Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn lactobacillus (tt)

-1-

MỞ ĐẦU
Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng, được
sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ
phẩm và công nghiệp hóa học. Trong đó, hơn 70% axit lactic sản xuất ra
được ứng dụng vào trong thực phẩm và các ngành có liên quan đến thực
phẩm.
Hiện nay, 90% lượng axit lactic được sản xuất bằng quá trình lên
men bởi vi khuẩn. Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường
là sản phẩm từ cây lương thực như tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột
mì,... Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này có giá thành cao và cạnh tranh với
nguồn nguyên liệu của thực phẩm. Do đó, lên men sản xuất axit lactic từ
nguồn nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm như biomass đã được
tập trung nghiên cứu. Ngoài ra, axit lactic được xác nhận là một trong số
30 chất hóa học có khả năng được sản xuất từ biomass. Trong số các
nguồn sinh khối biomass, sinh khối lignocellulose có sẵn với số lượng lớn,
phân bố rộng rãi và giá thành khá thấp. Tuy nhiên, cellulose và
hemicellulose trong lignocellulose không thể trực tiếp được sử dụng bởi vi
khuẩn lactic (LAB) để sản xuất axit lactic vì cấu trúc phức tạp của
lignocellulose và thiếu các enzyme cellulolytic trong LAB. Dịch thủy phân
của lignocellulose sau khi tiền xử lý và thủy phân chủ yếu bao gồm hỗn
hợp đường glucose, cellobiose, xylose và arabinose. Như vậy, dẫn xuất
đường thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose ngoài đường glucose
còn có đường xylose và cellobiose.
Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose là
một hướng nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những làm giảm giá
thành sản phẩm, góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà còn tăng hiệu
quả của quá trình sản xuất axit lactic từ vật liệu lignocellulose.
Việt Nam là nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra
hàng năm rất lớn. Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ là

loại nguyên liệu có sản lượng lớn và dễ thu gom. Ước tính, mỗi năm có
khoảng 61 triệu tấn rơm rạ. Tuy nhiên, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi
còn tươi hoặc phương thức phổ biến nhất hiện nay là đốt bỏ trên đồng
ruộng điều này gây lãng phí nguồn nguyên liệu và ô nhiễm môi trường


-2-

nghiêm trọng. Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ cũng đã có những
bước tiếp cận, tuy nhiên mới chỉ dừng lại ở nguồn đường glucose thủy
phân từ cellulose mà chưa tận dụng hết được các nguồn đường khác như
cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose). Do đó,
đề tài “Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy
phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus” đã được tiến
hành nhằm khai thác những thế mạnh của nguồn nguyên liệu
lignocellulose trong đó tập trung vào nguyên liệu rơm rạ- nguồn phế phụ
phẩm nông nghiệp.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men
axit lactic từ đường cellobiose và xylose.
- Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch
thủy phân rơm rạ bởi các chủng vi khuẩn đã chọn ở trên.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng
lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose.
- Khảo sát và tối ưu các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ
xylose và cellobiose bởi các chủng được chọn.
- Khảo sát các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ dịch thủy
phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng vi khuẩn, xác định dạng D, L axit lactic
tạo thành.

Những đóng góp mới của đề tài
- Luận án phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ các sản phẩm lên men
truyền thống ở Việt Nam: L. fermentum Y6 có khả năng lên men axit lactic
từ xylose và chủng L. plantarum HC2 có khả năng lên men axit lactic từ
đường cellobiose
- Luận án nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình lên men sinh
axit lactic từ xylose và cellobiose (phân lập, tuyển chọn, định tên chủng vi
khuẩn, tối ưu hóa các điều kiện lên men axit lactic) và lên men axit lactic
từ dịch thủy phân rơm rạ bởi 2 chủng đã được lựa chọn.
Bố cục của luận án


-3-

Luận án được trình bày trong 131 trang: Mở đầu (2 trang), tổng quan
tài liệu (33 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết quả
và thảo luận (51 trang với 21 bảng, 68 hình và sơ đồ), kết luận và kiến
nghị (2 trang), danh mục các công trình đã công bố (1 trang), tài liệu tham
khảo (14 trang với 4 tài liệu tiếng Việt và 142 tài liệu tiếng Anh) và phụ
lục (9 trang).
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
Tổng quan các vấn đề nghiên cứu của luận án được trình bày chi tiết
về các phần:
1.1. Axit lactic
1.1.1. Đặc tính hóa học của axit lactic
1.1.2. Ứng dụng của axit lactic
1.1.3. Các phương pháp sản xuất axit lactic
1.2. Lignocellulose
1.2.1. Thành phần hóa học của lignocellulose
1.2.2. Rơm rạ

1.3. Lên men axit lactic từ rơm rạ
1.3.1. Quá trình tiền xử lý
1.3.2. Quá trình thủy phân
1.3.3. Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và
dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic
1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và
dịch thủy phân rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Mẫu phân lập: Các mẫu từ nguồn thực phẩm lên men truyền thống
từ các địa bàn khác nhau như: Cà muối chua, dưa muối chua , dưa bắp cải
muối, sung muối, măng chua, hành muối, bã dong giềng, dạ dày bò. Các
mẫu được thu thập từ các địa bàn Hà Nội, Sơn Tây.
- Rơm rạ: Rơm rạ Khang Dân vụ đông, hè thu gom vào các vụ năm
2014, 2015 tại Hoài Đức, Hà Nội.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh và sinh học phân tử


