân tích ưu nhược điểm của chúng qua đó lựa chọn được dạng thiết kế tối ưu
nhất cho việc phát triển cảm biến sinh học đánh giá chất lượng nước thải
(Bảng 20, 21). Như ta đã biết, cảm biến sinh học (biosensor) trong đánh giá
chất lượng nước cần những yêu cầu như: chỉ dẫn chính xác chất lượng nước,
kiểm tra trực tiếp chất lượng nước, thời gian phản ứng với sự thay đổi chất
lượng nước ngắn, giá thành rẻ… Tuy nhiên, dòng điện được sinh ra bởi MFC
chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố như: hoạt động của vi sinh vật, sự di
chuyển-tốc độ electron từ tế bào đến điện cực, sự di chuyển của proton từ
khoang anode tới khoang cathode, điện trở trong của hệ thống, tốc độ và lượng
oxy phản ứng tại khoang cathode, oxy hòa tan trong khoang anode[26]… Do
đó, nhằm hạn chế các yếu tố ảnh hưởng tới MFC, đã có rất nhiều dạng thiết kế
MFC đã được nghiên cứu phục vụ cho việc phát triển cảm biến sinh học và tối
ưu độ hoạt động của chúng. . Ưu nhược điểm của các dạng thiết kế này đã
được chúng tôi phân tích ở Bảng 20.

12


Sau khi tiến hành nghiên cứu và so sánh ưu-nhược điểm của các dạng
thiết kế MFC tại Bảng 20 và 21, chúng tôi lựa chọn thiết kế MFC dựa trên mô
hình của Kim và cộng sự năm 2006 [26]. Đây là dạng thiết kế MFC có thể tích

khoang anode nhỏ nên sẽ cơ thời gian phản ứng với các nồng độ BOD khác
nhau nhanh hơn. MFC của chúng tôi được thiết kế là dạng MFC hai khoang
với dạng hình hộp và hình trụ, với ba thể tích khoang anode là: 5 ml; 7,5 ml;
10 ml. Hệ thống MFC vận hành với khoang cathode sử dụng nước bão hòa
oxy chạy tuần hoàn (nước được thay 1 ngày/lần), còn khoang anode không sử
dụng chất truyền điện tử trung gian, và dịch đầu vào anode chúng tôi không sử
dụng nitơ để tạo điều kiện kỵ khí. Với những đặc điểm trên, chúng tôi mong
đợi MFC có thể tích khoang nhỏ sẽ cho tốc độ cảm ứng với chất lượng nước
thải nhanh hơn. Việc không sử dụng dung dịch đầu vào anode kỵ khí, không
sử dụng chất truyền điện tử trung gian và sử dụng cathode chứa dung dịch
nước được sục khí là nhằm tăng khả năng triển khai cho ứng dụng ngoài thực
địa. Ngoài ra, do hoạt động của MFC còn chịu nhiều ảnh hưởng của cấu trúc
khoang, đường đi của dòng dung dịch và tốc độ lưu dịch trong khoang, chúng
tôi tiến hảnh thử nghiệm hai dạng thiết kế khoang hình trụ và hình hộp chữ
nhật với thể tích khoang anode biến đổi từ 5-7, 5-10 ml nhằm chọn ra thiết kế
tốt nhất cho việc thiết kế một cảm biến sinh học có độ nhạy cao và ổn định.
3.1.3 Thử nghiệm để chọn lựa thiết kế thiết kế ưu việt hơn
3.1.3.1 Kết quả làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong MFC
Để phục vụ cho việc lựa chọn thiết kế tối ưu cho các MFC, chúng tôi
tiến hành làm giàu một quần xã vi sinh vật điện hóa thí điểm trong MFC từ
nguồn bùn thải khu dân cư (Hình 19).
Kết quả cho thấy, dòng điện bắt đầu xuất hiện từ ngày thứ 3 (với MFC
dạng thiết kế hình hộp chữ nhật là 0,005 mA và MFC khoang hình trụ là 0,002
mA), sau khi hệ thống MFC được làm giầu với quần xã vi sinh vật trong nước
thải khu dân cư, dòng điện đạt được mức ổn định tại hiệu điện thế đạt khoảng
0,3 mA từ ngày 16 trở đi. Thêm vào đó đối với MFC đối chứng (không được
làm giàu với quần xã vi sinh vật) ta có thể nhận thấy không có dòng điện xuất

