Đề cương Nghiên Cứu Quy Trình Nhân Nhanh Giống Cây Ba Kích Tím ( Morinda officinalis stow ) Bằng Phương Pháp in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG
Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường
---------------------------------------------------

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN/CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP

TÊN ĐỀ TÀI : Nghiên Cứu Quy Trình Nhân Nhanh Giống Cây Ba Kích Tím
( Morinda officinalis stow ) Bằng Phương Pháp in vitro
Người thực hiện

: Nguyễn Hữu Quân

Lớp

: 513301035

Khóa

: 513

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Phùng Tôn Quyền

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Đồng Thị Kim Cúc

Địa điểm thực tập

: Viện Di Truyền Nông Nghiệp

Hà Nội - Năm 2017
1


ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN/CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP
1. Họ và tên sinh viên:

Nguyễn Hữu Quân

Tel: 0988256360

Mail:

2. Chuyên ngành:

Công Nghệ Sinh Học

3. Lớp: 513301035

Khoá : 513

4. Giáo viên hướng dẫn:

TS . Đồng Thị Kim Cúc

Tel: 0987620886

Mail:

Tên đề tài:
“Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống cây Ba Kích Tím (Morinda officinalis
stow) bằng phương pháp in vitro”

Học viên thực hiện
(Ký và ghi rõ họ tên)

XÁC NHẬN CỦA CƠ SỞ THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

2


Phần 1 : MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây ba kích (Morinda officianalis Stow) là cây thuốc quý trong y học cổ truyền.
Củ của cây ba kích được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác dụng bổ
thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng, sức dẻo dai, khử
phong thấp. Dịch chiết từ củ ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh với
các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon (Li và cs., 2003).
Do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên cây ba kích
bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở
nên kiệt quệ. Mặt khác, vùng phân bố của ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài
cây này rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam
cần phải được bảo vệ (Nghị định số 48/2002/NĐ-CP).
Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống ba kích có chất lượng tốt đang là yêu
cầu cấp bách. Nguồn cung cấp cây giống ba kích hiện nay chủ yếu bằng phương
pháp giâm cành, nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, chỉ đạt 0,6 lần/năm, chất
lượng cây giống lại không cao (Triệu Văn Hùng, 2007). Để cải thiện hệ số nhân
giống cây ba kích, một số tác giả đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô
tế bào.

Tuy nhiên kết quả mà các tác giả thu được chưa thực sự khả quan, khi hiệu
quả khử trùng chỉ đạt 32,8% mẫu sạch (He và cs., 2000) hay hệ số nhân cao nhất chỉ
đạt 6,0 chồi/mẫu cấy (Chen và cs., 2006). Tại Việt Nam, mới chỉ có duy nhất một
nghiên cứu nhân giống cây ba kích có nguồn gốc từ huyện Tây Giang, Quảng Nam
bằng nuôi cấy mô được thực hiện bởi Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010).
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết lập quy trình nhân giống in vitro cây ba
kích có nguồn gốc từ huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh, bắt đầu từ khâu vào mẫu
cho đến khâu thích nghi cây ngoài vườn ươm, có hệ số nhân giống cao và chất
lượng cây giống tốt.
3


Ở nước ta cây Ba kích còn khá mới mẻ so với các loại cây trồng khác và là
một loại cây có giá trị kinh tế đang được chú ý phát triển hiện nay .
Với mục tiêu phát triển ngành Lâm Nghiệp Việt Nam giai đoạn 2010 – 2020
là nâng cao tỷ lệ che phủ của rừng và chất lượng rừng trồng . Do vậy những loài cây
được trồng không chỉ là những cây lấy gỗ lâu năm phù hợp với hoàn cảnh đất trồng
rừng mà cũng phải đảm bảo có năng suất cao, chu kỳ kinh doanh ngắn có nhiều tác
dụng đáp ứng nhu cầu cấp thiết đặt ra hiện nay. Đặc biệt trong những năm gần đây
việc trồng cây lâm sàn ngoài gơ dưới tán rừng được xem như là một chiến lược lớn
nhằm đáp ứng cả hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện tích trồng rừng và cải thiện
môi trường cũng như tính đa dạng sinh học của rừng. Một trong những loài cây
dược liệu có kinh tế cao đang được đưa vào trồng xen dưới tán rừng đó là cây Ba
Kích.

.
Cây Ba Kích có 2 loại là Ba Kích Tím và Ba Kích Trắng. Cây Ba Kích tím

được sử dụng nhiều hơn bởi hàm lượng dược liệu có trong củ tốt hơn so với cây Ba
Kích Trắng. Cây Ba Kích Tím( Morinda officinalis Stow )thuộc họ cây cà phê