-4-

2.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn chủng sinh axit lactic từ đường xylose và
cellobiose (Bergey D.H. và cộng sự (1994), Le.T.B. và cộng sự (1999),
Vamanu E. và cộng sự (2005), Bevilacqua A.E. và cộng sự (1989)).
2.2.1.2. Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí và sinh hóa của chủng vi
khuẩn được chọn(Bergey D.H. và cộng sự (1994)).
2.2.1.3. Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử
2.2.1.4. Kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2
2.2.2. Phƣơng pháp lên men
Lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân

rơm rạ được tiến hành như sau:
- Lên men axit lactic từ đường xylose và cellobiose: Quá trình lên
men axit lactic được tiến hành như sau: Bình thủy tinh 200 ml nút cao su
chứa 150ml môi trường YE - xylose hoặc YE - cellobiose, tỉ lệ cấp giống,
nồng độ đường, nhiệt độ, pH ban đầu, tốc độ lắc là các yếu tố được thay
đổi theo từng thí nghiệm khảo sát, lên men thực hiện trong 120 giờ. Sau
đó, thu dịch và đem xác định lượng axit tổng tạo thành và phân tích lượng
axit lactic tạo thành bằng phương pháp HPLC.
- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ qui mô 200ml: Bình
thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường YE sử dụng đường từ
dịch thủy phân rơm rạ (cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l và xylose 8,16
g/l), điều kiện: Duy trì pH 6,2 bằng NaOH 2N, lượng giống cấp 10% theo
thể tích trong đó tỉ lệ L. plantarum HC2 : L. fermentum Y6, nhiệt độ, tốc
độ lắc, nồng độ đường và nồng độ cao nấm men thay đổi theo từng thí
nghiệm khảo sát.
- Lên men axit lactic qui mô 2 lít. Thiết bị lên men 2 lít chứa 1500 ml
môi trường YE - dịch thủy phân rơm rạ trong đó hàm lượng đường
(cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l và xylose 8,16 g/l), hàm lượng cao
nấm men 3 g/l, pH 6,2 được duy trì bằng NaOH 2N, tỉ lệ giống cấp 10%
theo thể tích trong đó tỉ lệ L. plantarum HC2 : L. fermentum Y6 bằng 2:1;
nhiệt độ 37oC. Lên men diễn ra trong 48 giờ, canh trường thu được sẽ xác
định lượng axit lactic tạo thành và lượng đường dư.
Xác định hiệu suất lên men axit lactic
Hiệu suất lên men = (A/D) × 100


-5-

Trong đó: A: Lượng axit lactic thu được sau quá trình lên men (g/l);
D: Lượng đường tiêu thụ trong quá trình lên men (g/l).

2.2.3. Phƣơng pháp hóa lí - sinh
2.2.3.1. Xác định đường khử (Miller G.L. và cộng sự (1996)).
2.2.3.2. Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner (Vamanu E. và cộng
sự (2005)).
2.2.3.3. Xác định hàm lượng axit lactic, nồng độ đường trong dịch lên men
theo phương pháp HPLC.
2.2.3.4. Phương pháp tiền xử lý rơm rạ bằng kiểm( NaOH) theo phương
pháp nấu kín (Nguyen.T.M.P và cộng sự (2015)).
2.2.3.5. Phương pháp thủy phân rơm rạ bằng hỗn hợp enzyme thương
phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic® Htec2 (Nguyen.T.M.P và cộng sự (2015)).
2.2.3.6. Xác định dạng D,L axit lactic.
Thu hồi và tinh sạch axit lactic theo phương pháp truyền thống có cải
tiến (Vũ Thị Thuận và cộng sự (2012)).
Phương pháp hiệu quả để xác định dạng D, L axit lactic đó là đo góc
quay cực của hỗn hợp đồng phân đó. Các mẫu được đo bằng máy quang
phổ kế phân cực Jasco - j - 710 - spectropolarimeter, cách đo theo TCVN
8446 - 2010.
2.2.3.7. Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong lên men axit lactic
từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng đã
chọn ở trên
Đối với quá trình lên men axit lactic của chủng L. fermentum Y6 từ
xylose với nhiệt độ ở các mức 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 45oC. pH ban
đầu bằng (4,5; 5; 5,5;6; 6,5; 7; 7,5); nồng độ đường xylose (5 g/l; 10g/l; 15
g/l; 20 g/l; 25 g/l); tỉ lệ cấp giống( 5%; 10%; 15%; 20%). Nghiên cứu ảnh
hưởng của tốc độ lắc và duy trì pH ở điều kiện tối ưu.
Đối với quá trình lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2 từ
cellobiose với nhiệt độ ở các mức 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 45oC. pH ban
đầu bằng (4,5; 5; 5,5;6; 6,5; 7; 7,5); nồng độ đường cellobiose (5 g/l; 10g/l;
15 g/l; 20 g/l; 25 g/l); tỉ lệ cấp giống (5%; 10%; 15%; 20%), tốc độ lắc 0;
50; 100; 150 vòng/phút. Khảo sát ảnh hưởng của duy trì pH và lắc ở điều

kiện tối ưu.