13

hiện. Như vậy, chúng tôi đã làm giàu được quần xã vi khuẩn điện hóa thí điểm
trong các MFC với các thiết kế thử nghiệm.
3.1.3.2 So sánh các MFC với dạng thiết kế khác nhau
Về độ ổn định của dòng điện sản sinh bởi hai dạng MFC: Sau khi làm
giàu hệ vi sinh vật điện hóa thí điểm trong MFC thành công, chúng tôi so sánh
độ ổn định dòng điện của các dạng thiết kế MFC với nhau. Có thể nhận thấy,
dòng điện sinh ra từ MFC khoang hình hộp chữ nhật là ổn định hơn so với
dạng thiết kế MFC khoang hình trụ.
Về độ nhạy trong phản ứng của hai dạng MFC với sự thay đổi giá trị
BOD của dung dịch andoe: Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với hai nồng độ
BOD = 5 ppm và BOD 50 ppm nhằm so sánh độ nhạy của các MFC với thiết
kế khác nhau (chứa quần xã vi sinh vật điện hóa thí điểm). Có thể thấy rằng,
khi thay đổi nồng độ BOD từ 50 ppm xuống 5 ppm, dòng điện sinh ra với cả
hai dạng MFC có xu hướng giảm (0,35 - 0,3 mA xuống 0,1 – 0,05 mA), và
phải mất đến khoảng 2 giờ 30 phút thì dòng điện mới bắt đầu đạt mức ổn định.
Ngược lại, khi thay đổi BOD từ 5 ppm lên 50 ppm, MFC dạng khoang hình
hộp có thể tích 5 ml và 7, 5 ml có sự tăng dòng điện ngay trong lần đo đầu tiên
(đo 10 phut/ lần trong thời gian thử BOD) và đạt mức ổn định ngay sau 30
phút; còn đối với các MFC còn lại, phải mất từ 60 – 90 phút dòng điện mới có
thể bắt đầu đạt được mức ổn định với dòng điện tăng từ khoảng 0,05 đến 0,3
mA. Trong khi đó, dòng điện sinh ra bởi MFC đối chứng (không thay đổi nồng
độ BOD) là không đổi. Khi so sánh phản ứng dòng điện của hai MFC dạng
khoang hình hộp chữ nhật với thể tích anode là 5 ml và 7,5 ml, có thể nhận
thấy thời gian cảm ứng của chúng với các nồng độ BOD là giống nhau, nhưng
MFC dạng khoang hình hộp chữ nhật với thể tích anode 7,5 ml có khả năng
phân biệt sự sai khác giữa giá trị BOD 50 ppm và 5 ppm tốt hợn so với MFC
dạng khoang hình hộp chữ nhật có thể tích khoang 5 ml.
Vậy kết quả thu được cho thấy độ nhạy với sự thay đổi nồng độ BOD
của MFC dạng khoang anode hình hộp chữ nhật là cao hơn so với độ nhạy của

MFC dạng khoang anode hình trụ. Hơn nữa, MFC dạng khoang anode hình
hộp chữ nhật với thể tích khoang 5 ml và 7,5 ml có độ nhạy cao hơn so với
MFC cùng dạng có thể tích khoang anode 10 ml
*Ghi chú: ĐC là ký hiệu MFC đối chứng, tại đó MFC không được thay đổi
nồng độ BOD.

