Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. viii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................................ ixx
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................... x
MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 3
1.1. Axit lactic. .................................................................................................................. 3
1.1.1. Đặc tính hóa học của axit lactic. ........................................................................ 3
1.1.2. Ứng dụng của axit lactic..................................................................................... 3
1.1.3. Các phương pháp sản xuất axit lactic. ................................................................ 5
1.1.3.1. Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học............................................... 5
1.1.3.2. Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men. ........................................... 5
1.2. Lignocellulose. ........................................................................................................... 6
1.2.1. Thành phần hóa học của lignocellulose. ............................................................ 8
1.2.1.1. Cellulose. ....................................................................................................... 8
1.2.1.2. Hemicellulose. ............................................................................................. 10
1.2.1.3. Lignin........................................................................................................... 11
1.2.2. Rơm rạ. ............................................................................................................. 12
1.3. Lên men axit lactic từ rơm rạ. ................................................................................ 13
1.3.1. Quá trình tiền xử lý . ........................................................................................ 13
1.3.1.1. Tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ. ............................................................ 15
1.3.1.2. Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm. ...................................................................... 15
1.3.2. Quá trình thủy phân. ......................................................................................... 15
1.3.3. Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân
rơm rạ bằng vi khuẩn lactic. ....................................................................................... 17
1.3.3.1. Nguồn cơ chất. ............................................................................................. 18
1.3.3.2. Chủng giống vi sinh vật. .............................................................................. 23
1.3.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men axit lactic. ............................ 29
1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân

rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam. ................................................................................ 34
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 38
iii


2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị. ................................................................................... 38
2.1.1. Vật liệu. ............................................................................................................ 38
2.1.2. Môi trường. ...................................................................................................... 38
2.1.3. Hóa chất và enzyme. ........................................................................................ 39
2.1.4. Thiết bị. ............................................................................................................ 39
2.2. Phương pháp nghiên cứu. ........................................................................................ 40
2.2.1. Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử. ....................................................... 40
2.2.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn sinh axit lactic từ đường xylose và cellobiose. ... 40
2.2.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh axit lactic. ............................................... 41
2.2.1.3. Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí và sinh hóa của chủng vi khuẩn được
chọn. ......................................................................................................................... 41
2.2.1.4. Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử. ........................... 42
2.2.1.5. Kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2. ............... 42
2.2.2. Phương pháp lên men. ...................................................................................... 42
2.2.3. Phương pháp hóa lí - sinh................................................................................. 43
2.2.3.1. Định lượng đường khử bằng DNS............................................................... 43
2.2.3.2. Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner. ............................................... 43
2.2.3.3. Xác định hàm lượng axit lactic, hàm lượng đường theo phương pháp sắc kí
lỏng cao áp (HPLC). ................................................................................................. 43
2.2.3.4. Phương pháp tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu
kín . ........................................................................................................................... 44
2.2.3.5. Phương pháp thủy phân rơm rạ bằng hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic®
Ctec2 và Cellic® Htec2 . .......................................................................................... 44
2.2.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic của chủng
vi khuẩn được lựa chọn. ........................................................................................... 45

2.2.3.7. Ảnh hưởng của duy trì pH trong quá trình lên men..................................... 47
2.2.3.8. Xác định dạng D, L axit lactic trong dịch lên men từ dịch thủy phân rơm rạ.
.................................................................................................................................. 48
2.2.4. Phương pháp toán học. ..................................................................................... 49
2.2.4.1. Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum
Y6 và từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2. .................................................. 49
2.2.4.2. Phương pháp thống kê. ................................................................................ 52
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 53
3.1. Lên men axit lactic từ xylose. .................................................................................. 53
iv


3.1.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit
lactic từ đường xylose. ............................................................................................... 53
3.1.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose.
.................................................................................................................................. 53
3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường
xylose. ....................................................................................................................... 54
3.1.1.3. Định tên chủng vi khuẩn Y6. ....................................................................... 59
3.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic từ đường
xylose của chủng L. fermentum Y6. .......................................................................... 61
3.1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose
của chủng L. fermentum Y6..................................................................................... 61
3.1.2.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường
xylose của chủng L. fermentum Y6. ........................................................................ 62
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic từ đường
xylose của chủng L. fermentum Y6. ........................................................................ 63
3.1.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường
xylose của chủng L. fermentum Y6. ........................................................................ 64
3.1.3. Tối ưu điều kiện lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum

Y6. .............................................................................................................................. 65
3.1.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc và duy trì pH ban đầu trong điều kiện tối ưu. ........ 68
3.1.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose
của chủng L. fermentum Y6. ..................................................................................... 69
3.1.4.2. Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose
của chủng L. fermentum Y6. ..................................................................................... 70
3.2. Lên men axit lactic từ cellobiose. ............................................................................ 73
3.2.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit
lactic từ đường cellobiose. ......................................................................................... 73
3.2.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường
cellobiose. ................................................................................................................. 73
3.2.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ cellobiose. 74
3.2.1.3. Định tên chủng vi khuẩn HC2. .................................................................... 77
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường và tỉ lệ cấp
giống đến khả năng lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2 từ đường
cellobiose. ................................................................................................................. 80
v


3.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường
cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 80
3.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ
cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 81
3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng lên men axit lactic từ
cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 82
3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ
cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 82
3.2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic của
chủng L. plantarum HC2. ......................................................................................... 83
3.2.3. Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum

HC2. ........................................................................................................................... 84
3.2.4. Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của
chủng L. plantarum HC2............................................................................................ 87
3.3. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ. ......................................................... 90
3.3.1. Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín và thủy phân
rơm rạ sau tiền xử lý bằng hỗn hợp enzyme Ctec2 và Htec2. .................................... 90
3.3.2. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng đơn hoặc hỗn hợp
chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6........................................................... 91
3.3.2.1. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L. plantarum HC2.
.................................................................................................................................. 92
3.3.2.2. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L. fermentum Y6. 93
3.3.2.3. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L.
plantarum HC2 và L. fermentum Y6. ....................................................................... 93
3.3.3. Nghiên cứu động học của quá trình lên men axit lactic bởi hỗn hợp chủng L.
plantarum HC2 và L. fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ. ............................. 101
3.3.4. Xác định dạng D, L axit lactic........................................................................ 102
3.3.4.1. Thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men thu được từ quá trình lên
men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L. fermentum Y6 và L.
plantarum HC2. ...................................................................................................... 102
3.3.4.2. Phân tích sản phẩm axit lactic bằng sắc kí lỏng cao áp HPLC. ................. 102
3.3.4.3. Phân tích so sánh xác định thành phần D, L lactic và độ quay phân cực của
axit lactic................................................................................................................. 103
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 105
vi


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN................................ 107
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 108
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 122

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Chú thích

16SF

Mồi xuôi (Forward primer)

16SR

Mồi ngược (Reverse primer)

ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

CBHS

Cellobiohydrolases

CFU

Colony-forming unit

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNS

Dinitrosalisylic acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EGS

Endoglucanase

EtOH

Ethanol

EMP

Embden - Meyerhof pathway

GAP

Glyceraldehyde 3 - Phosphate

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

LAB

Vi khuẩn lactic (Lactic acid Bacteria)

MRS

De Man Rogosa Sharpe

PEP

Phosphoenolpyruvate

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction)

PLA

Polylactic axit

PP

Pentose phosphate pathway

PK

Phosphoketolase pathway

RNA

Ribonucleic axit

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SSF

Simultaneously saccharification and fermentation

SHF

Separate hydrolysis and fermentation

TAE

Tris-acetate- Ethylenediaminetetraacetic acid

TE

Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid

YE

The mineral salts solution

Detector RI

Đầu dò chiết xuất RI (Reflective index detector)

viii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong các nguồn lignocellulose ........................................... 8
Bảng 1.2. Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose .............................. 24
Bảng 1.3. Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ cellobiose .................................... 26
Bảng 2.1. Hóa chất, dụng cụ chính và enzyme.................................................................... 39
Bảng 2.2. Máy, thiết bị ........................................................................................................ 40
Bảng 2.3. Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose của chủng .........
L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 50
Bảng 2.4. Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose của chủng ....
L. plantarum HC2 ................................................................................................................ 50
Bảng 2.5. Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ xylose ............................ 51
Bảng 2.6. Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ cellobiose ...................... 51
Bảng 3.1. Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường xylose ................................... 53
Bảng 3.2. Đặc điểm các chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose bằng phương
pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit ........................................................ 57
Bảng 3.3. Hàm lượng axit lactic tạo thành của 2 chủng bằng phương pháp HPLC ............ 58
Bảng 3.4. Đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng Y6........................................................... 59
Bảng 3.5. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với ba yếu tố và hàm lượng axit thu được
trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ............................................................................... 66
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX 7.1.5 ........... 66
Bảng 3.7. Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose ............................. 73
Bảng 3.8. Đặc điểm của các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose bằng phương
pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit ........................................................ 76

Bảng 3.9. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với 3 yếu tố và hàm lượng axit thu được
trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ............................................................................... 84
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 .......... 85
Bảng 3.11. Thành phần đường trong dịch thủy phân rơm rạ............................................... 91
Bảng 3.12. Tỉ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học trong sản phẩm lên men axit lactic
từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L. plantarum HC2 và chủng L. fermentum Y6. ....... 103

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Đồng phân quang học của axit lactic .................................................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc của lignocellulose ................................................................................... 7
Hình 1.3. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose .......................................................................... 9
Hình 1.4. Phân tử xylan và cơ chế thủy phân thành xylose................................................. 10
Hình 1.5. Các dạng của đường xylose ................................................................................ 11
Hình 1.6. Các đơn vị cơ bản của lignin .............................................................................. 12
Hình 1.7. Sơ đồ sản xuất axit lactic từ rơm rạ .................................................................... 14
Hình 1.8. Cơ chế thủy phân của cellulose .......................................................................... 16
Hình 1.9. Cơ chế thủy phân của hemicellulose .................................................................. 17
Hình 1. 10. Cơ chế lên men axit lactic từ đường xylose ................................................... 20
Hình 1. 11. Cơ chế lên men axit lactic từ đường cellobiose .............................................. 21
Hình 2.1. Sơ đồ qui trình tiền xử lý và thủy phân rơm rạ.................................................... 45
Hình 2.2. Sơ đồ qui trình thu hồi axit lactic ........................................................................ 48
Hình 3.1. Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả
năng lên men axit lactic từ đường xylose ........................................................................... 55
Hình 3.2. Hình ảnh cấy chấm điểm của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ
xylose ................................................................................................................................... 55
Hình 3.3. Hình ảnh đục lỗ thạch của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ
xylose ................................................................................................................................... 56

