Nghiên cứu nhân nhanh giống lan Hồ điệp (HL2) từ mô lá bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào doc

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (HL2) TỪ MÔ LÁ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
Hoàng Thị Lan Hương, Lê Huy Hàm,
Nguyễn Xuân Linh, Nguyễn Thị Kim Lý
Summary
Study on micropropagation of Phalaenopsis (HL2) from leaf tips
Flower stalks of Phalaenopsis anthura Moscow 2 (HL2) were cut into 3 cm long single - node
cuttings with parts internodes, each node holding one dormant bud. The cuttings were surface -
sterilized with H
2
O
2
15% for 20 min. Segments were then cultivated on the MT medium after 8
months, each dormant bud developed in to explant.Young leaf from explants were cutted in to 1
cm
2
segments and cultured on MT medium supplemented with cytokinin [(kinetin (KIN), N6 -
benzyladenine (BAP) and Thidiazuron (TDZ)]. The leaf segments developed protocorm like body
(PLBs) within 12 weeks depending on the growth medium. An optimum of 17,7 PLBs developed
from leaf explants on medium supplemented with 2 mg/l BAP + 1,0 mg/l TDZ. Upon subculture in
MT with 50 g potato/l, the PLBs differentiated into plantlet within 8 weeks.
Keywords: Flower stalks, dormant bud, protocorm, cytokinins, BAP, KIN, TDZ, PLBs.
MT: Vacine and Went (VW) + 7 g/l agar + 10 g/l sugar + 3 g/l charcoal.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lan Hồ điệp (Phalaenopsis) là một
trong những loài phong lan có giá trị kinh tế
cao và rất được ưa chuộng bởi đó là loài hoa
rất đa dạng, phong phú về hình dáng, màu
sắc, độ bền hoa dài và thích nghi với điều
kiện trong phòng. Trong những năm gần

đây, thị trường hoa lan Hồ điệp có sức tiêu
thụ lớn hơn bất kỳ một loại hoa nào khác.
Tuy nhiên, sản xuất loại hoa này ở Việt Nam
còn nhiều hạn chế, chưa đáp ứng được nhu
cầu của thị trường về năng suất, chất lượng
và thường xuyên phải nhập nội. Do lan Hồ
điệp là loại đơn thân nên rất khó nhân giống
theo phương pháp cắt đỉnh chồi, trong khi đó
nhân giống từ hạt của những quả tự thụ phấn
sẽ tạo ra một lượng cây lớn trong thời gian
ngắn và dễ nhân giống, nhưng kỹ thuật này
không giữ được ưu thế đồng nhất của cây
hoa lan F1 mà bị phân ly mạnh ở thế hệ F2.
Chính vì vậy để tạo ra một quần thể
cây đồng đều giữ nguyên đặc tính cây mẹ,
hệ số nhân giống cao, chủ động trong việc
cung cấp giống đòi hỏi cần phải nghiên
cứu tìm ra phương pháp nhân giống có
hiệu quả nhất. Nội dung trình bày dưới đây
nhằm giới thiệu kết quả nghiên cứu về quy
trình nhân giống lan Hồ điệp từ lá bằng
phương pháp nuôi cấy Invitro.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
Mắt ngủ cành hoa của giống lan Hồ điệp
HL2 (Phalaenopsis anthura Moscow 2) sau
khi nở từ 3 - 4 bông được làm vật liệu nuôi
cấy. Giống có nguồn gốc từ Hà Lan, được
chọn lọc và đưa ra sản xuất từ Trung tâm Hoa

cây cảnh - Viện Di truyền nông nghiệp. Qua
nghiên cứu, đánh giá và sản xuất trong điều
kiện Việt Nam cho thấy giống có khả năng
thích ứng cao với đặc điểm hoa to, màu trắng,
sọc tím, môi hồng, độ bền hoa từ 8 - 9 tuần,
có khả năng chống chịu bệnh thối nhũn, thời
gian xuất hiện ngòng hoa vào đầu tháng 12.
2. Phương pháp nghiên cứu
- ghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu
vô trùng khởi đầu:
Nguồn mẫu ban đầu để tạo nguyên liệu
vô khuNn trong ng nghim là mt ng ca
cành hoa. Cành hoa sau khi ã n ưc 3 - 4
hoa ưc ct thành nhng on dài khong 3
cm có mang mt ng. Các mu ưc kh
trùng bng H
2
O
2
 các nng  10%, 15%
và thi gian 15 phút, 20 phút và 25 phút, sau
ó ưc ra li bng nưc ct 3 ln. Sau khi
kh trùng, các mu ưc cy vào môi trưng
MT (Vacine and Went (VW) + 10 g/l
sucrose + 7 g agar + 3 g/l than hot tính).
- ghiên cứu tạo protocorm:
Thí nghim nghiên cu nh hưng ca
cht iu tit sinh trưng BAP (N 6 -
benzyladenine), KIN (kinetin) và TDZ
(Thidiazuron)  các nng  khác nhau n