14


3.2 LỰA CHỌN NGUỒN VI SINH VẬT PHÙ HỢP ĐỂ LÀM GIÀU HỆ
VI SINH VẬT ĐIỆN HÓA TRONG CÁC MFC
3.2.1 Dòng điện phát sinh bởi các MFC trong giai đoạn làm giàu hệ vi
sinh vật điện hóa
Sau khi thử nghiệm các dạng thiết kế khác nhau, chúng tôi tiến hành
làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong các MFC dạng khoang hình hộp chữ
nhật có thể tích anode là 5 ml (ký hiệu là TX) và 7,5 ml (ký hiệu BO) từ năm
quần xã vi sinh vật khác nhau (đất tự nhiên-ĐT, bùn tự nhiên-BT, bùn hoạt
tính-BH, nước thải-NT, hỗn hợp-HH). Kết quả cho thấy sau khi MFC được
thay màng nilon bằng màng nafion 117 (14 ngày được gây nhiễm vi sinh vật
từ các quần xã), dòng điện xuất hiện ngay lập tức và đạt giá trị từ 0,1 – 0,13
mA. Sau 8 ngày dòng điện của các MFC được làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa
từ nguồn hỗn hợp, nước thải, bùn hoạt tính và bùn tự nhiên đều đạt giá trị ổn
định (dao động từ 0,35 mA đến 0,5 mA). Còn đối với MFC được làm giàu từ
nguồn đất tự nhiên, phải sau 19 ngày dòng điện mới đạt giá trị dòng điện ổn
định (0,5 – 0,6 mA).

3.2.2 Độ ổn định của dòng điện phát sinh trong MFC sau khi làm giàu
thành công hệ vi sinh vật điện hóa
Một trong những yêu cầu của cảm biến MFC đánh giá BOD của nước
thải là: với mỗi nồng độ cơ chất nhất đinh, dòng điện sinh ra phải có tính ổn

định. Vì vậy, chúng tôi theo dõi và so sánh tính ổn đinh của dòng điện sinh ra
bởi các MFC với hệ vi sinh vật được làm giàu từ các nguồn khác nhau nêu
trên. Khi so sánh dòng điện phát sinh của các MFC (trong giai đoạn sau khi
làm giàu thành công) tại hai thời điểm cách nhau khoảng 20 ngày, có thể thấy
rằng: MFC được làm giàu từ nguồn đất tự nhiên và bùn hoạt tính có dòng điện
phát sinh trong cả hai giai đoạn là khá ổn định, và tại hai thời điểm theo dõi thì
giá trị dòng điện của MFC làm giàu từ nguồn đất tự nhiên là khá bằng nhau
(0,45 -0,49 mA) (Hình 27). Ngược lại, với các MFC được làm giàu từ nguồn

15


bùn tự nhiên, nước thải, hỗn hợp, dòng điện phát sinh sau 20 ngày theo dõi là
không ổn định và có giá trị thấp hơn, dao động trong khoảng 0.2 mA.
Hơn nữa, khi so sánh dòng điện thu được sau khi làm giàu thành công
hệ vi vật điện hóa trong MFC từ các nguồn khác nhau, ta có thể nhận thấy
MFC được làm giàu từ nguồn đất tự nhiên có dòng điện phát sinh (0,45 – 0,49
mA) là cao hơn so với các nguồn làm giàu từ bùn tự nhiên, nước thải, bùn hoạt
tính, và nguồn hỗn hợp (dưới 0,4 mA).
Các kết quả trên chứng tỏ các MFC được làm giàu từ nguồn quần xã vi
sinh vật khác nhau cũng ảnh hưởng tới dòng điện phát sinh và độ ổn định của
dòng điện tại MFC.
3.2.3 Kết quả phân lập hệ vi sinh vật trong điện cực anode của MFC sau
khi làm giàu thành công
Nhằm hiểu rõ hơn về ảnh hưởng của nguồn vi sinh vật ban đầu đến hệ
vi sinh vật hình thành trong các MFC, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng
vi sinh vật trong điện cực anode của những MFC nêu trên. Sau khi phân lập
mẫu điện cực anode được cắt ra từ các MFC (sau quá trình làm giàu) trên các
môi trường (môi trường LB, C; Hansen; PDA, BG11), chúng tôi chỉ thu được
các khuẩn lạc mọc trên môi trường LB. Điều này chứng tỏ hệ vi sinh vật trên

