Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên her2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
NGUYỄN PHƯƠNG HOA
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH
HƯỚNG
ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN
HER2
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
Nguyễn phƣơng Hoa
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG
ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2
Ngành: Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Quang Huấn
Hà Nội - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………… 3
1. Khái niêm, phân loại và ứng dụng của immunotoxin……………………….3
1.2. Tình hình ung thƣ vú (UTV) trên thế giới và ở Việt Nam 4
1.2.1.Trên thế giới 4

1.2.2.Ở Việt Nam 4
1.3 Giới thiệu ung thƣ vú……………………………………………………5
1.3.1 Khái niệm chung về bệnh UTV 5
1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú 6
1.3.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán 7
1.3.4 Các phƣơng pháp điều trị 9
1.4. Kháng nguyên Her2 đặc hiệu tế nào ung thƣ vú. 10
1.4.1. Khái quát về kháng nguyên HER2 10
1.4.2. Cấu trúc HER2 11
1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2 11
1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2 11
1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 và cơ chế gây ung thƣ của HER2….13
1.5 Khái quát chung về kháng thể - Kháng thể đơn dòng 16
1.5.1. Cấu tạo chung của kháng thể 16
1.5.2 Kháng thể đơn dòng. 17
1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi - Mảnh kháng thể………………………… 17
1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thƣ vú …19
1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin………………………………22
Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark
not defined.
2.1. Vật liệu Error! Bookmark not defined.
2.1.1 Sinh phẩm 23
2.1.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined.
2.1.3. Thiết bị Error! Bookmark not defined.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Phƣơng pháp PCR……………………………………………….24
2.2.2. Cắt bằng enzym giới hạn 26
2.2.3. Phƣơng pháp thiết kế vector biểu hiện 26
2.2.4. Phƣơng pháp biến nạp 29
2.2.5. Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp 30

2.2.6. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 31
2.2.7. Phƣơng pháp tính sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+ 32
2.2.8. Phƣơng pháp phân tích khối phổ 33
Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Thiết kế vector biểu hiện pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch
hermel 36
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

3.1.1. Cắt gen Hermel 36
3.1.2.Cắt vector pET-21A(+) 36
3.1.3. Gắn gen hermel vào vector pET-21A(+) và chọn dòng plasmid tái
tổ hợp……………………………………………………………………… 38
3.1.4. Xác định trình tự gen hermel.
……………………………………Error! Bookmark not defined.
3.2. Biểu hiện và tối ƣu hoá biểu hiện gen hermel.
………………………….Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli
BL21(DE3) Er
ror! Bookmark not defined.
3.2.2. Biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên
HER2 trong tế bào E. coli BL 21(DE3)……………………………………… 45
3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu
kháng nguyên HER2 trong E. coli 46
3.3.1.Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp độc tố miễn dịch
herme 47
3.3.2 Ảnh hƣởng của oxi lên khả năng biểu hiện của gen mã hoá độc tố
miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………………………………………48
3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………………………………………50
3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
…………………………………………… Error! Bookmark not defined.

3.3.5 Ảnh hƣởng của IPTG………………………………………………….52
3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu……………………………………………54
3.3.7 Biểu hiện protein tái tổ hợp hermel ở các điều kiện thích hợp đã lựa
chọn…………………………………………………………………………….55
3.4. Tinh sach protein tái tổ hợp hermel, khẳng định bằng khối phổ và xác
đinh hoạt tính………………………………………………………… 56
3.4.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp HER2…………………………………… 56
3.4.2 Phân tích khối phổ protein tái tổ hợp…………………………………….57
3.4.3 Xác đinh hoạt tính của protein hermel………………………………… 59
Kết luận và kiến nghị
……………………………………………………… Error! Bookmark not
defined.
Tài liệu tham khảo
……………………………………………………………Error! Bookmark
not defined.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

THUậT NGữ VIếT TắT
Stt
1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Ký hiu
ADN
Amp
bp
ddNTP
dNTP
EDTA
PE
EtBr
HRP
IPTG
IR
Ka

kDa
LB
DT
LRR
LTA
NASBA
OD
PCR
SDS
TAE
TE
utv
v/ph
X-gal
Tờn y
Axit Deoxyribonucleic
Ampicillin
Base pair (cặp bazơ nitơ)
Dideoxynucleotide
Deoxynucleotide
Ethylen Diamine Tetra acetic Acid
Pseudomonas exotoxin
Ethidium Bromide
Horseradish peroxidase
Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside
Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn)
Kanamycin
Kilo Dalton
Môi tr-ờng Lauria Betani
Diphtheria toxin

Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine)
Axit lipoteichoic
Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa trên
trình tự axit nucleic)
Optical Density (Mật độ quang học)
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Sodium Dodecyl Sulphate
Tris - Acetate - EDTA
Tris - EDTA
ung th- vú
vòng/phút
5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- - D-galactopyranoside
S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi
Nguyờn

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-1-
MỞ ĐẦU
Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) được xác định là
những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quần
thể tế bào mà ở đó có biểu hiện những kháng nguyên hoặc thụ thể bề mặt đặc
hiệu.
Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết và làm tan tế bào
ung thư vú biểu hiện quá mức HER2 một yếu tố phát triển biểu mô biểu hiện
mạnh ở 25-30% bệnh nhân ung thư vú.
ITs được tạo ra bằng việc kết hợp giữa 2 yếu tố : (1) chất gây độc
(toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng đích theo các phương
pháp hoá học (7) hoặc bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.
HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô

(Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase,
đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào. Cho
đến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thể tạo
dimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồng
thụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu. Sự khuếch đại
gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên
bề mặt tế bào ung thư vú. Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào
thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều
nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự
khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung
thư. Tính chất này làm cho HER2 trở thành một đích hữu hiệu để chẩn đoán
sớm cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-2-
Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao
nhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới. Điều trị ung thư vú cũng như nhiều
loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị
liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất
lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targeted
effect). Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trường
hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị
thấp. Những nghiên cứu gần đây về các marker sinh học trong ung thư vú đã
mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điều
trị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhược
điểm của các liệu pháp truyền thống. Một trong số thuốc có bản chất kháng
thể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhân
ung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là HERCEPTIN.
Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại
thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch
immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng
nguyên Her2’’
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-3-
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Khái niệm, phân loại và ứng dụng Immunotoxin
Như đã nói ở trên, cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunôtxin-IT) được
xác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn
lọc quần thể tế bào mà ở đó biểu hiện những kháng nguyên hoặc receptor bề
mặt đặc hiệu. Những độc tố dạng này đang được nghiên cứu và chế tạo không
chỉ trong trị liệu ung thư (5), mà còn được thử nghiệm trên các bệnh khác
như GvHD (6), các bệnh tự miễn dịch và AIDS (7). Immunotoxin được tạo ra
bằng việc kết hợp giữa hai yếu tố : chất gây độc (toxins) có bản chất là
protein và (2) tác nhân hướng dích theo các phương pháp hoá học (9) hoặc
công nghệ ADN tái tổ hợp (11). Cho tới nay các toxin thường hay được dùng
nhất để chế tạo ITs là các protein từ vi khuẩn [pseudomonas exotoxin (PE)
hay diptheria toxin (DT)] , hoặc từ thực vật [nhóm các protein bất hoạt
riboxom (RIPs) như : Ricin,
pokweet anti- viral protein (PAP). Saporin
(SAP) ]. Cả hai loại toxin này tác động lên tế bào theo cơ chế làm bất hoạt
EP-2 (PE, DT) hay tác động lên điểm gắn của EP-2 (RIPs) trên tiểu phần
riboxom 28S, làm ức chế quá trình sinh tổng hợp protein (17). Mặc dù các
toxin kể trên có hoạt tính cao và chỉ bằng không đến 10 phân tử có thể giết
chết một tế bào đích, việc kết hợp giữa chúng để tạo ra ITs còn mang lại giá
trị sử dụng cao hơn nhiều.Các kết quả nghiên cứu cũng đã cho thấy ITs tạo ra
bởi các toxin kể trên có khả năng ức chế tế bào ung thư mạnh và hiệu quả hơn
từ hàng trăm tới hàng nghìn lần do có tính hướng đích và tính chọn lọc.
Độc tố Melitin là gì ?