kh năng to protocorm t mNu lá. Lá t các
chi mc lên t mt ng ca cành hoa ct
thành nhng mNu lá có din tích 1 cm
2
cy vào
các môi trưng MT có b sung các cht iu
tit sinh trưng  các nng  khác nhau.
- ghiên cứu nhân nhanh:
Thí nghim nghiên cu nh hưng ca
mt s cht ph gia hu cơ (chui và khoai
tây) lên s nhân nhanh chi t các cm
protocorm ca mNu lá. Cy các cm
protocorm vào môi trưng MT có b sung
chui và khoai tây  các nng  khác nhau.
Các thí nghim ưc b trí ngu nhiên
vi 3 ln nhc li, mi công thc 30 mu.
- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghim
ưc tin hành ti Trung tâm Hoa cây cnh,
Vin Di truyn N ông nghip trong iu kin
hoàn toàn nhân to, có th ch ng iu
chnh ánh sáng, nhit ,  Nm theo ý mun.
Trong thí nghim này ánh sáng ưc s dng
là ánh sáng lnh ca èn neon, thi gian chiu
sáng 10 h/ngày, cưng  chiu sáng 2400 -
3000 lux, nhit  27 ± 1
0
C,  Nm 65 - 70%.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. ghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu vô
trùng khởi đầu

 to ngun vt liu ban u cho quá
trình nhân nhanh, mt ng ca cành hoa
ưc kh trùng bng H
2
O
2
 nng  và
thi gian khác nhau.
Bảng 1. Kết quả phương thức khử trùng mẫu (sau 4 tuần)
Nồng độ H
2
O
2
Thời gian khử trùng

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%)


10%
15 phút
20 phút
25 phút
50,0
40,0
26,6
10,0
6,6
13,3

40,0
53,3
60,0

15%
15 phút
20 phút
25 phút
30,0
6,6
3,3
10,0
10,0
23,3
60,0
83,3
73,3

Kt qu bng 1 cho thy: Khi kh trùng
bng H
2
O
2
 các nng  khác nhau (15 -
20%) thì t l mu sng tăng theo t l
thun vi thi gian kh trùng và ngưc li
t l mu nhim gim i. Kh  mc 15%
H
2
O

2
trong thi gian 20 phút t t l mu
sng cao nht (83,3%).
2. ghiên cứu tạo protocorm
ây là giai on quyt nh hiu qu và
tc  ca công ngh nhân ging. Giai on
này cn t các yêu cu sau:
+ Tìm ra môi trưng thích hp nht 
to ra h s nhân ging cao nht.
+ Các th tin chi to ra ng nht v
mt di truyn, có sc sinh trưng cao, ít
bin d.
Trong giai on này, chúng tôi ã ln
lưt nghiên cu tác dng ca các cht iu
hoà sinh trưng riêng r hoc kt hp  các
nng  khác nhau lên mNu lá cây lan H
ip nhm mc ích tìm ra t hp ti ưu
các cht iu hoà sinh trưng cho h s
nhân ging cao nht trong ng nghim.
Sau 8 tun, các mt ng ca cành hoa
hình thành nên cây con. Ct lá ca các cây
con này thành các mNu lá có kích thưc
khong 1 cm
2
cy vào môi trưng MT cơ
bn có b sung các cht iu hoà sinh
trưng  các nng  khác nhau.
Bảng 2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh
trưởng lên sự hình thành protocorm
(sau 12 tuần)

Nồng độ của các
chất diều hòa sinh
trưởng mg/l
Tỷ lệ tạo
protocorm
mới (%)
Hệ số nhân
(lần)
BAP 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0
0
0
24,4
33,3
17,8
0
0
0
4,0 ± 0,81
6,2 ± 1,34
4,3 ± 1,37
KIN 0,5
1,0
1,5
2,0

2,5
0
0
0
15,6
21,1
0
0
0
4,9 ± 1,37
5,6 ± 1,40
BAP + TDZ 2,0 +0,0
2,0 +0,5
2,0 +1,0
2,0 +1,5
2,0 +2,0
33,3
42,2
77,8
27,8
Tạo callus
6,2 ± 1,34
9,9 ± 1,82
17,7 ± 2,57
7,7 ± 2,22
0
KIN + TDZ 2,5 + 0,0
2,5 +0,5
2,5 +1,0
2,5 +1,5