điện cực anode trong MFC của chúng tôi đa phần là vi khuẩn dị dưỡng. Theo
nhiều nghiên cứu khác, nhiều vi khuẩn trong các MFC vận hành với các cơ
chất hữu cơ là các vi khuẩn dị dưỡng [37]. Ngoài ra, số chủng phân lập được
trong các MFC của chúng tôi là khác nhau giữa các nguồn quần xã ban đầu,
thậm chí ngay cả trong MFC được làm giàu cùng nguồn quần xã ban đầu cũng
có số chủng phân lập được và tỷ lệ có mặt của các chủng là hoàn toàn khác
nhau.
3.2.4 Kết quả phân tích quần xã vi khuẩn bằng phương pháp DGGE
Dựa trên kết quả nuôi cấy, và căn cứ vào các công bố trước đây, có thể
thấy giả thuyết thuyết phục nhất là: Vi sinh vật trong anode của các MFC chỉ
bao gồm vi khuẩn. Để so sánh các quần xã vi khuẩn được làm giàu từ nguồn
khác nhau trong các MFC, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số của vi khuẩn
từ mẫu nguồn quần xã làm giàu ban đầu và mẫu điện cực anode và sau đó
phân tích sự biến đổi quần xã của sau khi được làm giàu trong MFC bằng
phương pháp DGGE

16


Khi so sánh mẫu quần xã vi khuẩn trước khi làm giàu và sau khi làm
giàu thành công trong MFC có thể nhận thấy có sự biến đổi quần xã được làm
giàu tại MFC. Điển hình nhất là tại hai quần xã làm giàu từ nguồn nước thải
và nguồn hỗn hợp, có độ tương đồng với mẫu quần xã trong MFC sau khi làm
giàu thành công là 0,64. Thêm vào đó, ta có thể nhận thấy nguồn bùn tự nhiên
và đất tự nhiên ban đầu là khá tương đồng nhau (hệ số tương đồng là 0,93) tuy
nhiên sau khi làm giàu trong MFC quần xã của hai nguồn đất tự nhiên và bùn
hoạt tính chỉ có hệ số tương đồng khoảng 0,68. Ngoài ra, trừ hai dạng thiết kế
MFC được làm giàu từ nguồn quần xã hỗn hợp ra, quần xã của hai MFC với
thiết kế khác nhau được làm giàu từ cùng một quần xã ban đầu đều có hệ số
tương đồng nhỏ hơn 0,83. Mặt khác, một số băng DNA tại nguồn quần xã ban

đầu sau quá trình làm giàu trong MFC có thể bị mờ đi hoặc không xuất hiện
(không chiếm ưu thế) tại mẫu DNA được khuếch đại từ điện cực. Và ngược lại
một số băng DNA xuất hiện tại quần xã trong điện cực anode sau giai đoạn
làm giàu trong MFC lại không xuất hiện trong nguồn quần xã ban đầu. Những
kết quả này cho thấy, mỗi quần xã vi khuẩn anode ở trong các MFC đều có sự
biến đổi lớn so với quần xã nguồn để thích nghi với điều kiện trong khoang
anode. Đây là một minh chứng cho thấy điều kiện trong mỗi MFC đã giúp làm
giàu các vi sinh vật điện hóa thích nghi cao từ quần xã nguồn.
Sự thay đổi quần xã trong MFC tại các thời gian khác nhau cũng được
nhận thấy trong nghiên cứu của Kim và cộng sự, tại đây tác giả nhận thấy
quần xã ban đầu sử dụng cho MFC (bùn kỵ khí) và quần xã được làm giàu sau
97 ngày có mức độ tương đồng rất thấp (khoảng 0,1). Ngoài ra các MFC có
thời gian làm giàu càng lâu thì độ tương đông quần xã giữa các MFC càng
cao, như: mẫu phân tích lẫy sau 21 ngày làm giàu chỉ có độ tương đồng
khoảng 0,38; còn mẫu lấy sau 97 ngày làm giàu có hệ số tương đồng lớn hơn
là 0,7.
3.2.5 Kết quả phân tích trình tự các băng DNA thu được từ các quần xã
trên DGGE
Nhằm hiểu rõ hơn về thành phần vi khuẩn có trong quần xã của các
MFC cũng như quần xã nguồn trước làm giàu, chúng tôi tiến hành thôi gel các
băng DNA thu được từ gel điện di DGGE. Sau đó chúng tôi tiến hành giải
trình tự mẫu DNA thu được và sử dụng công cụ BLAST của NCBI để phân
tích các trình tự thu được.