Rubioceae. Cây Ba Kích tím được xem là loài cây dược liệu quý hiếm cú rất nhiều
công dụng. Nước Ba Kích sắc có tác dụng hạ huyết áp, tăng sức dẻo dai, tăng cường
đề kháng cơ thể, chống viêm, chống viêm, chưa thận hư, tráng dương, phụ nữ khó
thụ thai, tay chân đau nhức, chữa gân xương yếu... có giá trị xuất khẩu cao. Ngoài ra
cây Ba Kích cũng được dùng ngâm rượu .
Nhưng năm gần đây Ba Kích mọc tự nhiên trong rừng bị khai thác cạn kiệt
dẫn đến diện tích bị thu hẹp, nguồn sống cạn dần. Hiện nay nhiều hộ gia đình tiến
hành phát triển trồng cây Ba Kích. Song từ trước đến nay chủ yếu dùng nhân cây
giống từ hạt và hom. Việc nhân giống bằng hạt không phải bao giờ cũng thuận lợi
và hợp lý, thời gian nảy mầm dài, tỷ lệ nảy mầm thấp mặt khỏc cây giống đem trồng
có nguồn gốc từ hạt không đảm bảo do hiện tượng phân ly trong sinh sản hữu tính
nên quần thể cây rừng không còn giữ được phẩm chất ưu việt của nguồn giống đem
4


trồng. Đối với phương pháp giâm hom th́ì hệ số nhân giống thấp, cây trồng bằng
hom có sức sống yếu kém , chất lượng củ kém.
Khó khăn lớn nhất hiện nay là nguồn giống có phẩm chất di truyền tốt phục
vụ cho trồng rừng đại trà còn hạn hẹp. Cùng với yêu cầu và sự phát triển của thị
trường hiện nay cần một lượng cây giống có chất lượng cao rất lớn. Để giải quyết
nhu cầu cây giống hiện nay và tương lai việc nhân giống cây Ba Kích bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào là một hướng đi cần thiết bởi có thể nhân số lượng cây lớn
trong thời gian ngắn để cung cấp thị trường mặt khác cây nuôi cây mô mang nhiều
ưu điểm, có sức trẻ hóa cao, cây non mang được toàn bộ tiềm năng di truyền quý
của bố mẹ, tăng sự đồng đều rừng trồng, cây trồng có sức sinh trưởng và phát triển
cao có tuổi thọ lớn. Cây con được tạo ra từ công nghệ nuôi cấy mô tế bào sẽ khắc
phục được những nhược điểm của việc tạo cây con từ hạt và giâm hom. Để góp
phần giải quyết các tồn tại trên , tôi tiến hành đề tài :
“ Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống cây Ba Kích Tím (Morinda officinalis
stow) bằng phương pháp in vitro “

1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Ba Kích Tím (Morinda officinalis stow) bằng
phương pháp in vitro.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
Nhân giống vô tính và tái sinh cây ba kích bằng phương pháp in vitro.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Hoàn thiện quá trình nhân giống vô tính để tạo nguồn nguyên liệu cho tái
sinh và tạo cây hoàn chỉnh ở cây Ba Kích.
-Cung cấp tài liệu học tập, nghiên cứu cho sinh viên.
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài nhằm đưa ra quy trình nhân nhanh và tái sinh
của cây Ba kích.
5


Phục vụ cho việc tạo cây hoàn chỉnh góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu
phục vụ cho sản xuất.
.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu chung :
- Nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân giống cây Ba Kích bằng phương pháp
nuôi cấy mô, nhằm góp phần phục vụ công tác duy trì và sản xuất giống cây Ba
Kích bằng phương pháp nuôi cấy mô.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu cây
Ba Kích.
- Nghiên cứu ảnh hưởng một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân
nhanh của chồi Ba Kích.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA , IBA tới khả năng ra rễ của chồi Ba Kích.

- Xác định ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống và sinh trưởng
chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm.
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.4.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân
giống và bảo tồn loài Ba Kích Tím.
Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân giống và bảo tồn loài Ba
Kích Tím.
Cung cấp tài liệu học tập, nghiên cứu cho sinh viên.
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đề tài phục vụ cho việc tạo cây hoàn chỉnh góp phần nhân giống
phục vụ trực tiếp cho các ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược học phục
vụ cho sản xuất.
6


PHẦN 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2. Cơ sở khoa học của đề tài
2.1 Giới thiệu chung về chi Ba kích
2.1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
* Nguồn Gốc
- Ba kích còn có tên là Dây ruột già, Chẩu phóng xì (Quảng Ninh), Sáy cáy (Thái),
Thao tày cáy (Tày), Ba kích thiên (Trung Quốc)… Tên khoa học Morinda
officinalis stow, họ cà phê (RUBIACEAE). Ba kích phân bố chủ yếu ở các tỉnh
thuộc vùng núi thấp và trung du phía Bắc, bao gồm: Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng
Ninh, Bắc Cạn, Phú Thọ, Thái Nguyên, Bắc Giang, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa;
phía nam có Đèo Sương Mù Huyện Hướng Hóa (Quảng Trị), Tây Giang (Quảng
Nam); Ở Trung Quốc, Ba kích phân bố chủ yếu ở Vân Nam, Quảng Tây, Hải Nam.
Ở Quảng Ninh Ba kích tím phân bố nhiều ở hầu hết các khu vực đồi núi thấp. Tuy
nhiên 2 khu vực có cây Ba kích tím nhiều nhất là Hoành Bồ và Tiên Yên. Vật liệu

lấy mẫu tôi đã chọn cây mẹ từ khu bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn – Kỳ Thượng –
Hoành Bồ (Quảng Ninh).
* Phân loại khoa học
Giới ( regnum )

Plantae

( không phân hạng )

Angiospermae

( không phân hạng )

Eudicots

( không phân hạng )

Asterids

Bộ ( ordo )

Gentianales

Họ ( familia )

Rubiaceae

Chi ( genus )

Morinda

Loài ( species )