Hình 3.4. Hàm lượng axit tạo thành của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic
từ xylose .............................................................................................................................. 56
Hình 3.5. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y5 ............... 58
Hình 3.6. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y6 ............... 58
Hình 3.7. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng Y6 ....................................................... 59
Hình 3.8. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối chủng Y6 ............................... 60
Hình 3.9. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số
chủng Y6 ............................................................................................................................. 60
Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Y6 với các loài có quan hệ họ hàng gần ................. 61
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của
chủng L. fermentum Y6 ...................................................................................................... 62
Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose
của chủng L. fermentum Y6................................................................................................ 63

x


Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ đường xylose đến quá trình lên men axit lactic của
chủng L. fermentum Y6....................................................................................................... 64
Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose
của chủng L. fermentum Y6................................................................................................ 64
Hình 3.15. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH ban đầu ............................................ 67
Hình 3.16. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và nồng độ đường ...................................... 67
Hình 3.17. Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nồng độ đường................................ 67
Hình 3.18. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ xylose của chủng .....
L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 68
Hình 3.19. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của
chủng L. fermentum Y6 ...................................................................................................... 69
Hình 3.20. Ảnh hưởng của việc duy trì pH và không duy trì đến mức độ sử dụng đường
trong lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum Y6 ......................................... 70

Hình 3.21. Ảnh hưởng của duy trì và không duy trì pH đến sự hình thành axit và sử dụng
đường khi kết thúc quá trình lên men .................................................................................. 70
Hình 3.22. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng…………….
L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 71
Hình 3.23. Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả
năng lên men axit lactic từ đường cellobiose ...................................................................... 75
Hình 3.24. Hình ảnh cấy chấm điểm của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic
từ đường cellobiose ............................................................................................................. 75
Hình 3.25. Hình ảnh đục lỗ thạch của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ
đường cellobiose .................................................................................................................. 76
Hình 3.26. Hàm lượng axit tạo thành của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic
từ đường cellobiose ............................................................................................................. 76
Hình 3.27. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ cellobiose của chủng HC2 ..... 77
Hình 3.28. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng HC2 .................................................. 78
Hình 3.29. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối của chủng HC2 .................... 78
Hình 3.30. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số
chủng HC2 ........................................................................................................................... 78
Hình 3.31. Vị trí phân loại của chủng HC2 với các loài có quan hệ họ hàng gần............... 79
Hình 3.32. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường
cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ............................................................................ 80

xi


Hình 3.33. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ
cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................................. 81
Hình 3.34. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường cellobiose đến khả năng lên men
axit lactic của chủng L. plantarum HC2 .............................................................................. 82
Hình 3.35. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ
cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................................. 83

Hình 3.36. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic từ
cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................................ 83
Hình 3.37. Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nhiệt độ đến quá trình lên men axit
lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................... 85
Hình 3.38. Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và nhiệt độ đến quá trình lên men axit
lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................... 86
Hình 3.39. Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và pH ban đầu quá trình đến lên men
axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ....................................................... 86
Hình 3.40. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ cellobiose .............. 87
Hình 3.41. Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của
chủng L. plantarum HC2 ..................................................................................................... 87
Hình 3.42. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng ......
L. plantarum HC2 ................................................................................................................ 88
Hình 3.43. Sắc kí đồ HPLC của dịch đường thủy phân rơm rạ với các điều kiện tối ưu .... 90
Hình 3.44. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L. plantarum HC2 ... 92
Hình 3.45. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L. fermentum Y6 ..... 92
Hình 3.46. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm
rạ của hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ........................................... 94
Hình 3.47. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến quá trình lên men axit lactic của
hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ...................................................... 95
Hình 3.48. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp
chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 .................................................................... 96
Hình 3.49. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng
L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ............................................................................... 97
Hình 3.50. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng
L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ............................................................................... 98
Hình 3.51. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men bởi hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và…
L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 99
xii

Hình 3.52. Động thái quá trình lên men axit của 2 chủng L. plantarum HC2 và…………
L. fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ ....................................................................... 101
Hình 3.53. Qui trình thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men ................................ 102
Hình 3.54. Phổ HPLC mẫu axit lactic của sản phẩm lên men........................................... 103
Hình 3.55. Phổ HPLC mẫu L- axit lactic chuẩn ................................................................ 103

xiii


MỞ ĐẦU
Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng được sử dụng rộng rãi
trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm và công nghiệp hóa học.
Trong đó, hơn 70% axit sản xuất ra được ứng dụng vào trong thực phẩm và các ngành có
liên quan đến thực phẩm.
Hiện nay, 90% lượng axit lactic được sản xuất bằng quá trình lên men bởi vi khuẩn.
Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường là sản phẩm từ cây lương thực như
tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột mì,... Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này có giá
thành cao và cạnh tranh với nguồn nguyên liệu của thực phẩm. Do đó, lên men sản xuất
axit lactic từ nguồn nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm như biomass đã được tập
trung nghiên cứu. Ngoài ra, axit lactic được xác nhận là một trong số 30 chất hóa học có
khả năng được sản xuất từ biomass. Trong số các nguồn sinh khối biomass, sinh khối
lignocellulose có sẵn với số lượng lớn, phân bố rộng rãi và giá thành khá thấp. Tuy nhiên,
cellulose và hemicellulose trong lignocellulose không thể trực tiếp được sử dụng bởi vi
khuẩn lactic (LAB) để sản xuất axit lactic vì cấu trúc phức tạp của lignocellulose và thiếu
các enzyme cellulolytic trong LAB. Dịch thủy phân của lignocellulose sau khi tiền xử lý và
thủy phân chủ yếu bao gồm hỗn hợp đường glucose, cellobiose, xylose và arabinose. Như
vậy, dẫn xuất đường thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose ngoài đường glucose
còn có đường xylose và cellobiose.
Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose là một hướng

nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những làm giảm giá thành sản phẩm, góp phần
giải quyết ô nhiễm môi trường mà còn tăng hiệu quả của quá trình sản xuất axit lactic từ
vật liệu lignocellulose.
Việt Nam là nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra hàng năm rất
lớn. Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ là loại nguyên liệu có sản lượng
lớn và dễ thu gom. Ước tính, mỗi năm có khoảng 61 triệu tấn rơm rạ. Tuy nhiên, phần lớn
rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi hoặc phương thức phổ biến nhất hiện nay là đốt bỏ trên
đồng ruộng điều này gây lãng phí nguồn nguyên liệu và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng.
Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ cũng đã có những bước tiếp cận, tuy nhiên mới
chỉ dừng lại ở nguồn đường glucose thủy phân từ cellulose mà chưa tận dụng hết được các
nguồn đường khác như cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose).
Do đó, đề tài “Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân
1


rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus” đã được tiến hành nhằm khai thác
những thế mạnh của nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó tập trung vào nguyên liệu
rơm rạ- nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ
đường cellobiose và xylose.
- Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm
rạ bởi các chủng vi khuẩn đã chọn ở trên.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit
lactic từ đường cellobiose và xylose.
- Khảo sát và tối ưu các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ xylose và
cellobiose bởi các chủng được chọn.
- Khảo sát các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi
hỗn hợp chủng vi khuẩn, xác định dạng D, L axit lactic tạo thành.

Những đóng góp mới của đề tài
- Luận án phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ các sản phẩm lên men truyền thống ở
Việt Nam: L. fermentum Y6 có khả năng lên men axit lactic từ xylose và chủng L.
plantarum HC2 có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose
- Luận án nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình lên men sinh axit lactic từ
xylose và cellobiose (phân lập, tuyển chọn, định tên chủng vi khuẩn, tối ưu hóa các điều
kiện lên men axit lactic) và lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi 2 chủng đã
được lựa chọn.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Axit lactic.
1.1.1. Đặc tính hóa học của axit lactic.
Axit lactic (2-hydroxypropanoic, CH3CHCOOH) là một axit hydroxycacboxylic
xuất hiện rộng rãi nhất trong tự nhiên và được phát hiện bởi nhà hóa học Thụy điển Scheele vào năm 1780 [31].
- Công thức hoá học: C3H6O3
- Công thức tổng quát: CH3–CHOH–COOH
- Khối lượng phân tử: 90,08 g/mol
- Axit lactic không màu ở dạng lỏng, ở dạng bột hoặc chất rắn có màu từ màu trắng
đến màu vàng. Ở dạng lỏng, axit tan được trong nước và etanol. Ở dạng rắn, axit ít hòa tan
trong nước nhưng tan được trong acetone. Axit lactic có pKa = 3,86 ở 25oC, điểm sôi: 52,7
- 52,8oC đối với dạng tinh khiết L hoặc D - axit lactic và 16,4oC đối với hỗn hợp racemic
DL - axit lactic có chứa 50% của mỗi đồng phân [51].
Axit lactic được sản xuất trong cơ thể người, động vật, thực vật và vi sinh vật.
Trong cấu tạo phân tử của chúng có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân
quang học: D - axit lactic và L - axit lactic. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa
lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang
phải (D - axit lactic) và một sang trái (L - axit lactic). Do đó tính chất sinh học của chúng

hoàn toàn khác nhau. Đồng phân dạng D - axit lactic có hại cho cơ thể con người nhưng
đồng phân dạng L lại thích hợp trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm bởi vì cơ thể
con người chỉ hấp thụ loại đồng phân này [32].

L - axit lactic

D - axit lactic

Hình 1.1. Đồng phân quang học của axit lactic [51]

1.1.2. Ứng dụng của axit lactic.
Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng, được sử dụng rộng
rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm, và ngành nông nghiệp,… [31, 43,

3


83]. Trong đó, ứng dụng chính của axit lactic vẫn là thực phẩm và các ngành liên quan đến
thực phẩm (chiếm tới 85%) [103].
- Ứng dụng trong thực phẩm bao gồm [126].
+ Kiểm soát pH: Kiểm soát độ pH của sản phẩm có thể kéo dài thời hạn sử dụng.
Ngoài ra, axit lactic được sử dụng trong món salat và nước sốt để làm tăng tính axit của
sản phẩm.
+ Tạo mùi: Tăng cường và bảo vệ hương vị thịt. Tạo hương vị chua nhẹ trong bánh
kẹo, nước giải khát, bia, súp, các sản phẩm sữa,…
+ Tác dụng kháng khuẩn: Kiểm soát vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli,
Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes trong thực phẩm.
+ Tác nhân trong các sản phẩm muối: Ô-liu xanh, dưa chuột và những sản phẩm
khác thường đóng gói trong dung dịch muối, axit lactic và nước. Axit lactic đóng vai trò
như một chất bảo quản và cải thiện độ trong của dung dịch ngâm muối và hương vị của sản

phẩm. Hỗn hợp của axit axetic và axit lactic trong các sản phẩm muối chua: dưa chuột bao
tử, hành muối,… tạo ra mùi và vị nhẹ hơn, cải thiện sự ổn định của vi sinh vật. Muối canxi
lactate được ghi nhận là muối có tác dụng làm săn chắc sản phẩm, đã được sử dụng cho các
loại trái cây và rau đóng hộp.
+ Tác nhân tạo nhũ tương: Este của axit lactic và axit béo mạch dài có tác dụng tạo
hệ nhũ tương đặc biệt trong các sản phẩm bánh qui.
- Ứng dụng trong y học.
Trong phẫu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng loại vật liệu là purasord,
được sử dụng như những đinh ghim, gắn các phần xương lại với nhau, khi xương định hình
purasord sẽ tự tiêu hủy. Axit lactic có khả năng trùng hợp thành polymer là polylactic axit
(PLA). PLA được dùng làm chỉ tự tiêu, nó cũng được dùng làm thiết bị cố định các vết gãy
xương nhỏ và sau đó nó tự phân hủy. Nhờ khả năng này của PLA mà chúng đang được
nghiên cứu để có thể thay thế các polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ [126].
- Ứng dụng làm mỹ phẩm.
Các muối lactat kim loại (như lactat natri) được sử dụng trong thành phần của một
số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ phẩm này có tác
dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [126].
- Ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa học.
Trong những năm gần đây, axit lactic thu hút được sự quan tâm rất lớn của các nhà
nghiên cứu do nó là nguyên liệu cho sản xuất polylactic axit (PLA). PLA là một polyeste
nhiệt dẻo, nó có thể quay để tạo thành sợi, tạo màng cứng, màng bao gói chịu nhiệt và cho
4