-6-

Đối với quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng L. fermentum
Y6 và L. plantarum HC2 từ dịch thủy phân rơm rạ: Nhiệt độ khảo sát ở các
mức 33oC; 35oC; 37oC và 39oC. Nồng độ đường dịch thủy phân (10 g/l; 20
g/l; 30 g/l; 38 g/l; 76 g/l); tỉ lệ cấp giống 10% (HC2 : Y6 = 1:1; 2:1; 3:1;
4:1), tốc độ lắc 0; 50, 100; 150; 200 vòng/phút. pH 6,2 duy trì bằng NaOH
2N.
Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic theo phương pháp bề mặt đáp
ứng và quy hoạch Box-Benken, sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15.
Ma trận thực nghiệm bao gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy của 3 yếu tố
khảo sát là nhiệt độ (30 – 44oC), pH (4,5 – 7,5), nồng độ đường cellobiose
và xylose (5 – 15 g/l).
2.2.3.8. Phương pháp thống kê
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình.
Kết quả được xử lý thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose
3.1.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng
lên men axit lactic từ đƣờng xylose
3.1.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit
lactic từ đường xylose
Từ 20 mẫu sản phẩm lên men lấy từ các nguồn khác nhau trên địa
bàn Hà Nội đã phân lập được 26 chủng trên môi trường YE - xylose agar
có bổ sung CaCO3. Quan sát vòng phân giải D1 nhận thấy rằng cả 26
chủng đều có khả năng sinh axit, tuy nhiên chỉ có 9 chủng: Y1, Y5, Y6,
Y7, MC2, MC5, DC3, HX3, HX10 có tỉ lệ D1/d1 ≥ 3. Vì vậy, 9 chủng vi

khuẩn này được lựa chọn để tiến hành các tuyển chọn tiếp theo.
Tiếp tục tuyển chọn chủng có khả năng sinh axit lactic cao nhất từ 9
chủng trên theo phương pháp định tính axit lactic bằng thuốc thử
Uffelman, phương pháp cấy chấm điểm, đục lỗ thạch và định lượng axit
bằng NaOH 0,05N chọn ra 2 chủng Y5, Y6 có khả năng sinh axit cao
(bảng 3.2) và tiến hành xác định khả năng sinh axit lactic của 2 chủng
bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC (hình 3.5 và hình 3.6). Kết


-7-

quả chọn chủng Y6 cho hiệu suất sinh axit lactic đạt 56 % cao hơn chủng
Y5( 54%). Do đó, chủng Y6 được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.2. Đặc điểm các chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường
xylose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit
S
T Kí hiệu
T
1

Y1

2

Y5

3

Y6

4

Y7

5

MC2

6

MC5

7

HX3

8

HX10

9

DC3

Đặc điểm hình thái khuẩn
lạc
Khuẩn lạc tròn, kích thước
từ 1,0- 1,4 mm, bề mặt
trơn, nhẵn bong, hơi nhầy,
trắng trong, không tâm

Khuẩn lạc tròn có kích
thƣớc từ 0,6 – 0,8 mm, bề
mặt trơn, nhẵn bóng,
không mép, màu trắng
đục
Khuẩn lạc tròn, kích
thƣớc từ 0,8-1,1 mm,
không mép, bề mặt trơn,
nhẵn bóng, màu trắng
đục
Khuẩn lạc to tròn kích
thước từ 1,5 – 1,8 mm,
trắng đục, nhày
Khuẩn lạc to, viền răng
cưa, trắng đục
Trắng ngả vàng, tròn, trơn,
nhẵn
Tròn đều, trắng đục, nhẵn
Trắng đục, khuẩn lạc to,
tròn đều
Tròn, có tâm, màu trắng
sáng, bóng

D1/d1

D2 – d2

Lượng axit
thu được sau
96 giờ (g/l)

4,0

5,0

5,21

4,3

5,5

5,78

4,5

6,5

6

3,0

4,0

4,74

4,0

3,8

4,8

4,2

4,8

5,2

4,5

5,6

5,6

4,1

5,0

5,3

3,0

4,1

4,8

(D1: đường kính vòng phân giải (mm), d1: đường kính khuẩn lạc (mm))
(d2 đường kính lỗ đục (mm), D2 đường kính vòng phân giải)


-8-

Hình 3.5. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y5

Hình 3.6. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y6

3.1.1.2. Định tên chủng vi khuẩn Y6
a. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng Y6
Quan sát bằng kính hiển vi về hình thái điển hình, đặc tính của chủng
Y6 cho thấy: chủng vi khuẩn Y6 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương và có
tế bào hình que ngắn, có khả năng axit hóa môi trường, không sinh bào tử,
không sinh khí và không di động.
b. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử
DNA hệ gen của chủng nghiên cứu được tách chiết và đoạn gen mã
cho 16S rRNA được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi
phổ biến 27F/1492R. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S của Y6 cho thấy
đoạn gen gồm 1447 bp và đoạn gen này được so sánh với các gen 16S
rRNA vi khuẩn trên Genbank với phần mềm Blastn. Kết quả cho thấy
đoạn gen 16S rRNA của chủng Y6 có độ tương đồng 99.92% với trình tự


-9-

16S rADN của Lactobacillus fermentum (AJ575812) (1279/1280 bp);
tương đồng 97.89% Lactobacillus gorilla (AB904716) (1253/1280 bp)
(hình 3.10)

Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Y6 với các loài có quan hệ họ hàng gần

Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và sinh lí, sinh hóa có thể xếp
chủng Y6 thuộc loài Lactobacillus fermentum và được đặt tên là

Lactobacillus fermentum Y6

Hàm lượng axit (g/l)

3.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men axit lactic
từ đƣờng xylose của chủng L. fermentum Y6
Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: Nhiệt độ, pH ban đầu,
nồng độ đường xylose, tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ
đường xylose của chủng L. fermentum Y6 đã lựa chọn được các giá trị
nhiệt độ 37oC; pH ban đầu 6; nồng độ đường xylose 10 g/l; tỉ lệ cấp giống
10 % (v/v) và thu được 7,29 g/l axit sau 120 giờ lên men.
8
7
6
5
4
3
2
1
0

6.66
30 oC
35 oC
37 oC
40 oC
45 oC
0

24

48
72
96
Thời gian (giờ)

120

144

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose
của chủng L. fermentum Y6


Hàm lượng axit (g/l)

- 10 8
7
6
5
4
3
2
1
0

7.25

24

48

72
96
Thời gian (giờ)