M. officinalis

7


2.1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây ba kích tím
* Đặc điểm thực vật học
Rễ dạng trụ tròn phân nhánh nhiều cấp thành bộ phận rễ phân bố tỏa tròn
xung quanh gốc, nhìn ngoài có vết thắt từng đoạn, thịt rễ dày, nạc, màu tím hoặc
trắng ngà. Cành non dạng bốn cạnh, màu tím hoặc xanh, có lông .
Lá mọc đối, khi non màu xanh hoặc màu tím, khi già màu xanh, cuống lá dài
từ 4- 8mm. Lá kèm màu nâu dạng mo, ôm thân. Phiến lá thường hình mác thuôn
nhọn, hình ellip thuôn dài nhọn hoặc hình mác ngược hay hình trứng. Hiếm khi
thấy hình mác hẹp dài. Phiến lá dài 3 - 16cm, rộng 1,9 - 6,5 cm đầu lá thuôn nhọn
hay nhọn sắc, gốc lá nhọn hình nêm, tròn hay gần bằng, có khi hơi lõm dạng tim .
Cụm hoa chủ yếu là xim tán kép, ít khi là cụm hoa tán đơn. Ở cụm sim tán
kép, hoa hầu như không cuống, cụm tán đơn hoa có cuống rõ ràng. Hoa nhỏ ống
đài dạng chén, có 3 - 4 răng nhỏ không đều. Tràng màu trắng, ống tràng dài 2 3mm, họng có lông, ở đầu có 3 - 4 cánh tràng dạng tam giác nhỏ. Nhị 3 - 4 bao
phấn nhọn đầu, hai ô, đính lưng, chỉ nhị cực ngắn. Vòi nhụy ngắn, đầu nhụy hai
thùy .
Ở cụm quả đơn, quả có cuống rõ ràng. Mỗi quả có 4 hạt. Hạt có lông màu
hồng, khi khô màu trắng. Mùa hoa quả tháng 4 - 5, quả chín tháng 10 - 11, cá biệt
có thể quả chín từ tháng 9 hoặc kéo dài tới đầu tháng 7.

8

* Đặc điểm sinh lý
Cây ưa ẩm, ưa sáng và có khả năng chịu bóng, nhất là khi còn nhỏ. Ba kích
thường mọc tự nhiên trong các kiểu rừng thường xanh nhưng đã trở nên thứ sinh,
bao gồm cả rừng xen tre nứa và rừng non phục hồi sau nương rẫy .
Cây sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm.
Ra hoa quả hàng năm. Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt hoặc mọc cụm chồi từ
các phần còn lại sau khi chặt, phần rễ còn sót lại khi khai thác cũng có thể nảy
mầm thành cây mới.
0

0

Yêu cầu về nhiệt độ là nhiệt độ trung bình năm 22,5 C - 23,1 C. Độ ẩm
không khí trung bình năm từ 82 - 89%. Ba kích mọc tự nhiên trên các loại đất
feralit đỏ - vàng hay vàng - đỏ, tầng đất thịt ở trên tương đối dày, có kết cấu tượng
hạt và kết vón nhưng không có đá ong chặt. Đất luôn ẩm, hơi chua, pH từ 3,6 đến
4,1, hàm lượng mùn 3,78 - 5,91%. Hàm lượng tổng số các chất trong 100g đất lần
lượt là: Nitơ 0,24 - 0,34mg, Lân 0,7 - 1,5mg và Kali 7mg. Ngoài ra Ba kích có thể
sống trên đất feralit đỏ sẫm. Tầng đất mặt ở đây tương đối dày (tới 1m), thành phần
cơ giới nặng, cấu tạo hạt chắc và tơi xốp, pH hơi chua đến trung tính 4,5 - 6, hàm
lượng mùn ở mức trung bình 3 - 4%. Tại Hoành Bồ - Quảng Ninh và Sơn Động Bắc Giang còn thấy Ba kích mọc trên đất bồi tụ, pha cát ở chân núi. Loại đất này
thường nghèo dinh dưỡng hơn so với loại đất trên. Ba kích không thích hợp với đất
phù sa và các loại đất khác ở đồng bằng.

9


Ánh sáng là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và
phát triển của Ba kích. Trong tự nhiên cây mọc xen lẫn với các loài cây khác dưới
tán rừng, độ che tán 20 - 60%. Tuy nhiên để sinh trưởng phát triển được, cây