vào khuôn đúc. PLA là thành phần chính trong bao bì thực phẩm ( bao bì đựng salat, bao bì
gói kẹo, chai,…). Năm 2008, khối lượng PLA đạt 0,26 triệu tấn/năm, ước tính vào năm
2020 sẽ đạt 15 triệu tấn [53].
Trong công nghiệp nhẹ: Axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn,
vecni, nhuộm, thuộc da,…
1.1.3. Các phƣơng pháp sản xuất axit lactic.

1.1.3.1. Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học.
Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học dựa trên lactonitrile, bao gồm các
bước sau [22]:
- Bổ sung hydrogen cyanide (HCN) vào dung dịch acetaldehyde (trong môi trường
kiềm) để tạo ra lactonitrile. Phản ứng này xảy ra trong pha lỏng ở áp suất cao. Lactonitrile
thô được thu lại và tinh sạch bởi quá trình chưng cất.
CH3COONa

+

Acetaldehit

HCN

CH3CHOHCN

Hydrogencianua

Lactonitrile

- Thủy phân lactonitrile bằng HCl hoặc H2SO4 tạo ra axit lactic cùng với muối
amonium.
CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4
Lactonitrile

CH3CHOHCOOH + 1/2(NH4)2SO4O

Axit sulphuric

Axit lactic

Muối ammonium

- Este hóa axit lactic với methanol để tạo ra methyl lactate. Methyl lactate được thu
và tinh sạch bằng chưng cất.
CH3CHOHCOOH

+

Axit lactic

CH3OH

CH3CHOHCOOCH3

Methanol

+

H2O

Methyl lactate

- Thủy phân methyl lactate bằng nước dưới xúc tác của axit để tạo ra axit lactic và
methanol. Methanol được tạo ra từ quá trình trên lại được quay vòng cho quá trình tiếp sau.
CH3CHOCOCH3

+

H2O

CH3CHOHCOOH

Methyl lactate

Axit lactic

+

CH3OH
Methanol

Sản xuất axit lactic theo phương pháp tổng hợp hóa học xuất phát từ nguồn nhiên
liệu dầu mỏ, tuy nhiên nguồn nguyên liệu này đang ngày một cạn kiệt. Ngoài ra, sản xuất
axit lactic bằng phương pháp hóa học tạo ra hỗn hợp racemix DL - axit lactic, quá trình
phân tách hai đồng phân đòi hỏi chi phí lớn [43].
1.1.3.2. Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men.
Lên men lactic là quá trình ôxy hóa- khử sinh học nhờ vi khuẩn lactic. Qua quá
trình lên men này, một lượng đáng kể axit lactic được tích tụ trong môi trường làm giảm
mạnh pH của môi trường, tạo ra hiệu ứng ức chế mạnh mẽ các vi sinh vật khác. Vì vậy, lên
5


men bởi vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi như một phương pháp để bảo quản thực
phẩm và quá trình này thường không có hoặc cần ít nhiệt [22].
Nguồn carbon cho sản xuất axit lactic theo phương pháp lên men có thể là đường ở
dạng tinh khiết như glucose, saccarose, lactose,… hoặc các vật liệu chứa đường như rỉ
đường, bã mía, bã sắn, tinh bột và nguyên liệu giàu tinh bột từ khoai tây, khoai mì, lúa mì,
lúa mạch, cà rốt [14, 88]. Lên men sản xuất axit lactic là một phương pháp thân thiện với
môi trường và axit tạo ra có độ tinh khiết cao [37]. Tuy nhiên, các loại nguyên liệu tinh bột

và các loại đường tinh khiết lại có giá thành cao, điều đó làm tăng giá thành sản xuất axit,
đây chính là một trong những hạn chế khi so sánh sản xuất axit lactic bằng phương pháp
lên men với phương pháp tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học [32]. Do đó, việc
nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu giá rẻ là hướng đi cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn.
Gần đây, quá trình lên men axit lactic từ nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm,
chẳng hạn như sinh khối tái tạo đã được tập trung nghiên cứu, do chúng không có bất kì tác
động nào tới chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người và giá thành thấp.

1.2. Lignocellulose.
Biomass là nguồn nguyên liệu tái tạo, bao gồm tất cả các vật liệu có nguồn gốc sinh
học như vật liệu thực vật, cây trồng nông nghiệp và thậm chí cả phế thải động vật. Biomass
là một nguồn nguyên liệu không đồng nhất, có thành phần hóa học phức tạp. Do có đặc
tính phong phú về tự nhiên, phát triển bền vững và giá thành thấp nên biomass là nguồn
thay thế đầy tiềm năng cho các nguồn nguyên liệu không có khả năng tái tạo (nguồn vật
liệu hóa thạch) được sử dụng trong sản xuất các chất hóa học [21]. Trái đất là một kho sinh
khối khổng lồ bao gồm 1800 × 109 tấn ở trên mặt đất và 4 × 109 tấn ở dưới đại dương
[136]. Vì vậy, biomass có tiềm năng to lớn cho sản xuất các chất hóa học trong đó có axit
lactic.
Lignocellulose là dạng vật liệu hữu cơ có nguồn gốc sinh học, đại diện cho nguồn
nguyên liệu phong phú nhất trong biomass nhưng vẫn chưa được sử dụng rộng rãi.
Lignocellulose chiếm hơn 90% sinh khối thực vật trên trái đất. Hàng năm, ước tính 200 ×
109 tấn sinh khối thực vật được tạo ra, trong đó 8 - 20× 109 tấn có khả năng sử dụng [66].
Lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp và nguồn rừng đại diện cho nguồn nguyên
liệu có khả năng tái tạo, giá thành thấp và có nguồn carbohydrate sẵn có với hàm lượng
polysaccharide cao [104, 133].
Thành phần hóa học của lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp bao gồm
khoảng 10% - 25% lignin, 20% - 30% hemicellulose và 40% - 50% cellulose [102].
6

