Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên Her2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN PHƢƠNG HOA

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG
ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn phƣơng Hoa

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG
ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

Ngành: Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Quang Huấn

Hà Nội - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................………………..3
1. Khái niêm, phân loại và ứng dụng của immunotoxin……………………….3
1.2. Tình hình ung thƣ vú (UTV) trên thế giới và ở Việt Nam ..................... 4
1.2.1.Trên thế giới ................................................................................... 4
1.2.2.Ở Việt Nam ..................................................................................... 4
1.3 Giới thiệu ung thƣ vú……………………………………………………5
1.3.1 Khái niệm chung về bệnh UTV ...................................................... 5
1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú ................................................. 6
1.3.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán ........................................................... 7
1.3.4 Các phƣơng pháp điều trị................................................................ 9
1.4. Kháng nguyên Her2 đặc hiệu tế nào ung thƣ vú. .................................. 10
1.4.1. Khái quát về kháng nguyên HER2 ............................................... 10
1.4.2. Cấu trúc HER2 ............................................................................ 11
1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2 ........................................................... 11
1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2 ...................................................... 11
1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 và cơ chế gây ung thƣ của HER2….13

1.5 Khái quát chung về kháng thể - Kháng thể đơn dòng ............................. 16
1.5.1. Cấu tạo chung của kháng thể ........................................................ 16
1.5.2 Kháng thể đơn dòng. ..................................................................... 17
1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi - Mảnh kháng thể…………………………..17
1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thƣ vú...…19
1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin………………………………22
Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark
not defined.
2.1. Vật liệu ................................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.1 Sinh phẩm ...................................................................................... 23
2.1.2 Hoá chất......................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.3. Thiết bị ......................................... Error! Bookmark not defined.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Phƣơng pháp PCR……………………………………………….24
2.2.2. Cắt bằng enzym giới hạn .............................................................. 26
2.2.3. Phƣơng pháp thiết kế vector biểu hiện. ........................................ 26
2.2.4. Phƣơng pháp biến nạp .................................................................. 29
2.2.5. Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp .................................... 30
2.2.6. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide ................. 31
2.2.7. Phƣơng pháp tính sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+ .. 32
2.2.8. Phƣơng pháp phân tích khối phổ ................................................. 33
Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 36
3.1. Thiết kế vector biểu hiện pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch
hermel ............................................................................................................... 36
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




3.1.1. Cắt gen Hermel ............................................................................ 36

3.1.2.Cắt vector pET-21A(+) ................................................................. 36
3.1.3. Gắn gen hermel vào vector pET-21A(+) và chọn dòng plasmid tái
tổ hợp………………………………………………………………………..38
3.1.4. Xác định trình tự gen hermel.
.............. ……………………………………Error! Bookmark not defined.
3.2. Biểu hiện và tối ƣu hoá biểu hiện gen hermel.
............................. ………………………….Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli
BL21(DE3).........................................................................................................Er
ror! Bookmark not defined.
3.2.2. Biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên
HER2 trong tế bào E. coli BL 21(DE3)………………………………………..45
3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu
kháng nguyên HER2 trong E. coli......................................................................46
3.3.1.Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp độc tố miễn dịch
herme...................................................................................................................47
3.3.2 Ảnh hƣởng của oxi lên khả năng biểu hiện của gen mã hoá độc tố
miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………………………………………48
3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………………………………………50
3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
……………………………………………...Error! Bookmark not defined.
3.3.5 Ảnh hƣởng của IPTG………………………………………………….52
3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu……………………………………………54
3.3.7 Biểu hiện protein tái tổ hợp hermel ở các điều kiện thích hợp đã lựa
chọn…………………………………………………………………………….55
3.4. Tinh sach protein tái tổ hợp hermel, khẳng định bằng khối phổ và xác
đinh hoạt tính…………………………………………………………..............56
3.4.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp HER2……………………………………....56
3.4.2 Phân tích khối phổ protein tái tổ hợp…………………………………….57
3.4.3 Xác đinh hoạt tính của protein hermel…………………………………...59

Kết luận và kiến nghị
………………………………………………………...Error! Bookmark not
defined.
Tài liệu tham khảo
……………………………………………………………Error! Bookmark
not defined.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




THUậT NGữ VIếT TắT
Stt

Ký hiu

Tờn y

1

ADN

Axit Deoxyribonucleic

2

Amp

Ampicillin

3

bp

Base pair (cặp bazơ nitơ)