thường leo lên các cây bụi hay cây gỗ nhỏ để tiếp cận với ánh sáng. Cây được chiếu
sáng đầy đủ ra hoa quả nhiều hơn và nhiều hạt chắc hơn cây bị che bóng.
Ba kích là cây ưa ẩm nên nhu cầu về nước đối với Ba kích là một nhân tố không thể
thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Có nước đầy đủ mới đảm bảo được
quá trình quang hợp, hô hấp và trao đổi chất. Ngoài ra nước còn làm cho đất luôn
ẩm, hệ thống lông hút được bảo vệ và bộ rễ nạc mới phát triển tốt. Ngược lại cây Ba
kích bị thiếu nước hạt sẽ bị lép nhiều, thậm chí cây tự vàng úa, khô héo và có thể bị
chết. Tuy nhiên, vào thời kỳ hoa nở, nếu gặp mưa liên tục vài ngày sẽ ảnh hưởng
trực tiếp tới khả năng thụ phấn, tỷ lệ đậu quả thấp. Ngoài ra, Ba kích là cây không
chịu được ngập úng. Nếu bị ngập nước liên tục 5 - 7 ngày, cây cũng sẽ bị chết.
Cây Ba kích sử dụng các chất hữu cơ và khoáng có sẵn trong đất. Trong tự
nhiên, lá cây mục và các sản phẩm thứ cấp khác là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho
đất. Trong trồng trọt, Ba kích được trồng trên các loại đất gần như không còn các
lớp phủ thực vật thì nguồn cung cấp này do phân bón .
2.1.1.3. Giá trị của cây ba kích tím
Rễ cây Ba kích có chứa các hợp chủ yếu như Antharaglucosid tectoquinon,
alizarin1 methul ether, lucidin metythyl ether 1, hydroxy 3
hydroxyMethyllanthraquinon, các iridoid glucosic, các sterolg sitosterol. Lacton:
(4R, 5S)
5- hydroxy hexan-4-olid. Các chất vô cơ: K, Na, Mg, Al, Fe, P, Ba, Zn, Cu... Ngoài
ra còn có đường, nhựa, acid hữu cơ, tinh dầu. Rễ tươi còn có vitaminC [9].
Nước sắc rễ ba kích thử trên súc vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng, chuột cống
trắng) có tác dụng rõ nét về tăng lực, chống độc, chống viêm, làm tăng cường co
bóp ruột, hạ huyết áp và có độc tính thấp. Vì thế, Ba kích được dùng chủ yếu làm
thuốc bổ, tăng lực trong các trường hợp nam giới yếu về khả năng sinh dục, làm
10


tăng tính ham muốn. Ba kích còn dùng làm thuốc chống mệt mỏi, kém ăn, kém ngủ
và đau mỏi xương khớp ở người có tuổi.

Theo y học cổ truyền, Ba kích là vị thuốc có tác dụng bổ trí não, trợ dương,
ích tinh, mạnh gân cốt, chữa các bệnh về tình dục, người già mỏi mệt, kém ăn, ít
ngủ nhưng không có biểu hiện bệnh lý. Đặc biệt, tuy Ba kích có tác dụng giúp
bình thường hoá và cải thiện tình dục nhưng Ba kích không kích dục kiểu
androgen và không độc. Gần đây, thành phần hoá học và nhiều tác dụng dược lý
mới của Ba kích cũng đã được phát hiện như trống stress, chống trầm cảm và
chống oxy hoá .
Với phương châm “phòng bệnh hơn chữa bệnh” của ngành y tế, việc nghiên
cứu và sản xuất các loại thuốc bổ để tăng cường sức khoẻ thường xuyên của
cộng đồng, góp phần ngăn ngừa bệnh tật ngày càng được đẩy mạnh. Trong bối
cảnh đó, Ba kích đang trở thành một trong những cây thuốc bản địa độc đáo của
nước ta .
2.1.2. Phương pháp nhân giống cây Ba kích
2.1.2.1. Phương pháp nhân giống truyền thống
* Gieo hạt
Là phương pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành cây con, hạt giống được thu
từ quả đã chín, trong điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm hình thành cây.
Ưu điểm: vận chuyển và bảo quản hạt giống dễ dàng do kích thước hạt
giống nhỏ.
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp.
* Cắt chồi từ cây mẹ
Là phương pháp cắt cành (ngó) từ củ cây mẹ để cho tạo thành những cây mới.
Ưu điểm: ít tốn thời gian.
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp, cây dễ bị thoái hóa, rễ
cây yếu. Phương pháp này không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể được truyền
từ cây mẹ sang.
11


2.1.2.2. Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học

* Nuôi cấy mô (nhân giống in vitro)
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn
thân non nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể mới hoàn
chỉnh.
Ưu điểm: Hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ động trong việc
sản xuất cây con phục vụ cho công tác giống.
Nhược điểm: Cây con có kích thước nhỏ, xảy ra đột biến biến dị làm xuất
hiện những cây không mong muốn, cần trang thiết bị đặc biệt (Võ Quốc Việt và cs,
2010) .
Ngoài ra, theo Hoàng Ngọc Thuận (2000) việc nuôi cấy in vitro sử dụng
nguồn hydrocacbon nhân tạo do đó mà khả năng tự tổng hợp chất hữu cơ kém, đồng
thời cây nuôi cấy in vitro được nuôi trong bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa, do vậy
mà khi trồng cây ra ngoài điều kiện tự nhiên cây thường bị mất nước, không thích
nghi được cây dễ bị héo và chết.
2.2 Tình hình nghiên cứu chi Ba kích trên thế giới và Việt Nam
2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nhu cầu sử dụng thuốc cho điều trị bệnh trên thế giới ngày càng tăng. Theo
thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá cho đến nay 80% dân số thế giới
dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu, trong đó
chủ yếu là thuốc từ cây cỏ. Thế giới hiện nay có hơn 35000 loài thực vật dùng làm
thuốc, trong đó có khoảng 2500 cây thuốc được buôn bán trên thế giới. Ở Châu Âu, có
ít nhất 2000 cây thuốc được sử dụng. Ở Châu Á, có khoảng 5000 loài ở Trung Quốc,
1700 loài ở Ấn Độ, trong đó có đến 90% thảo dược thu hái hoang dại .
Trong Ba Kích có Gentianine, Carpaine, Choline, Trigonelline, Díogenin,
Yamogenin, Gitogenin, Tigogenin, Vitexin, Orientin, Quercetin, Luteolin, Vitamin
B1 (Chinese Hebral Medicine), Morindin, Vitamin C (Trung Dược Học).
12