Hemicellulose và cellulose là những phân đoạn giàu đường và những đường này có thế lên
men tạo ra các sản phẩm có giá trị như ethanol, phụ gia thực phẩm, các chất hóa học,
enzyme,…[21].

Hình 1.2. Cấu trúc của lignocellulose [21]

Nói chung, tỉ lệ các thành phần hóa học của lignocellulose cao hay thấp phụ thuộc
vào loại thực vật, điều kiện canh tác,…. Lignocellulose có một cấu trúc bên trong phức tạp
và bao gồm số lượng lớn các thành phần chính cũng có cấu trúc phức tạp. Bảng 1.1 cho
thấy phần trăm các thành phần hóa học trong các nguyên liệu lignocellulose khác nhau.

7


Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong các nguồn lignocellulose [47]

Nguồn

Lignin

Hemicellulose

Cellulose

lignocellulose

(%)

(%)

(%)

Bã mía

20

25

42

Lúa miến ngọt

21

27

45

Gỗ cứng

18 - 25

24 – 40

40 – 55

Gỗ mềm

25 - 35

25 – 35

45 – 50

Lõi ngô

15

35

45

Vỏ trấu

18

24

32,1

Vỏ lạc

30 - 40

25 – 30

25 – 30

Giấy báo

18 - 30

25 – 40

40 – 55

Cỏ

10 - 30

25 – 50

25 – 40

Vỏ trấu lúa mì

16 - 21

26 – 32

29 – 35

18

24

32,1

Rơm rạ

1.2.1. Thành phần hóa học của lignocellulose.
1.2.1.1. Cellulose.
Cellulose là nguồn tài nguyên hữu cơ tái tạo phong phú nhất trên trái đất, phổ biến
nhất trong thực vật bậc cao, tảo biển và các nguồn sinh khối khác. Hàng năm, tổng lượng
của cellulose lên tới hàng tỷ tấn, do đó nếu thu nhận và khai thác sử dụng được thì
cellulose sẽ có tiềm năng kinh tế hết sức to lớn. Cellulose là thành phần chính của các tế
bào thực vật. Do cấu trúc và thành phần của thành tế bào thực vật khác nhau nên hàm
lượng cellulose trong các loại thực vật khác nhau là khác nhau, chẳng hạn cellulose chiếm
khoảng 90% trong sợi bông tự nhiên, 40 -50% trong gỗ, 40 -50% trong bã mía và khoảng
35 - 40% trong rơm lúa mì và rơm rạ. Cellulose gồm những đơn vị (1, 4) - Dglucopyranose gắn bởi liên kết β1,4 - glycosidic, với trọng lượng phân tử trung bình
khoảng 100.000 Dalton. Công thức hóa học của cellulose là (C6H10O5)n (n, được gọi là
mức độ trùng hợp (DP), đại diện cho số lượng các nhóm glucose, từ hàng trăm đến hàng
ngàn hoặc thậm chí hàng chục ngàn). Cellulose gồm các đơn vị D - glucose lặp đi lặp lại (
hình 1.3) và đơn vị lặp lại của cellulose được gọi là cellobiose.
8


Hình 1.3. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose [146]

Cellobiose là disaccharide được hình thành bởi 2 phân tử β - D - glucose liên kết
với nhau bởi mối liên kết β -1,4 - glycosodic. Cellobiose là đơn vị cấu trúc của các phân tử
cellulose và cũng là sản phẩm chính trong quá trình thủy phân cellulose. Tuy nhiên nồng
độ cellobiose cao có thể ức chế phản ứng thủy phân của cellulase [144].
Công thức hóa học: C12H22O11
Công thức tổng quát: [HOCH2CHO(CHOH)3]2O
Tính chất của cellobiose
Tính chất vật lý
- Khối lượng phân tử: 342,3 g/mol.
- Trạng thái: Cellobiose ở dạng kết tinh là bột màu trắng, không mùi, vị ngọt nhẹ.
- Khối lượng riêng: 1,768 g/cm3 (20oC).

- Nhiệt độ nóng chảy: 203,5oC.
- Độ hòa tan trong nước: 12g/ 100ml.
- Tan ít trong rượu, không tan trong ete, cloroform.
Tính chất hóa học
- Tính khử: Khả năng nhường điện tử của nhóm –OH và –CO.
- Tính oxy - hóa: Dưới tác nhân khử, nhóm CHO hay –CO bị khử thành polyalcol.
- Phản ứng tạo liên kết glycoside: Nhóm –OH glycoside của đường đơn tham gia
phản ứng với OH glycoside/alcol tạo este tương ứng.
Sinh khối cellulose đã thu hút được sự chú ý trên toàn thế giới như là một nguồn
tài nguyên có thể được chuyển đổi thành các sản phẩm có ích [102]. Ngoài ra, sinh khối
cellulose là nguồn nguyên liệu phong phú, giá thành rẻ, có khả năng tái tạo, dễ dàng có
sẵn nguồn đường và có khả năng đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn của thị trường về nguồn
nguyên liệu sản xuất axit lactic [130]. Vì vậy, cellulose đã được sử dụng như một nguồn
nguyên liệu tiềm năng cho quá trình lên men axit lactic.
9