17


Các băng DNA xuất hiện trong bảng gel điện di biến tính (Phụ lục 4.4)
đều có trình tự đa phần giống với trình tự DNA của các loài vi khuẩn điện hóa
đã được phát hiện trong các hệ thống MFC nói chung như Geobacter sp.;

Aeromonas sp.; Shewanella amazonensis; Pseudomonas sp.: Geothrix
fermentans; Paludibacter sp; Parabacteroides sp.; Tolumonas sp.;
Flavobacterium sp.; Clostridium sp.; Desulfomicrobium sp.
Theo kết quả thu được được ở mục 3.2.2 về độ ổn định của các quần
xã, quần xã đất tự nhiên sau một thời gian dài hoạt động vẫn giữ được dòng
điện phát sinh ổn định và có giá trị cao (0,4-0,45 mA). Phân tích DGGE cho
thấy: có một băng đậm duy nhất (TD8) tại MFC làm giầu từ nguồn đất tự
nhiên – với trình tự tương ứng với đoạn trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn
thuộc chi Pseudomonas - có mặt ở hầu hết các mô hình băng của các nguồn
nhưng băng này hầu như bị mờ đi ở các mô hình băng của các quần xã được
làm giàu, trừ quần xã làm giàu từ nguồn đất tự nhiên. Quan sát này, kết hợp
với các kết quả phân tích quần xã vi khuẩn bằng phương pháp phân lập truyền
thống, dẫn đến một giả thuyết rằng: Sự hoạt động ổn định của MFC được làm
giàu từ nguồn đất tự nhiên có thể liên quan đến sự chiếm ưu thế của loài
Pseudomonas sp. (tương ứng với băng TD 8 ở Hình 31). Pseudomonas nói
chung là các vi khuẩn biến dưỡng, có khả năng sống linh hoạt tại các môi
trường khác nhau. Nhờ đó, chúng sẽ dễ dàng thích nghi với điều kiện sống
trong khoang anode hơn so với các chủng vi khuẩn khác. Ngoài ra, từ kết quả
phân lập vi khuẩn từ các MFC khoang hình hộp 5 ml và 7,5 ml) với hệ vi sinh
vật được làm giàu tự nguồn đất tự nhiên, trong số ba chủng vi khuẩn phân lập
được, chủng chiếm ưu thế là Pantoea agglomerans là một vi khuẩn điện hóa
mạnh. Hơn nữa, so sánh trình tự DNA khác thu được từ các băng DGGE của
MFC làm giàu từ nguồn đất tự nhiên đều thấy có độ tương đồng cao với các
chủng vi khuẩn điện hóa như Geobacter sp.; Shewanella amazonensis …Vì
vậy, giả thuyết mà chúng tôi đưa ra là: Các vi khuẩn điện hóa trong khoang
anode của các MFC làm giàu từ nguồn đất tự nhiên có tương tác tốt với
Pseudomonas sp. và vẫn cho phép loài này chiếm ưu thế, trong khi loài này có
khả năng sử dụng cơ chất và thích nghi linh hoạt; qua đó quần xã vi khuẩn sẽ
ít bị biến động hơn, dẫn đến sự phát sinh dòng điện ổn định hơn của các MFC
này so với của các MFC làm giàu từ các nguồn khác. Trong trường hợp các

quần xã làm giàu từ các nguồn khác, sự mất ưu thế của Pseudomonas sp. có lẽ
liên quan đến tính bất ổn định của dòng điện sinh ra.
18