4

ddNTP

Dideoxynucleotide

5

dNTP

Deoxynucleotide

6

EDTA

Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

7

PE

Pseudomonas exotoxin

8

EtBr

Ethidium Bromide

9

HRP

Horseradish peroxidase

10

IPTG

Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside

11

IR

Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn)

12

Ka

Kanamycin

13

kDa

Kilo Dalton

14

LB

Môi tr-ờng Lauria Betani

15

DT

Diphtheria toxin

16

LRR

Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine)

17

LTA

Axit lipoteichoic

18

NASBA

Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa trên
trình tự axit nucleic)

19

OD

Optical Density (Mật độ quang học)

20

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

21

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

22

TAE

Tris - Acetate - EDTA

23

TE

Tris - EDTA

24

utv

ung th- vú

25

v/ph

vòng/phút

26

X-gal

5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- - D-galactopyranoside

S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn




Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




-1-

MỞ ĐẦU
Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) được xác định là
những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quần
thể tế bào mà ở đó có biểu hiện những kháng nguyên hoặc thụ thể bề mặt đặc
hiệu.
Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết và làm tan tế bào
ung thư vú biểu hiện quá mức HER2 một yếu tố phát triển biểu mô biểu hiện
mạnh ở 25-30% bệnh nhân ung thư vú.
ITs được tạo ra bằng việc kết hợp giữa 2 yếu tố : (1) chất gây độc
(toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng đích theo các phương
pháp hoá học (7) hoặc bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.
HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô
(Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase,
đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào. Cho
đến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thể tạo
dimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồng
thụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu. Sự khuếch đại

gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên
bề mặt tế bào ung thư vú. Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào
thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều
nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự
khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung
thư. Tính chất này làm cho HER2 trở thành một đích hữu hiệu để chẩn đoán
sớm cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




-2-

Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao
nhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới. Điều trị ung thư vú cũng như nhiều
loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị
liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất
lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targeted
effect). Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trường
hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị
thấp. Những nghiên cứu gần đây về các marker sinh học trong ung thư vú đã
mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điều
trị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhược
điểm của các liệu pháp truyền thống. Một trong số thuốc có bản chất kháng
thể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhân
ung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là HERCEPTIN.
Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại
thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch
immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng
nguyên Her2’’

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




-3-

Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Khái niệm, phân loại và ứng dụng Immunotoxin
Như đã nói ở trên, cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunôtxin-IT) được
xác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn
lọc quần thể tế bào mà ở đó biểu hiện những kháng nguyên hoặc receptor bề
mặt đặc hiệu. Những độc tố dạng này đang được nghiên cứu và chế tạo không
chỉ trong trị liệu ung thư (5), mà còn được thử nghiệm trên các bệnh khác
như GvHD (6), các bệnh tự miễn dịch và AIDS (7). Immunotoxin được tạo ra
bằng việc kết hợp giữa hai yếu tố : chất gây độc (toxins) có bản chất là
protein và (2) tác nhân hướng dích theo các phương pháp hoá học (9) hoặc
công nghệ ADN tái tổ hợp (11). Cho tới nay các toxin thường hay được dùng
nhất để chế tạo ITs là các protein từ vi khuẩn [pseudomonas exotoxin (PE)
hay diptheria toxin (DT)] , hoặc từ thực vật [nhóm các protein bất hoạt
riboxom (RIPs) như : Ricin,

pokweet anti- viral protein (PAP). Saporin

(SAP)...]. Cả hai loại toxin này tác động lên tế bào theo cơ chế làm bất hoạt

EP-2 (PE, DT) hay tác động lên điểm gắn của EP-2 (RIPs) trên tiểu phần
riboxom 28S, làm ức chế quá trình sinh tổng hợp protein (17). Mặc dù các
toxin kể trên có hoạt tính cao và chỉ bằng không đến 10 phân tử có thể giết
chết một tế bào đích, việc kết hợp giữa chúng để tạo ra ITs còn mang lại giá
trị sử dụng cao hơn nhiều.Các kết quả nghiên cứu cũng đã cho thấy ITs tạo ra
bởi các toxin kể trên có khả năng ức chế tế bào ung thư mạnh và hiệu quả hơn
từ hàng trăm tới hàng nghìn lần do có tính hướng đích và tính chọn lọc.
Độc tố Melitin là gì ?
Melitin là một loại protein hay chuỗi axit amin, thu hút rất mạnh đối
với màng tế bào nên ngay khi tiếp xúc với bề mặt tế bào mục tiêu, nó nhanh

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....