1.2.1.2. Hemicellulose.
Hemicellulose là polymer phổ biến thứ 2 (sau cellulose), chiếm từ 20 - 30% trong
sinh khối lignocellulose, có trọng lượng phân tử trung bình < 30.000 Dalton.
Hemicellulose là một polymer dị thể có độ phân nhánh cao, ngắn, có thể tồn tại ở bốn loại
cấu trúc là xylan, mannan, β-glucan với hỗn hợp các mối liên kết và xyloglucan. Bốn nhóm
này có sự thay đổi về cấu trúc trong từng loại chuỗi, được phân theo vị trí hay loại liên kết
của glycosid trong mạng lưới phân tử. Hemicellulose được thủy phân dễ dàng hơn so với
cellulose vì tính chất phân nhánh và vô định hình của nó. Các đường pentose và hexose
trong hemicellulose tạo thành một cấu trúc hoạt động lỏng lẻo, rất ưa nước như một chất
keo giữa cellulose và lignin [42, 134].
Xylan là một heteropolymer được tạo thành bởi một chuỗi các nhóm xylose liên kết
với nhau qua liên kết β-1,4-glycosidic và phân nhánh bởi các chuỗi carbohydrate ngắn.
Xylan chiếm phần lớn khối lượng trong hemicellulose. Trong quá trình xử lý

lignocellulose, xylan ít bị phá vỡ cấu trúc hơn nên điều này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả
thu hồi đường sau quá trình thủy phân. Sau thủy phân xylan người ta thu được monomer là
đường xylose [35].

Hình 1.4. Phân tử xylan và cơ chế thủy phân thành xylose [35]

Xylose được phân loại là một monosaccharide của nhóm aldopentose, có nghĩa là
nó có năm nguyên tử carbon và một nhóm formyl. Xylose là đường chủ yếu của
hemicellulose trong gỗ cứng và phế thải của nông nghiệp [111].
Công thức phân tử: C5H10O5
Công thức tổng quát: HOCH2(CH(OH))3CHO
Giống như hầu hết các loại đường, xylose có nhiều đồng phân cấu trúc khác nhau.
Với nhóm carbonyl tự do, xylose là một loại đường khử .
- Trong tự nhiên thường có 2 dạng: Mạch vòng và mạch thẳng. Đối với dạng mạch
thẳng, người ta chia thành 2 dạng đồng phân: Đồng phân dạng D - xylose (nhóm OH của
10


carbon bất đối xứng ở phía bên phải) và đồng phân dạng L - xylose (nhóm OH của carbon
bất đối xứng ở phía bên trái).

D - xylose

L - xylose

Xylose dạng mạch vòng

Hình 1.5. Các dạng của đường xylose [111]

Tính chất của xylose

Tính chất vật lý
- Khối lượng phân tử: 150,13 g/mol.
- Trạng thái: Xylose ở dạng kết tinh là bột màu trắng, có vị ngọt.
- Khối lượng riêng: 1,525 g/cm3 (20oC).
- Nhiệt độ nóng chảy: 144 -145oC.
- Góc cực quay: 22,5o (CHCl3).
- Tan trong nước và cồn.
Tính chất hóa học
- Tính khử: Khả năng nhường điện tử của nhóm –OH và –CO.
- Tính oxy-hóa: Dưới tác nhân khử, nhóm CHO hay –CO bị khử thành polyalcol.
- Phản ứng tạo liên kết Glycoside: Nhóm –OH glycoside của đường đơn tham gia
phản ứng với OH glycoside/alcol tạo ester tương ứng.
1.2.1.3. Lignin.
Lignin là một trong các polymer hữu cơ có nguồn gốc sinh học phổ biến nhất trong
tự nhiên. Lignin là hợp chất cao phân tử có cấu trúc mạng không gian và không có cấu tạo
hóa học nhất định [111].
Lignin là một phức hợp gồm các đơn vị phenylpropan phức tạp tuyến tính và liên
kết ngẫu nhiên; ba monomer chính là rượu p-coumaryl, rượu coniferyl và rượu sinapyl
[131].

11


Hình 1.6. Các đơn vị cơ bản của lignin [131]

Lignin liên kết với hemicellulose bằng liên kết hóa trị nhưng không liên kết trực
tiếp với cellulose. Lignin có đặc tính polyphenol nên có tính kị nước và sát khuẩn, là thành
phần gây cản trở quá trình thủy phân bằng enzyme. Lignin không được vi sinh vật sử dụng
như một cơ chất để lên men và ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng enzyme của
lignocellulose [111]. Chính vì vậy, trong quá trình tiền xử lý sinh khối lignocellulose nên