2,5 +2,0
21,1
31,1
63,3
Tạo callus
Tạo callus
3,6 ± 0,68
7,4 ± 1,08
10,3 ± 2,11
0
0
Qua bng 2 cho thy:  công thc
không b sung hoc có b sung BAP và
KIN nhưng ở nồng độ thấp mẫu đều không
phát sinh hình thái. Nhưng ở những công
thức sau hệ số nhân và tỷ lệ tạo protocorm
tăng lên khi bổ sung BAP ở nồng độ 1,5 -
2,5 mg/l và KIN ở nồng độ 2,0 - 2,5 mg/l.
Đối với BAP, tỷ lệ tạo protocorm và hệ số
nhân đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 2 mg/l
(33,3% và 6,2 lần), đối với KIN ở nồng độ
2,5 mg/l (21,1% và 5,6 lần).
Mẫu được cấy trong môi trường kết
hợp giữa BAP và TDZ; KIN và TDZ có
ảnh hưởng rất tích cực lên sự hình thành
protocorm từ lá. Tỷ lệ tạo protocorm và
hệ số nhân tăng lên rõ rệt và đạt giá trị
cao nhất ở nồng độ 2 mg/l BAP + 1,0mg/l
TDZ (77,8% và 17,7 lần) và 2,5 mg/l KIN
+ 1,0 mg/l TDZ (63,3% và 10,3 lần). Tuy

nhiên ở nồng độ cao mẫu sẽ tạo callus.
Như vậy, môi trường thích hợp nhất cho
sự nhân nhanh protocorm là: MT + 2,0 mg/l
BAP + 1,0 mg/l TDZ.
3. hân nhanh chồi
Sau khi nhân nhanh các thể protocorm,
chúng tôi nghiên cứu tác dụng của chất phụ
gia lên sự hình thành chồi từ các thể
protocorm bằng cách cấy các thể protocorm
vào môi trường MT có bổ sung khoai tây và
chuối ở các nồng độ khác nhau.
Khoai tây và chuối đều ảnh hưởng đến
hệ số nhân chồi và tỷ lệ tạo chồi. Bảng 3
cho thấy, ở tất cả các công thức có bổ sung
khoai tây đều cho hệ số nhân và tỷ lệ tạo
chồi cao hơn so với đối chứng và đạt cao
nhất ở công thức 50 g/l khoai tây (8,6 lần và
75,6%). Tuy nhiên, nếu bổ sung ở nồng độ
cao, sự hình thành chồi từ cụm protocorm
giảm đi. Còn ở những công thức có bổ sung
chuối hoặc tổ hợp chuối và khoai tây thì hệ
số nhân và tỷ lệ tạo chồi giảm đi theo tỷ lệ
nghịch với nồng độ. Hệ số nhân và tỷ lệ tạo
chồi thấp nhất ở công thức 150 g/l khoai tây
+ 150 g/l chuối lần lượt là 2,1 lần và 14,4%.
Bảng 3. Ảnh hưởng của chất phụ gia hữu
cơ lên sự hình thành chồi (sau 8 tuần)
Nồng độ (g/l)
Hệ số nhân
(lần)

Tỷ lệ tạo
chồi (%)
MT
MT + 30 gKT
MT + 50 gKT
MT + 100 gKT
MT +150 gKT
MT + 30 gCH
MT + 50 gCH
MT + 100 gCH
MT +150 gCH
MT + 30 gKT + 30 gCH
MT + 50 gKT + 50 gCH
MT + 100 gKT + 100 gCH
MT + 150 gKT + 150 gCH
5,1
7,8
8,6
7,2
6,9
6,3
5,4
3,8
2,7
6,3
5,4
4,8
2,1
47,8
65,5

75,6
67,8
66,7
52,2
35,6
24,4
11,1
57,8
47,8
28,9
14,4
Môi trưng thích hp nht cho nhân
nhanh cây con là: MT + 50 g/l khoai tây.
IV. KẾT LUẬN
- Mắt ngủ của cành hoa được khử trùng
bằng H
2
O
2
15% trong thời gian 20 phút cho
tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất là 83,3%.
- MNu lá có din tích 1 cm
2
sau 12 tun
phát sinh ra 17,7 PLBs trong môi trưng
MT + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l TDZ.
- Sau khi nhân nhanh protocorm, cy
chuyn các protocorm này vào môi trưng
MT + 50 g khoai tây/l, sau 8 tun hình
thành chi con vi h s nhân là 8,6 chi/

cm protocorm.
TÀI LIU THAM KHO
1 Arditti, J., Ernst, R., 1993.
Micropropagation of orchids, John
Wiley and Sons, New York, US.
2 Ishii, Y., Takamura, T., Goi, M., Tanaka,
M., 1998. Callus induction and somatic
embryogenesis of phalaenopsis, Plant
Cell Rep., 17: pp: 446 - 450.
3 Park, Y.S., Kakuta, S., Kano, A., Okabe,
M., 1996. “Efficient propagation of
protocorm - like bodies of
Phalaenbopsis in liquid medium”, Plant
Cell Tiss. Organ Cult., 45: pp. 79 - 85.
4 Park, Y.S., Murthy, H.., Paek, K.Y,
2002. Rapid propagation of
Phalaenopsis from floral stalk - derived
leaves, In Vitro Cell. Dev. Biol.
Plant.,38, pp:168 - 172.
5 Polonca Kosir, Suzana Skof, Zlata
Luthar, 2004. Direct shoot regeneration
from nodes of Phalaenopsis orchid,
Cobiss code 1.01.
gười phản biện: Trần Duy Quý


T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
5