120

4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
144

Hàm lượng axit (g/l)

Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường
xylose của chủng L. fermentum Y6
9
8
7
6
5
4
3
2

1
0

7.27

5 g/l

10 g/l
15 g/l
20 g/l

25 g/l
30 g/l
24

48

72
96
Thời gian (giờ)

120

144

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic từ đường
xylose của chủng L. fermentum Y6

Nhận thấy rằng có 3 yếu tố tác động mạnh nhất đến quá trình đó là
yếu tố nhiệt độ, pH ban đầu và nồng độ đường xylose (hình 3.11; 3.12;

3.14). Do đó, thí nghiệm chọn 3 yếu tố trên để tiến hành tiến hành tối ưu
điều kiện lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum Y6.
3.1.3. Tối ƣu điều kiện lên men axit lactic từ đƣờng xylose của chủng
L. fermentum Y6
Theo nguyên tắc của ma trận Box - Behnken, ta tiến hành 17 thí
nghiệm với sự thay đổi đồng thời của 3 yếu tố nhiệt độ, pH ban đầu và
nồng độ đường xylose quanh giá trị trung bình (bảng 3.5).
Từ những phân tích phương sai, phần mềm đã đưa ra phương trình hồi
quy theo giá trị của mô hình nghiên cứu như sau:
Y = 8,06 - 0,38X1 + 0,73X2 + 1,51X3 - 0,34 X1X2 - 0,64 X1X3 +
0,055X1X3 - 1,29X12 - 1,71 X22 - 1,87 X32 (1)


- 11 -

Bảng 3.5. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken với ba yếu tố và hàm lượng
axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau
STT X1

X2

X3

o

X1( C)

X2

X3(g/l)

Y(g/l)

1
-1
0
0
37
6,0
10
8,0
2
+1
0
0
30
6,0
5
3,11
3
-1 +1
0
37
4,5
15
5,32
4
+1 +1
0
44

6,0
5
3,58
5
-1
0
-1
37
6,0
10
8.10
6
+1
0
-1
44
4,5
10
4,15
7
-1
0
+1
37
6,0
10
7,9
8
+1
0

+1
30
6,0
15
7,5
9
0
-1
-1
30
4,5
10
4,2
10
0
+1
-1
44
6,0
15
5,41
11
0
-1
+1
37
7,5
15
6,58
12

0
+1 +1
37
6,0
10
8,15
13
0
0
0
37
7,5
5
3,53
14
0
0
0
30
7,5
10
6,63
15
0
0
0
44
7,5
10
5,23

16
0
0
0
37
4,5
5
2,49
17
0
0
0
37
6,0
10
8,15
Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng axit
thu được sau quá trình lên men bằng phần mềm Design-Expert. Kết quả
tìm được phương án tốt nhất để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: nhiệt độ
37,76oC; pH ban đầu = 6,2; nồng độ đường 11,53 g/l. Khi đó, lượng axit
đạt được trong các điều kiện trên theo tính toán là 8,33 g/l.
Thực nghiệm được tiến hành dưới các điều kiện như sau: Nhiệt độ 38
o
C, pH ban đầu 6,2 và nồng độ đường là 12 g/l. Sau 120 giờ lên men, hàm
lượng axit đạt được là 8,51 g/l. Kết quả này có độ tương thích cao so với lí
thuyết, lượng axit thu được sau tối ưu đa yếu tố tăng 16,7% so với khảo sát
đơn yếu tố.
3.1.4. Ảnh hƣởng của lắc và duy trì pH ban đầu ở điều kiện tối ƣu

- 12 -

Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men và duy
trì pH6,2 bằng NaOH 2N trong điều kiện tối ưu. Kết quả này cho thấy rằng
ở tốc độ lắc 50 vòng/phút kết hợp với duy trì pH6,2 dẫn đến hiệu suất lên
men và mức độ sử dụng đường tăng, đồng thời rút ngắn thời gian lên men
Phân tích dịch lên men trong điều kiện duy trì pH 6,2 sau 48 giờ
bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC thu được kết quả lượng axit
lactic tạo thành 7,36 g/l; axit axetic 2,24 g/l. Như vậy, hiệu suất lên men
axit lactic 61,3%.
Từ các dữ liệu tham chiếu so sánh trên cho thấy lợi thế về năng lực
lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum Y6 cao hơn so với
các chủng của chi Lactobacillus, đạt hiệu suất lên men axit lactic 61,3%.
Đồng thời, chủng L. fermentum Y6 được phân lập từ sản phẩm lên men
truyền thống, nên có lợi thế về năng lực và độ ổn định về hoạt tính trong
bảo quản giống. Bên cạnh đó, chủng này có khả năng phát triển và lên men
trên môi trường YE - là môi trường muối khoáng đơn giản và chỉ chứa 3%
cao nấm men như là nguồn bổ sung nitơ hữu cơ, điều này chính là ưu điểm
của chủng so với các chủng Lactobacillus khác và Enterococcus và cũng
là ưu điểm khi sử dụng chủng L. fermentum Y6 trong lên men axit lactic
từ dịch thủy phân lignocellulose.
3.2. Nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose.
3.2.1. Phân lập, tuyển chọn chủng và định tên chủng vi khuẩn có khả
năng lên men axit lactic từ đƣờng cellobiose.
3.2.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit
lactic từ đường cellobiose.
Từ 22 chủng vi khuẩn phân lập được, dựa vào kết quả phân lập đã
lựa chọn sơ bộ ra được 5 chủng thể hiện khả năng sinh axit cao nhất với tỉ
lệ D1/d1≥ 3,0 (D1- đường kính vòng phân giải, d1- đường kính khuẩn lạc).
Tiếp tục tuyển chọn chủng có khả năng sinh axit lactic cao nhất theo

phương pháp định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelman; phương pháp
cấy chấm điểm, đục lỗ thạch và định lượng axit bằng NaOH 0,05N. Kết
quả chọn ra chủng HC2 có khả năng sinh axit cao (hình 3.24, 3.25, bảng
3.8). Tiến hành xác định lượng axit lactic tạo thành bằng phương pháp sắc
kí lỏng cao áp kết quả thu được lượng axit lactic tạo thành là 4,2 g/l; lượng
đường cellobiose dư là 3,79 g/l.