Tổng hợp các kết quả nghiên cứu nói trên, chúng tôi quyết định lựa
chọn nguồn đất tự nhiên là nguồn tối ưu cho việc làm giàu hệ vi sinh vật điện
hóa trong các MFC để sử dụng thử nghiệm đánh giá chất lượng nước thải
3.3 BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM HỆ THỐNG MFC VỚI DUNG DỊCH
MÔ PHỎNG NƯỚC THẢI SAU XỬ LÝ TRONG PHÒNG THÍ
NGHIỆM
Sau khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của các thiết kế và nguồn làm giàu
khác nhau, chúng tôi bước đầu tiến hành thử nghiệm MFC dạng thiết kế
khoang hình hộp chữ nhật thể tích 7,5 ml được làm giàu từ nguồn quần xã đất
tự nhiên với dung dịch mô phỏng nước thải sau xử lý có các nồng độ BOD 0,
5, 15, 30, 50 ppm và thu được kết quả tại Hình 33.
Từ kết quả ở Hình 33, có thể thấy hệ thống MFC của chúng tôi có phản
ứng tốt với các nồng độ BOD khác nhau. Dòng điện có quan hệ tuyến tính với
nồng độ BOD trong khoảng nồng độ BOD từ 0 ppm đến 30 ppm. Đối với
nồng độ BOD từ 30 ppm trở lên (30 và 50 ppm), dòng điện đạt mức độ ổn
định (“bão hòa”).
Khi so sánh với các hệ thống MFC biosensor khác (Bảng 21) có thể
thấy khoảng giá trị nồng độ BOD mà MFC của chúng tôi có thể phân biệt
được (0 - 30 ppm) cao hơn so với dạng thiết kế MFC biosensor của Kim và
cộng sự (2,6 - 25 ppm). Tuy nhiên, khoảng này thấp hơn so với một số hệ
thống biosensor khác: MFC của Peixoto đo được nồng BOD từ 17 - 78 ppm;
MFC của Chang là 20 - 100 ppm và MFC của Kim có thể đo được nồng độ
BOD từ 20 - 200 ppm. Mặc dù vậy, khoảng đánh giá BOD của chúng tôi hoàn
toàn phù hợp để sử dụng đánh giá nhanh BOD của mẫu nước thải bất kỳ: Với
các mẫu nước thải xử lý kém có BOD vượt quá 30 ppm (ngưỡng cho phép

theo tiêu chuẩn A của QCVN40 BTNMT-2011) thì thiết bị sẽ cho tín hiệu đạt
tới hoặc trên mức dòng điện “bão hòa” (khoảng 0.4-0.5 mA tùy từng thiết bị.

19


KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã đạt được một số kết quả chính sau:
-

Đã thiết kế và chế tạo thành công thiết bị MFC có khả năng vận hành với nước

-

thải mô phỏng.
Đã chọn ra được loại thiết kế là MFC khoang hình hộp chữ nhật 7,5 ml có khả

-

năng sinh ra dòng điện cảm ứng tốt với nồng độ BOD.
Đã lựa chọn được đất tự nhiên là nguồn phù hợp nhất phục vụ cho việc làm
giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong MFC để sử dụng làm cảm biến đánh giá chất

-

lượng nước thải.
Đã làm giàu thành công hệ vi sinh vật điện hóa, bao gồm những vi sinh vật có
khả năng sản sinh dòng điện mà không cần bổ sung chất nhận điện tử trung

-

gian.
Đã xác định được vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas chiếm ưu thế trong quần

-

xã của các MFC sinh dòng điện ổn định nhất (làm giàu từ đất tự nhiên).
Các MFC được phát triển có dòng điện phát sinh tương quan tuyến tính với
nồng độ BOD của dung dịch nước thải mô phỏng (ở anode) trong khoảng giá
trị BOD từ 0 – 30 ppm, trong điều kiện phòng thí nghiệm.

KIẾN NGHỊ
- Tối ưu quy trình thử nghiệm và hệ thống MFC nhằm nâng cao được
khả năng đánh giá BOD của thiết bị.
20


- Tiến hành thử nghiệm hệ thống MFC với các yếu tố ảnh hưởng tới
dòng điện phát sinh trong MFC, qua đó đưa ra các khuyến cáo, thông số hiệu
chỉnh nhằm phản ánh đúng chất lượng nước thải.
- Thử nghiệm thêm các giá trị cơ bản khác (pH, kim loại nặng, thuốc
trừ sâu…) của nước thải xử lý kém với hệ thống MFC
- Nghiên cứu sâu hơn về tương tác giữa các vi sinh vật trong khoang
anode thiết bị được làm giàu, tìm hiểu về hoạt tính điện hóa của quần xã vi
sinh vật đó để làm rõ vai trò của chúng trong quá trình truyền điện tử đến điện
cực.
- Thử nghiệm thiết bị trong điều kiện thực tế.

21