Rễ chứa Antraglycozid, đường, nhựa, Acid hữu cơ, Phytosterol và ít tinh dầu,

Morindin. Rễ tươi có sinh tố C (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam).
Trong Ba kích có Rubiadin, Rubiadin-1-Methylether (Vương Yến Phương –
Thực Vật Học Báo 1986, 28 (5): 566), Palmitic acid, Vitamin C, Nonadecane (Chu
Pháp Dữ - Trung Dược Thông Báo q986, 11 (9): 554), 24-Ethylcholesterol (lý Quán
– Trung Quốc Trung Dược Tạp Chí 1991, 16 (11): 675).
2.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Theo Trung tâm Tài nguyên và Môi trường - Đại học Quốc gia Hà Nội (2000)
đã thống kê nước ta có 3.800 loài thực vật có giá trị dược liệu. Việc sử dụng thảo dược
làm thuốc chữa bệnh đã có từ xa xưa, song chủ yếu dựa theo kinh nghiệm dân gian.
Trong những năm gần đây, nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm tăng mạnh,
việc khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc một cách bừa bãi làm cho các loài cây có giá
trị dược liệu bị suy giảm nghiêm trọng, một số loài đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng,
phải đưa vào danh mục thực vật rừng nguy cấp, quý, hiếm, nghiêm cấm khai thác sử
dụng vì mục đích thương mại (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm
2006 của Chính phủ). Trước thực trạng đó, Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết
định số 81/2009/QĐ-TTg về việc phê duyệt Quy hoạch phát triển ngành công nghiệp
hóa dược đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025. Trong đó, ưu tiên đầu tư sản xuất
nguyên liệu hóa dược để phục vụ sản xuất thuốc thiết yếu, thuốc có thế mạnh xuất
khẩu, thuốc từ dược liệu để thay thế thuốc nhập khẩu. Ưu tiên việc tạo dựng nguồn
nguyên liệu ổn định về số lượng và chất lượng để cung cấp cho các nhà máy chiết xuất.
Theo quy hoạch, sẽ có 22 vùng nguyên liệu sản xuất thuốc được củng cố, mở rộng
nhằm phát triển các giống cây thuốc quý của Việt Nam và thế giới. Ba kích ( Morinda
officinalis Stow ) gồm nhiều loài cây thuốc quý . Ba kích có vị cay, ngọt, tính ấm. Tác
dụng của cây ba kích bổ thận, tráng dương cường gân cốt, khử phong thấp,… ba
kích có tác dụng tăng lực rõ rệt với bệnh nhân tuổi già, suy nhược cơ thể, mệt mỏi,
ản ngủ kém. Ngoài ra còn có tác dụng giảm các triệu chứng đau khớp của các bệnh
nhân đau khớp.
13

Trong Đông y, ba kích còn là cây thuốc nam trị yếu sinh lý hiệu quả, tính ấm,
vị hơi cay. Nó có tác dụng ôn thận, mạnh gân cốt, trợ dương, trừ phong thấp. Theo
như các y gia xưa thường dùng rượu ba kích thay cho thuốc trị bệnh yếu sinh lý ở
nam giới, điều trị di tinh, lưng gối mỏi đau, gân cốt yếu mềm. những căn bệnh của
thế kỷ. Hiện nay các tài liệu mô tả về các đặc điểm sinh vật học, sinh thái học của các
loài Ba kích rất hạn chế. Trong đó loài Ba kích Tím ( Morinda officinalis Stow ) đang
bị suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên. Do vậy việc tìm kiếm phương pháp nhân
giống loài cây này có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen và phát triển cây
thuốc quý hiếm .
Tại Việt Nam, mới chỉ có duy nhất một nghiên cứu nhân giống cây ba kích có
nguồn gốc từ huyện Tây Giang, Quảng Nam bằng nuôi cấy mô được thực hiện bởi
Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm
thiết lập quy trình nhân giống in vitro cây ba kích có nguồn gốc từ huyện Hoành Bồ,
tỉnh Quảng Ninh, bắt đầu từ khâu vào mẫu cho đến khâu thích nghi cây ngoài vườn
ươm, có hệ số nhân giống cao và chất lượng cây giống tốt.
Dịch chiết từ củ ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh với các tuyến
cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon (Li và cs., 2003).
2.3 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh giống
cây trồng.
2.3.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
* Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào thực
vật. Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng (totipotency), nghĩa là mỗi
tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát
triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ của
một cây hòa thảo trong 12 ngày. Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào
được chứng minh bằng thực nghiệm. Từ đó đến nay, rất nhiều công trình nghiên cứu
14

đã tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay một phần của
cơ quan. Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học
của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
* Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Biệt hóa (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến
khi thể hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trường nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và
chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở
lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi là
phản phân hóa.

Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản
phân hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào
càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó xảy ra quá
trình phản phân hoá và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần
kinh ở động vật. Người ta đã chứng minh rằng: các tế bào càng gần trạng thái của tế
bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt
động của gene. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một gene nào đó
đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho một tính trạng mới.
Ngược lại một số gene lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình hoạt hoá, ức chế
15


diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gene của tế bào,
giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà. Khi tách riêng
từng tế bào hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá
các gene của tế bào.