- 13 -

Hình 3.24. Hình ảnh cấy chấm
Hình 3.25. Hình ảnh đục lỗ
điểm của 5 chủng vi khuẩn có khả
thạch của 5 chủng vi khuẩn có
năng lên men axit lactic từ đường
khả năng lên men axit lactic từ
cellobiose
đường cellobiose
Bảng 3.8. Đặc điểm của các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose
bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit
Lượng
S
Hình dạng
D2Kí
axit
Đặc điểm hình thái D1/
T
tế bào vi
d2
hiệu

d1
sau 96h
khuẩn lạc
T
khuẩn
(g/l)
Kích thước nhỏ li ti,
Que ngắn
1 HC1
màu trắng, không nhày, 3,0 4,0
5,1
xếp chuỗi
tròn
Kích thƣớc bình
HC
Que
thƣờng,tròn, hơi lồi,
2
4,0 6,0
5,5
2
chuỗi dài
màu trắng đục, bề
mặt bóng
Kích thước bình
Que,
thường, hơi tròn, viền
3 HC3
3,75 4,5
5,2

chuỗi dài
lồi lõm, nhày, trắng
nhạt
Que xếp
Tròn, kích thước nhỏ li
4 HC4
chuỗi
3,75 4,5
5,2
ti, màu trắng, bóng
ngắn
Tròn, kích thước nhỏ,
Que ngắn
5 HC5
bề mặt trơn bóng, màu 3,0 4,0
5,0
xếp chuỗi
trắng sữa
(D1: đường kính vòng phân giải (mm), d1: đường kính khuẩn lạc (mm))


- 14 -

(d2 đường kính lỗ đục (mm), D2 đường kính vòng phân giải)
3.2.1.2. Định tên chủng vi khuẩn được lựa chọn
a. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng HC2
Tiến hành quan sát đặc điểm hình thái và xác định các đặc tính sinh
lý – sinh hóa chủng HC2 cho thấy chủng vi khuẩn HC2 thuộc nhóm vi
khuẩn Gram dương và có tế bào hình que ngắn, có khả năng axit hóa môi
trường, không sinh bào tử, không sinh khí và không di động.

b. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử
DNA hệ gen của chủng nghiên cứu được tách chiết và đoạn gen mã
cho 16S rRNA được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ
biến 27F/1492R. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S của HC2 gồm 1447 bp
và đoạn gen này được so sánh với các gen 16S rRNA vi khuẩn trên
Genbank với phần mềm Blastn. Kết quả nhận được cho thấy đoạn gen 16S
rRNA của chủng HC2 có độ tương đồng lên đến 100% so với trình tự gen
16S rRNA của Lactobacillus plantarum subsp. plantarum _ D79210
(1360/1360 bp); tương đồng 99.93% Lactobacillus pentosus_D79211
(1359/1360
bp),
tương
đồng
99.85%
với
Lactobacillus
paraplantarum_AJ306297 (1358/1360 bp); tương đồng 99.63% với
Lactobacillus plantarum subsp. argentoraten_AJ640078 (1355/1360 bp)
(hình 3.31)

Hình 3.31. Vị trí phân loại của chủng HC2 với các loài có quan hệ họ hàng gần


- 15 -

Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và sinh lí, sinh hóa có thể xếp
chủng HC2 thuộc loài Lactobacillus plantarum và được đặt tên là
Lactobacillus plantarum HC2
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đƣờng
và tỉ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic của chủng L.

plantarum HC2
Từ kết quả khảo sát cho thấy rằng tại các chỉ số: Nhiệt độ 37oC; pH
ban đầu bằng 6; tỉ lệ cấp giống 10%; nồng độ đường 10g/l và lắc 100
vòng/phút thì hàm lượng axit thu được là cao nhất (6,45g/l) sau 120 giờ
nuôi cấy. Trong đó có 3 yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến quá trình lên
men: Nhiệt độ, pH ban đầu và nồng độ đường (hình 3.32; 3.33; 3.34). Do
đó, chúng tôi chọn 3 yếu tố trên để tiến hành quá trình tối ưu hóa.
Hàm lượng axit(g/l)

8
5.85

6

25oC
30 oC
35 oC
37 oC
40 oC
45 oC

4
2
0
24

48

72
96

Thời gian(giờ)

120

144

168

Hình 3.32. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường
cellobiose bởi chủng L. plantarum HC2
Hàm lượng axit (g/l)

7

4.5

6.09

5
5.5

4

6
6.5
7

1
24

48

72

96
120
Thời gian(giờ)

144

168

7.5

Hình 3.33. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường
cellobiose bởi chủng L. plantarum HC2


- 16 -

Hàm lượng axit (g/l)

7

6.22
5g/l
10g/l

4

15 g/l
20 g/l
25g/l

1
24

48

72

96

120

144

168

Thời gian(giờ)

Hình 3.34. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic từ đường
cellobiose bởi chủng L. plantarum HC2

3.2.3. Tối ƣu hóa quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng
L. plantarum HC2
Dựa trên cơ sở đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình
lên men axit lactic, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ
(X1), pH ban đầu (X2) và nồng độ đường (X3). Kết quả được thể hiện ở
bảng 3.9.