lựa chọn phương pháp hiệu quả nhất để loại bỏ lignin.
1.2.2. Rơm rạ.
Rơm rạ là một sản phẩm phụ của sản xuất lúa gạo và cũng là tài nguyên sinh học có
tiềm năng nhất. Rơm rạ là một trong những vật liệu lignocellulose phong phú trên thế giới.
Theo số liệu thống kê của FAO, năm 2014, sản lượng lúa trên thế giới đạt khoảng 746 triệu
tấn, theo tính toán với các giống lúa đang canh tác hiện nay thì 1 tấn lúa sẽ thu được 1 - 1,5
tấn rơm rạ. Do đó, lượng rơm rạ trên thế giới có thể lên tới 746 - 1119 triệu tấn. Việt Nam
là một nước nông nghiệp có sản lượng lúa lớn, theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát
triển Nông thôn, năm 2014 sản lượng lúa đạt khoảng 45 triệu tấn, tương ứng với khoảng 45
- 67,5 triệu tấn rơm rạ.
Như vậy, hàng năm lượng rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam là khá lớn. Tuy
nhiên, thực tế cho thấy không chỉ trên thế giới mà cả ở Việt Nam, phần lớn rơm rạ được
thải bỏ khi còn tươi. Phương thức phổ biến nhất để xử lý rơm rạ đó là đốt bỏ trên đồng
ruộng, điều đó sẽ lãng phí tài nguyên, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và ảnh hưởng
đến đời sống sinh hoạt của nhân dân [20].
Thành phần chính của rơm rạ chủ yếu chứa cellulose 32 - 47%, hemicellulose 1927%, lignin 5-24% và chất tro 10-18% [20]. Rơm rạ được tạo thành từ các carbohydrate
phức tạp, phần carbohydrate chiếm khoảng 60% trọng lượng [127]. Thành phần
carbohydrate trong rơm rạ bao gồm: glucose 41-43,4%, xylose 14,8 - 20,2%, arabinose
2,7- 4,5%, mannose 1,8% và galactose 0,4% [70, 97]. Tuy nhiên, các phương pháp tiền
12


xử lý khác nhau và đường hóa bằng enzyme khác nhau sẽ thu được hỗn hợp đường khác
nhau về thành phần và tỉ lệ.
Tóm lại, sử dụng rơm rạ làm nguyên liệu cho sản xuất axit lactic không những giải
quyết được vấn đề tính bền vững lâu dài của nguồn nguyên liệu mà còn không có bất kì tác
động nào tới chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người. Ngoài ra, còn giải quyết được vấn
đề về môi trường và xã hội.

1.3. Lên men axit lactic từ rơm rạ.

Sử dụng lignocellulose trong đó có rơm rạ để sản xuất axit lactic là một con đường
đầy hứa hẹn. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển đổi lignocellulose thành axit lactic vẫn phải đối
mặt những thách thức đáng kể. Quá trình sinh hóa để biến đổi cấu trúc sinh khối thực vật
thành các loại đường như: glucose, cellobiose, xylose, arabinose và mannose cần phải
được thiết kế, tính toán kỹ lưỡng. Những đường này có thể lên men thành axit lactic bởi
chủng vi sinh vật tự nhiên hoặc tái tổ hợp [7]. Quá trình chuyển hóa để sản xuất axit lactic
từ rơm rạ bao gồm 4 bước chính (Hình 1.7).
- Tiền xử lý: Mục đích của quá trình tiền xử lý là bẻ gãy các khối cấu trúc của thực
vật thành những cấu trúc nhỏ hơn thuận lợi cho bước xử lý tiếp theo.
- Thủy phân bằng enzyme: Mục đích của quá trình là cắt các cấu trúc polymer của
thực vật thành những cấu trúc nhỏ hơn cho quá trình lên men như: glucose, cellobiose và
xylose, đây là sản phẩm chính của quá trình thủy phân.
- Lên men: Các loại đường glucose, cellobiose và xylose thu được từ quá trình thủy
phân sẽ lên men để tạo thành axit lactic nhờ vi khuẩn lactic
- Thu hồi và tinh sạch sản phẩm: Quá trình thu hồi và tinh sạch axit lactic theo
những phương pháp đã được ứng dụng và thương mại hóa.
1.3.1. Quá trình tiền xử lý .
Mục tiêu chính của tiền xử lý là để loại bỏ lignin, tách cellulose và hemicellulose
thành những phần riêng biệt, tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, làm tăng độ xốp của vật liệu
mà vẫn giữ được phần lớn carbohydrate cho quá trình thủy phân bằng enzyme [111].
Tiền xử lý rơm rạ bao gồm các quá trình tiền xử lý bằng các tác nhân khác nhau:
Phương pháp vật lý (xay, nghiền), tiền xử lý bằng hóa chất (kiềm, axit loãng, chất oxi hóa
và các dung môi hữu cơ), tiền xử lý hóa lí (nổ hơi nước / thủy phân cao áp, nhiệt thủy phân
và oxy hóa ướt) và phương pháp sinh học (sử dụng nấm mục nâu, nấm mục trắng, vi
nấm)….Tuy nhiên một số phương pháp tiền xử lý lại có nhược điểm: Phương pháp vật lí
và hóa lí (nghiền, nổ hơi,…) tiêu hao năng lượng cao, yêu cầu phải có thiết bị chuyên dụng
13


và năng suất thấp; phương pháp sinh học hạn chế ở điểm thời gian kéo dài và khó thực

hiện ở qui mô công nghiệp, ngoài ra một số phương pháp tiên tiến như tiền xử lý bằng chất
lỏng ion, nước siêu tới hạn,… thì không có tính khả thi. Những phương pháp thường gặp
nhất là các qui trình tiền xử lý kết hợp hai hay nhiều tác nhân với nhau như vật lí - hóa học,
vật lí - sinh học,… nhưng hiệu quả còn chưa được cao [100]. Tiền xử lý bằng phương pháp
hóa học đã được chứng minh là phương pháp hiệu quả cho việc tách các chất vô cơ, lignin,
các chất trích ly có trong rơm rạ và cải thiện bề mặt của rơm rạ, góp phần thúc đẩy quá
trình thủy phân bằng enzyme [46].
Lignocellulose
(Rơm rạ)

Tiền xử lý vật lí, hóa học

Hemicellulose

Cellulose

Lignin

Thủy phân bằng
enzyme
Xylose, cellobiose, glucose

Vi khuẩn
Quá trình lên men axit lactic

Thu hồi, tinh chế

Axit lactic

Hình 1.7. Sơ đồ sản xuất axit lactic từ rơm rạ [7]

14