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản
phân hoá của tế bào thực vật để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào, người
ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật
chính là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất kích thích sinh
trưởng này của mô nuôi cấy khác nhau tuỳ từng mục đích nghiên cứu (phát sinh
chồi, rễ hoặc mô sẹo).
2.3.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
2.3.2.1 Môi trường nuôi cấy
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử
phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí
nghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạn
chế, đặc biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởng hầu như chưa được khám
phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công.
Đến nay đã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng đã được xây dựng và
thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm các thành phần
chính sau:
* Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế
bào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng là: nhóm đa lượng và
nhóm vi lượng.
+

Các nguyên tố khoáng đa lượng
Là các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao gồm các
16


nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca. Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào
quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng nên thành tế bào. Môi trường nhiều

nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trường nhiều kali giúp cho quá trình
trao đổi chất diễn ra mạnh.
+

Các nguyên tố vi lượng
Nguyên tố vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ dưới 30ppm,

gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường
nuôi cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát
triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô
nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp. Hàm lượng
các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi trường nuôi
cấy và các đối tượng nuôi cấy.
* Nguồn cacbon
Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện
bắt buộc. Trong phần lớn các môi trường nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu là
saccharose và glucose. Ở một số mô thì có thể dùng mantose, fructose và galactose.
* Vitamin
Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) vẫn có khả
năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu
sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng. Vì vậy, phải bổ sung thêm các vitamin
cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co-enzyme xúc tác cho các
phản ứng sinh hóa trong tế bào. Các vitamin thường đươc sử dụng như:
B1(Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Panthotenic), B5 (Nicotinic acid) với nồng độ
phổ biến là 0,5 - 1mg/l. Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan
trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào thực vật.
* Các chất kích thích sinh trưởng
Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả
17

nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy. Nó ảnh
hưởng đến sự phân hóa, phản phân hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt
hóa các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng đối với
từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy, để tiến hành nuôi
cấy in vitro thành công cần phải tiến hành nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ
cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế bào
thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất kích thích sinh trưởng là auxin, cytokinin và
gibberelin.
+

Auxin
Auxin (Aux) là hormone thực vật được phát hiện đầu tiên. Qua nhiều nghiên

cứu của các nhà khoa học, người ta nhận ra rằng Aux là hormone thực vật quan
trọng đối với toàn bộ giới thực vật. Aux dạng tự nhiên gồm có β- Indolacetic Acid
(IAA), Phenylacetic Acid, β- Indolyacetonitril Acid. Ngoài ra có các dạng Aux
được tổng hợp bằng con đường nhân tạo, đáp ứng nhu cầu của con người trong lĩnh
vực trồng trọt và nghiên cứu như: β-Indolbutiric Acid (IBA), α-Naphtylacetic Acid
(α-NAA), 2,4 Diclorophenoxiacetic Acid (2,4D)…
Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử dụng thường xuyên trong
nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Aux kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của
môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào
và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng kết hợp với
cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ Aux trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc
vào: kiểu tăng trưởng và phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng Aux nội sinh của
mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa Aux ngoại sinh và Aux nội sinh.
Aux kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to dẫn đến tăng kích
thước của các cơ quan như tăng diện tích lá, phình to của quả, củ, tăng đường kính

và chiều dài của cành, thân, rễ, tạo quả không hạt, kìm hãm sự rụng lá, hoa quả...
Aux điều khiển tính hướng của cây như hướng sáng, hướng đất. Do sự phân
bố không đều của Aux ở hai phía của cơ quan, dẫn đến sự sinh trưởng không đều
18


của tế bào trong một cơ quan, gây ra tính hướng.
Ở cấp độ tế bào, Aux còn ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất, các quá
trình sinh lý của cây trồng như: quang hợp, hô hấp, trao đổi nước hay khoáng, tăng
khả năng thẩm thấu của tế bào, tăng quá trình trao đổi acid nucleic, protein…
Quan trọng nhất là Aux kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất định
trên cành chiết, cành giâm và trên mô nuôi cấy. Vì vậy, trong kỹ thuật nhân giống
vô tính, việc sử dụng Aux để kích thích ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc.
+

Cytokinin
Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế

bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, BAP. Kinetin là một dẫn xuất của bazo
nito adenine được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất nucleic acid. BAP
là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và
BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của
tế bào phôi sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào. Ngoài ra, các chất này có tác
dụng lên qua trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và tăng
cường hoạt tính của nhiều loại enzyme. Cơ chế tác động của cytokinin ở mức độ
phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các
nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng
hợp DNA. Tác động phối hợp giữa auxin và cytokinin có tác động quyết định đến
sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của Skoog
(1963) cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao phù hợp cho sự hình thành rễ và thấp thì

thích hợp cho sự phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức cân bằng thì thuận lợi cho
phát triển mô sẹo. Miller và Skoog (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin
trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha
trong phân bào và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường. Cytokinin
được hình thành bởi rễ và hạt đang phát triển.
+