Kết quả phân tích phương sai của mô hình tối ưu bằng phần mềm
DX7.1.5 (State-Ease). Giá trị F của mô hình là 38,83 với p < 0,0001 (p<
0,05) cho thấy dạng mô hình đã được lựa chọn đúng. Giá trị p của “Không
tương thích” là 0,1176 (p>0,05) cho thấy mô hình này tương hợp với thực
nghiệm.
Phương trình hồi quy thể hiện mối quan hệ giữa lượng axit thu được
và các yếu tố như pH ban đầu, nhiệt độ và nồng độ đường đã được mô tả
như sau phương trình (2):
Y= 7,11- 0,32X1 + 0,43X2 + 1,15 X3 - 0,22 X1X2 - 0,3 X1X3 - 0,8 X12 1,01X22- 1,95 X32(2)
Từ kết quả trên dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm được điều kiện
lên men tối ưu nhất là: Nhiệt độ 35,91oC; pH ban đầu 6,17; nồng độ đường
cellobiose 10,93 g/l. Khi đó, lượng axit đạt được trong các điều kiện trên
theo tính toán là 7,33 g/l. Thực nghiệm lên men axit lactic từ cellobiose ở
các điều kiện: Tỉ lệ cấp giống 10%; nhiệt độ 36oC; pH ban đầu 6,2; hàm
lượng đường 11 g/l và lắc 100 vòng/phút. Sau 120 giờ lên men lượng axit
thu được 7,43 ± 1,45 g/l. Kết quả này có độ tương thích cao so với lí
thuyết.


- 17 -

Bảng 3.9. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với 3 yếu tố và hàm lượng axit thu
được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau

STT
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

X1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
0
0
0
0
0
0
0
0

0

X2
0
0
+1
+1
0
0
0
0
-1
+1
-1
+1
0
0
0
0
0

X3
0
0
0
0
-1
-1
+1
+1

-1
-1
+1
+1
0
0
0
0
0

X1(oC)
30
44
30
44
30
44
30
44
37
37
37
37
37
37
37
37
37

X2

4,5
4,5
7,5
7,5
6
6
6
6
4,5
7,5
4,5
7,5
6
6
6
6
6

X3(g/l)
10
10
10
10
5
5
15
15
5
5
15

15
10
10
10
10
10

Design-Expert® Software

Design-Expert® Software

Design-Expert® Software

Y

Y

Y

7.2

7.2

2.9

2.9
7.2

X1 = A: nhiet do
X2 = B: pH

Y(g/l)
4,95
4,8
6,23
5,2
3,1
3,02
6,28
5,0
2,9
3,37
4,5
5,8
6,9
7,1
7,15
7,2
7,18

7.2
2.9
7.4

X1 = A: nhiet do
X2 = C: Duong

6.575

7.4

X1 = B: pH
X2 = C: Duong

6.3

Actual Factor
C: Duong = 10.00

6.225

Actual Factor
B: pH = 6.00

Actual Factor
A: nhiet do = 37.00

Y

5.05

Y

5.2

Y

5.95

5.325

4.1

3.875

4.7

3

2.7

7.50

44.00
6.75

40.50
6.00

B: pH

37.00
5.25

33.50
4.50

30.00

A: nhiet do

Hình 3.37. Ảnh hưởng đồng
thời của pH ban đầu và nhiệt
độ đến quá trình lên men axit
lactic từ cellobiose của chủng
L. plantarum HC2

15.00

44.00
12.50

40.50
10.00

C: Duong

37.00
7.50

33.50
5.00

30.00

A: nhiet do

15.00

7.50

12.50

6.75
10.00

C: Duong

6.00
7.50

5.25
5.00 4.50

B: pH

Hình 3.38. Ảnh hưởng Hình 3.39. Ảnh hưởng
đồng thời của nồng độ
đồng thời của nồng độ
đường và nhiệt độ đến
đường và pH ban đầu
quá trình lên men axit
quá trình đến lên men
lactic từ cellobiose của axit lactic từ cellobiose
chủng L. plantarum HC2 của chủng L. plantarum
HC2


- 18 -

Như vậy, kết quả nghiên cứu đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng

đến quá trình lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2: Nhiệt độ
36oC; pH ban đầu 6,2; nồng độ đường cellobiose 11 g/l, lắc 100 vòng/phút,
tỉ lệ cấp giống 10% theo thể tích, sau 120 giờ lên men lượng axit thu được
7,43 g/l, tăng 15,2% so với khảo sát đơn yếu tố.
3.2.4. Ảnh hƣởng của duy trì pH
Nghiên cứu ảnh hưởng của duy trì pH trong suốt quá trình lên men
axit lactic bởi chủng L. plantarum HC2, nhận thấy rằng duy trì pH trong
quá trình lên men đã tăng được hiệu quả của quá trình lên men: Lượng axit
tăng và rút ngắn quá trình lên men. Phân tích thành phần dịch lên men
trong điều kiện duy trì pH bằng phương pháp HPLC thu được kết quả:
Lượng axit lactic tạo thành 8,83g/l (hiệu suất tương ứng đạt 81,76%) và
đường dư không còn (hình 3.42).

Hình 3.42. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ đường cellobiose của
chủng L. plantarum HC2

3.3. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ.
3.3.1. Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phƣơng pháp nấu kín
và thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý bằng hỗn hợp enzyme Ctec2 và
Htec2.
Phân tích phổ HPLC của dịch đường các mẫu bột xút sau tiền xử lý ở
điều kiện tối ưu, cho thấy đường có thể lên men (glucose, xylose và
cellobiose) chiếm 96,35% tổng lượng đường thu được trong đó cellobiose
23,68 g/l; glucose 33,8 g/l; xylose 16,33 g/l, arabinose 2,79 g/l.