Gibberellin
Gibberellin là nhóm hormone thực vật thứ hai được phát hiện sau auxin bởi
19


nhà nghiên cứu người Nhật Kurosawa (1920) từ việc nghiên cứu bệnh của cây mạ
do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra, đây là chứng bệnh rất phổ biến trong nghề
trồng lúa ở các nước phương Đông thời bấy giờ, khi nghiên cứu cơ chế gây bệnh
ông đã tách được hàng loạt các chất là sản phẩm tự nhiên của nấm G. Fujikuroi
cũng như từ thực vật bậc cao gọi là gibberellin A. Hiện nay, người ta đã phát hiện
được trên 50 loại gibberellin và ký hiệu A1, A2, …,A52 hoặc GA1, GA2, …, GA5,
… trong đó GA3 (gibberellic acid) có hoạt tính mạnh nhất.
Gibberellin (GA) được tổng hợp trong phôi và các cơ quan đang sinh trưởng
khác như lá non, rễ non, quả non…. GA được vận chuyển không phân cực, có thể
hướng ngọn và hướng gốc tùy vào vị trí cơ quan sử dụng. Trong tế bào, nơi tổng
hợp GA mạnh nhất là ở lục lạp.
Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng
kéo dài của thân, sự vươn dài của lóng cây họ lúa. Hiệu quả này có được do ảnh
hưởng kích thích đặc trưng của GA lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Vì vậy,
khi xử lý GA làm tăng nhanh sự sinh trưởng dinh dưỡng nên làm tăng sinh khối
của chúng.
GA ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng các đột biến lùn. Các nghiên cứu về
trao đổi chất di truyền của GA khẳng định rằng các đột biến lùn của một số thực

vật như ngô, đậu Hà lan (chiều cao của cây chỉ bằng 20% chiều cao của cây bình
thường) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu những gen chịu trác nhiệm
tổng hợp các enzyme của một số phản ứng trên con đường tổng hợp GA mà cây
không thể hình thành được GA dù là một lượng rất nhỏ. Với những đột biến này thì
việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho cây sinh trưởng bình thường.
* Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia hữu cơ được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích
sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, dịch chiết khoai tây,
chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước dừa chứa các acid amin,
20


acid hữu cơ, đường, Myo-inositol và các chất có hoạt tính auxin, các gluoxit của
cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng do trong thành phần
của chúng có chứa một số loại vitamin và các chất kích thích tố có tác dụng tích
cực đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cây nuôi cấy.
* Chất giá thể (thạch - Agar)
Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường nuôi cấy, hàm
lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng.
Khi nồng độ agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất
dinh dưỡng cũng như sự hấp thụ của mô gặp khó khăn. Đa số nuôi cấy phôi được
thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào từng loại cây mà sử dụng
cho phù hợp. Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng, việc sử dụng agar được
tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và
một số nguyên tố khác ở dạng vết.
* Giá trị pH môi trường
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận
các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng môi trường
nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi
trường về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy mô sẹo (callus) của nhiều loài cây, pH

ban đầu thường là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị từ 6,0 - 6,5. Đặc
biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid,
vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về
từ 5,5 - 6,5.
Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài
thực vật biến đổi từ 5,0 - 6,0. Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong
khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar đồng thời hoạt hóa các enzyme
hydrolase, dẫn tới kìm hãm sự sinh trưởng, kích thích sự già hóa của tế bào trong
mô nuôi cấy.
2.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy
21


Nhiệt độ: là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt tới sự phân chia tế bào và
quá trình trao đổi chất trong các mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng đến hoạt
động của auxin do đó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây nuôi cấy mô.
Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định trong khoảng 25 – 27°C.
Ánh sáng: có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng.
Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy
nhiều loại mô. Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại
nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ.
2.6. Tình hình nhân giống và sử dụng củ Ba kích Tím
2.6.1. Nhân giống bằng phương pháp hữu tính
Vơi phương pháp này Ba Kích Tím được trồng bằng hạt. Thu hái quả chín
vào khoảng tháng 8-10, đãi vỏ lấy hạt. Bảo quản hạt trong cát ẩm. Gieo hạt vào
mùa xuân (tháng 2-3), tỉ lệ mọc sẽ cao. Gieo hạt tươi, tỷ lệ mọc đạt 70-80%. Hạt
để cách năm có tỉ lệ mọc thấp. Chọn đất nhiều mùn, tiện tưới và thoát nước làm
vườn ươm. Ở Việt Nam vào tháng 2-3, khi cây hồi xuân, có thể tìm kiếm cây con
ở rừng đem về trồng.

2.6.2. Phương pháp nhân giống vô tính
Trong phương pháp này phần đầu của củ được cắt để làm giống. Mỗi đầu có thể
xẻ làm 4 mảnh. Thời vụ trồng vô tính này cũng vào tháng 2-3. Đất trồng cao thoáng
nước. Ngoài ra, có thể nhân giống bằng hom thân. Ba kích tím ở Việt Nam mới có thấy
sâu xanh hại lá từ tháng 4-10 và củ thối khi bị úng nước. Thu hoạch cây trồng sau 2-3
năm, thời gian càng lâu năng suất càng cao. Trồng bằng hạt có năng suất cao hơn trồng
từ mầm củ thu hoạch vào mùa đông tháng 11-12 khi cây tàn lụi. Khi đào tránh làm sây
xát củ. Năng suất trung bình gần 1 tấn củ khô/ha [28].
2.6.3. Phương pháp nhân giống in vitro.
22