- 19 -

Như vậy, dịch thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý được thủy phân bằng
hỗn hợp enzyme thương phẩm chứa 3 loại đường có khả năng lên men

xylose, cellobiose, glucose. Sử dụng hiệu quả hỗn hợp 3 loại đường này
trong lên men axit lactic cũng là một trong những hướng nghiên cứu cần
được triển khai để tìm kiếm giải pháp sử dụng được nguyên liệu
lignocellulose cho sản xuất axit lactic, đồng thời góp phần giảm tải ô
nhiễm môi trường. Ngoài ra, việc sử dụng có hiệu quả của các loại đường
xuất phát từ dịch thủy phân của cellulolse và hemicellulose có thể giảm chi
phí sản xuất của axit lactic tới 25%.

22.2

25
20
15
10
5
0
6

12

24 36 48
Thời gian (giờ)

60

72

Hàm lượng axit (g/l)

Hình 3.44. Lên men axit lactic từ

dịch thủy phân rơm rạ của chủng L.
plantarum HC2

Hàm lượng axit (g/l)

Hàm lượng axit (g/l)

3.3.2. Lên men lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bằng các
chủng đơn hoặc hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum
Y6.
3.3.2.1. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bằng chủng L.
plantarum HC2
Quá trình lên men axit lactic diễn ra trong 48 giờ, kết quả thu được
như hình 3.44. Lượng axit tạo thành nhanh trong khoảng 24 giờ đầu sau
khi cấp giống và sau đó tăng chậm, đến 48 giờ thì kết thúc quá trình lên
men. Lúc này lượng axit thu được là 22,2 g/l. Trong dịch thủy phân rơm rạ
cellobiose đạt khoảng 12 g/l, glucose 18 g/l. Do đó, ngoài khả năng sử
dụng đường cellobiose, L. plantarum HC2 còn sử dụng đường glucose
trong lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ.
20
14.2

15
10
5
0
6

12

24 36 48
Thời gian (giờ)
Hàm lượng axit (g/l)

60

72

Hình 3.45. Lên men axit lactic từ
dịch thủy phân rơm rạ của chủng L.
fermentum Y6

3.3.2.2. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bằng chủng L.
fermentum Y6


- 20 -

Hàm lượng axit (g/l)

Kết quả nhận thấy rằng, quá trình lên men axit diễn ra trong 48 giờ,
lượng axit thu được cao nhất đạt 14,2 g/l (hình 3.45). Trong dịch thủy phân
rơm rạ xylose đạt khoảng 8 g/l, glucose 18 g/l. Do đó, ngoài khả năng sử
dụng đường xylose, L. fermentum Y6 còn sử dụng đường glucose trong lên
men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ.
3.3.2.3. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bằng hỗn hợp chủng
L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6
Tiến hành kiểm tra tính kháng chéo của 2 chủng HC2 và Y6 bằng
cách ria các chủng thành các đường thẳng cắt nhau trên môi trường đĩa
thạch. Kết quả thể hiện ở PL3.1 cho thấy rằng 2 chủng HC2 và Y6 phát

triển bình thường chứng tỏ chủng L. plantarum HC2 và chủng L.
fermentum Y6 không đối kháng nhau.
Do đó, nên sử dụng hỗn hợp hai chủng HC2 và Y6 trong lên men
axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ nhằm tận dụng tối đa nguồn carbon có
trong thành phần dịch lên men để thu được hiệu quả lên men lớn nhất.
Từ kết quả khảo sát cho thấy các giá trị tương ứng của các thông số
khảo sát trong quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn
hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 bao gồm: Nhiệt độ
37oC; pH duy trì 6,2; tỉ lệ cấp giống 10% trong đó tỉ lệ L. plantarum HC2 :
L. fermentum Y6 = 2 :1 ; nồng độ độ đường 38g/l; hàm lượng cao nấm men
3 g/l và lắc 100 vòng/ phút.

30
25
20
15
10
5
0

23.4
1 g/l
3 g/l
7 g/l
9 g/l
6

12

24

36
Thời gian (giờ)

48

60

Hình 3.47. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến quá trình lên men axit lactic
của hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6


Hàm lượng axit (g/l)

- 21 40
30.6
30

01:01
02:01
03:01
04:01

20
10
0
6

12

24

36

48

Thời gian (giờ)

Hình 3.49. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp
chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6
Hàm lượng axit (g/l)

40
32.3
0 vòng/phút
50 vòng/phút
100 vòng/phút
150 vòng/phút
200 vòng/phút

30
20

10
0
6

12
24
36
Thời gian (giờ)

48

Hình 3.50. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic của hốn hợp
chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6

Hình 3.51. Phổ HPLC của dịch lên men bởi hỗn hợp chủng L.plantarum HC2
và L. fermentum Y6

Phân tích phổ HPLC (hình 3.51) nhận thấy rằng lượng axit lactic thu
được 24,39 g/l; axit axetic 7,20 g/l và lượng đường dư là đường cellobiose:
0,86 g/l. Lúc này, hiệu suất lên men axit lactic thu được là 65,7%. Như
vậy, cả 3 loại đường thu được từ rơm rạ đều được sử dụng có hiệu quả.


- 22 -

40
35
30
25
20
15
10
5
0

12
10
8

6
4

OD 600nm

Nồng độ đường dư và
axit tạo thành(g/l)

3.3.3. Nghiên cứu động học của quá trình lên men lên men axit lactic
của 2 chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 từ dịch thủy phân
rơm rạ
Kết quả cho thấy trong vòng 6 giờ đầu của quá trình lên men, lượng
đường tiêu thụ chưa đáng kể (7,0 g/l) và lượng axit tạo thành 4,7 g/l. Tuy
nhiên từ khoảng từ 12 giờ đến 36 giờ, tốc độ của quá trình lên men tăng
nhanh, lượng đường tiêu thụ tăng mạnh từ 12,9 g/l đến 32,1 g/l đồng thời
lượng axit dao động trong khoảng 10g/l đến 29,5 g/l. Quá trình lên men đạt
kết quả cao nhất tại thời điểm 48 giờ với lượng đường dư là 0,86g/l và
lượng axit tạo thành 34,5 g/l. Đồng thời thông qua hình 3.52 cũng nhận
thấy rằng thời điểm thích hợp nhất để thu được lượng axit lớn nhất là cuối
pha log, đầu pha cân bằng (tại thời điểm 48 giờ tính từ khi lên men) của
quá trình sinh trưởng và phát triển của 2 chủng L. plantarum HC2 và L.
fermentum Y6

2
0
0

6

12

24
36
Thời gian (giờ)
Axit
Đường

48

60

72

OD

Hình 3.52. Động thái quá trình sinh axit của 2 chủng L. plantarum HC2
và L. fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ
3.3.4. Xác định dạng D,L lactic axit
Dạng L - lactic axit chiếm 86%. Như vậy, sản phẩm axit lactic thu
được là hỗn hợp đồng phân D, L axit lactic, sản phẩm này có thể ứng dụng
làm chất điều chỉnh độ pH trong các sản phẩm thực phẩm.
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Sau một quá trình nghiên cứu, luận án đã thu được kết quả cơ bản
sau


- 23 -

- Đối với quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

+ Từ các mẫu thực phẩm truyền thống đã phân lập được 26 chủng vi
khuẩn có khả năng lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, bằng 3
phương pháp tuyền chọn đã chọn được chủng Y6 lên men axit lactic cao
nhất. Bằng phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hóa và sinh học
phân từ đã định tên được chủng Y6 là Lactobacillus fermentum Y6.
+ Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố và qui hoạch thực nghiệm
bậc 2 Box - Bernken đã xác định được điều kiện tối ưu cho chủng L.
fermentum Y6 lên men axit lactic cao: Nhiệt độ 38oC; pH duy trì 6,2; nồng
độ đường 12 g/l; tỉ lệ cấp giống 10%, lắc 50 vòng/phút sau thời gian 48 giờ
thu nhận được 7,36 g/l axit lactic. Hiệu suất lên men axit lactic là 61,3%.
- Đối với quá trình lên men axit lactic từ đường cellobiose
+ Từ 22 chủng vi khuẩn được phân lập từ các nguồn khác nhau, đã
tuyền chọn được chủng HC2 có khả năng lên men axit lactic cao từ đường
cellobiose. Bằng phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hóa và sinh
học phân từ đã định tên được chủng HC2 là Lactobacillus plantarum HC2
+ Sử dụng phương pháp khảo sát đơn yếu tố và qui hoạch thực
nghiệm bậc 2 Box - Bernken đã xác định được điều kiện tối ưu cho chủng
L. plantarum HC2 lên men axit lactic cao: tỉ lệ cấp giống 10%; nhiệt độ
36oC; pH duy trì 6,2; nồng độ đường 11 g/l và lắc 100 vòng/phút sau thời
gian 48 giờ thu được 8, 83 g/l axit lactic. Hiệu suất lên men axit lactic là
80,27%.
- Đối với quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bằng
các chủng đơn và hỗn hợp chủng L. fermentum Y6 và L. plantarum HC2
+ Xử lý và thủy phân rơm rạ thu dịch thủy phân rơm rạ chứa
cellobiose 23,68 g/l; glucose 33,8 g/l; xylose 16,33 g/l, arabinose 2,79 g/l.
+ Lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L.
plantarum HC2: Nhiệt độ 37oC, tỉ lệ cấp giống 10% (trong đó tỉ lệ chủng
L. plantarum HC2: L. fermentum Y6 = 1:1 ); pH duy trì 6,2; nồng độ
đường 38 g/l và lắc 100 vòng/phút sau thời gian 48 giờ thu được 22,2 g/l
axit.

+ Chủng L. fermentum Y6 lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy
phân rơm rạ ở điều kiện: Nhiệt độ 37oC, tỉ lệ cấp giống 10% (trong đó tỉ lệ


- 24 -

chủng L. plantarum HC2: L. fermentum Y6 = 1:1); pH duy trì 6,2; nồng độ
đường 38 g/l và lắc 100 vòng/phút sau thời gian 48 giờ thu được 14,2 g/l
axit.
+ Đã xác định được các điều kiện thích hợp để lên men axit lactic bởi
2 chủng L. fermentum Y6 và L. plantarum HC2: nhiệt độ 37oC, tỉ lệ cấp
giống 10% (trong đó tỉ lệ chủng L. plantarum HC2 : L. fermentum Y6 =
2:1 ); pH duy trì 6,2; nồng độ đường 38 g/l và lắc 100 vòng/phút sau thời
gian 48 giờ thu được 32,3 g/l axit. Hiệu suất sinh axit đạt 85%. Dịch cach
trường lên men sau 48 giờ được phân tích bằng HPLC và thu được kết quả
là 24,39 g/l axit lactic, hiệu suất lên men axit lactic đạt 65,7 % và dạng Laxit lactic chiếm 86 %.
4.2. Kiến nghị
- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất axit lactic từ
dịch thủy phân rơm rạ trên quy mô pilot
-Tiến hành nghiên cứu quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân
từ các nguồn nguyên liệu thực vật bởi hỗn hợp chủng L. fermentum Y6 và
L. plantarum HC2.