Phương pháp nuôi cấy in vitro được xem như là phương pháp đạt hiệu quả
cao trong nhân giống và cải thiện các loài thực vật, trong đó bao gồm cả cây Ba
Kích Tím. Trong nhân giống in vitro đối với đối tượng này đã có những công
trình nghiên cứu khoa học được công bố cụ thể như sau:
Handique PJ. và Sharma Deboja (2010) trên cây Ba kích (Anoectochilus
setaceus Blume), ông cho rằng khi kết hợp các chất kích thích sinh trưởng với
nhau thì sẽ cho kết quả tạo chồi tốt hơn, cụ thể môi trường MS + 0,25 mg/l kinetin
+ 3,0 mg/l BA là tối ưu cho việc tạo chồi.
Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh (2011): Sử dụng môi trường MS bổ
sung 2,4-D 5mg/l, BA 0,2mg/l tạo mô sẹo từ khúc cắt đoạn thân. Môi trường MS bổ
sung BA 1mg/l, NAA 0,2mg/l, kích thích quá trình tái sinh chồi từ chồi ngủ.
Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2014) Sử dụng HgCl 2 0,1% ngâm mẫu trong thời
gian 25 phút cho tỷ lệ mẫu vô trùng đạt 89,44%. Môi trường tái sinh mầm ngủ
thích hợp là BA 0,5 (mg/l) + NAA 0,5 (mg/l). Bổ sung BA 2 (mg/l) kích thích nhân
nhanh chồi.
2.6.4. Phương pháp chế biến và sử dụng.
Hiện nay, nước ta thu hái củ Ba kích chủ yếu từ nguồn mọc hoang dại. Khi
thu về cạo sạch vỏ, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô được sử dụng làm thuốc

uống hoặc đem chiết xuất Androgen (Trung Dược Học) Từ củ Ba kích ta có thể chế
biến ra chất Androgen thô hay tinh khiết như sau: Thái hay xát củ Ba kích, ép lấy
nước, bã còn lại thêm nước vào khuấy đều rồi lại ép nữa. Làm như vậy cho tới khi
bã hết đắng (alkaloid ra hết). Nước ép để lắng, thêm nước vôi trong hoặc dung dịch
Cacbonat kiềm sẽ cho tủa Ba kích thô. Lọc hay gạn lấy phơi hoặc sấy khô. Như vậy
ta sẽ thu được Androgen thô vừa gọn, vừa dễ bảo quản và dễ vận chuyển. Từ
Androgen thô ta có thể chiết Androgen tinh khiết bằng cách dùng cồn hay dung dịch
axit sunfuric nóng 5 hay 10%, lọc rồi kết tinh. Làm đi làm lại nhiều lần, theo nguyên
tắc chung của kết tủa alkaloid
23


PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu Ba Kích Tím được cung cấp bởi Trung Tâm Thực Nghiệm Sinh Học
Nông Nghiệp Công Nghệ Cao - Viện Di Truyền Nông Nghiệp
Vật liệu nuôi cấy là chồi cây Ba kích tím đoạn thân bánh tẻ, sinh trưởng tốt,
không sâu bệnh.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
* Địa điểm và điều kiện tiến hành nghiên cứu:
Phần nuôi cấy in vitro được thực hiện tại phòng thí nghiệm - Trung Tâm
Thực Nghiệm Sinh Học Nông Nghiệp Cao, Viện Di Truyền Nông Nghiệp.
Pḥòng thí nghiệm vô trùng với các điều kiện vật lý như sau: ánh sáng
0
2000 – 2500 lux, thời gian chiếu sáng 8 – 10 giờ/ ngày, nhiệt độ 25 ± 2 c, độ
ẩm 60-70%
Phần ra cây được thực hiện tại vườn ươm tại Viện Di Truyền Nông Nghiệp
* Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2016  tháng 4/2017 .
* Giới hạn các nội dung nghiên cứu

Các nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Ba kích tím bằng phương pháp nuôi
cấy mô được tiến hành trong phòng thí nghiệm ở các giai đoạn: khử trùng mẫu cấy,
cấy khởi động, nhân nhanh chồi, tạo cây hoàn chỉnh.
Giai đoạn ngoài vườn ươm được tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời
gian huấn luyện đến sự sinh trưởng của cây con trong giai đoạn ra cây.

24


3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị
Cân phân tích
Máy khuấy từ
Máy đo PH
Lò vi sóng
Nồi hấp vô trùng
Tủ sấy
Hệ thống giàn đèn
Máy cất nước
Box cấy vô trùng

Dụng cụ
Pank
Dao, Kéo
Đèn cồn
Cốc đong, ống đong
Bình tam giác
Đĩa (hạt đậu, petri)
Chun nịt

Túi nilon
Giấy thấm

Hóa chất
Chất khử trùng (cồn 70o, HgCl2)
Môi trường MS cơ bản
Nhóm Auxin (IBA, NAA)
Nhóm Cytokinine (BA,NAA,…)
Nhóm Gibbererllin (GA3)
Đường Sacharose
Agar
Chất hữu cơ
Than hoạt tính

3.3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy.
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng Cytokinin (BAP,
Kinetin) đến khả năng nhân nhanh của chồi.
Nghiên cứu ảnh hưởng của Auxin (NAA, IBA) đến khả năng ra rễ của chồi
Ba kích.
Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm.

25