Melitin là một loại protein hay chuỗi axit amin, thu hút rất mạnh đối
với màng tế bào nên ngay khi tiếp xúc với bề mặt tế bào mục tiêu, nó nhanh
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-4-
chóng thấm vào qua những lỗ nhỏ để phá vỡ và tiêu diệt chúng, kết quả là các
khối u ngừng phát triển hoặc thu nhỏ.
1.2. TÌNH HÌNH UNG THƯ VÚ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.2.1. Trên thế giới
Theo Hiệp hội ung thư Mỹ, ung thư vú (UTV) là một trong số những
bệnh gây ra tử vong ở phụ nữ trên toàn thế giới. Mỗi năm, có khoảng 1,3 triệu
người bị chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú và 465.000 người chết vì bệnh này.
Tỷ lệ mắc ung thư vú có sự chênh lệch lớn giữa các nước, cao nhất ở Hoa Kỳ
và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở Nam Âu, Tây Âu, Bắc Mỹ và thấp nhất ở
châu Á. Theo nghiên cứu của hiệp hội ung thư, tỉ lệ UTV ở Mỹ đã tăng từ
80/100.000 người trong năm 1975 lên 105/100.000 người trong năm 1985 và
178/100.000 người trong năm 1998. Theo Nazario và cs, tỉ lệ UTV ở Puerto
Rico đã tăng từ 15,3/100.000 người trong giai đoạn 1960-1964 lên
43,3/100.000 người trong giai đoạn 1985-1989. Tại Vaud, Thụy Sĩ, tỉ lệ UTV
đã tăng từ 2,1/100.000 phụ nữ (1997-1979) lên 9,4/100.000 phụ nữ (1992-
1994) [16, 19].
Tỉ lệ UTV ở châu Á có xu hướng tăng nhanh, đặc biệt ở Nhật Bản,
Hồng Kông và Singapore, nơi có lối sống tây hóa. Điều này cho thấy các yếu
tố môi trường, lối sống và đặc biệt là chế độ ăn uống đóng một vai trò quan
trọng trong sự phát triển của bệnh UTV.
1.2.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam, ung thư vú là bệnh ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ.
Thống kê trung bình mỗi năm có 150.000 bệnh nhân ung thư mới được phát
hiện, khoảng 75.000 người chết vì bệnh này và có đến 80% trường hợp chỉ
phát hiện khi bệnh đã ở giai đoạn muộn. Theo điều tra ở Hà Nội năm 1998, tỉ

lệ số người mắc UTV là 20,3/100.000 người, năm 2000 là 17,4/100.000
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-5-
người, năm 2006 tỉ lệ tăng lên 40/100.000 người, còn ở thành phố Hồ Chí
Minh là 20/100.000 người [3].
1.3. GIỚI THIỆU VỀ UNG THƢ VÚ
1.3.1. Khái niệm chung về ung thƣ vú
UTV là bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ, bệnh diễn biến chậm,
khoảng 30% số bệnh nhân UTV tiến triển nhanh và dẫn đến tử vong trong
vòng vài tháng. Theo ước tính, từ khi tế bào hình thành khối u đến khi phát
hiện được khối u từ 1 cm thì mất khoảng từ 7 đến 8 năm. Nhưng khối u có
kích thước từ 1 cm đến 2 cm thì mất thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng.
Đây là thời gian cần có sự chữa trị sớm.
Thường khi về già từ độ tuổi 40 trở đi, các tế bào bất thường dị dạng
(abnormal cells) hay còn gọi là tế bào ung thư phát sinh từ biểu mô ống tuyến
hay biểu mô của tiểu thùy. Nếu không chữa trị sớm, các tế bào ung thư sẽ
phát triển nhanh chóng trong vú, tạo thành một khối u ác tính.
Trong quá trình phát triển, từ khối u đó cho ra những tế bào ung thư đi
vào mạch bạch huyết, lan tới các hạch bạch huyết. Có khi tế bào ung thư đi
theo các mạch máu để xâm nhập các cơ quan nội tạng (gan, phổi, óc ) hay bộ
xương, dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm chết người.
Người phụ nữ trẻ cũng có thể bị ung thư vú, nhưng xuất độ (tần xuất,
độ xảy đến) thấp hơn nhiều so với người lớn tuổi. Tuổi càng cao càng dễ bị
ung thư đủ loại, trong đó có ung thư vú [4, 28, 29].
1.3.2. Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú
Cho đến nay, con người vẫn chưa biết rõ ràng các nguyên nhân gây ung
thư vú, nhưng có những yếu tố nguy cơ đã được xác định làm tăng khả năng
bị ung thư vú.
a. Tiền sử gia đình

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-6-
Nguy cơ bị ung thư vú tăng từ 1,5 - 3 lần nếu người phụ nữ có mẹ
hoặc chị em gái mắc bệnh này. Đặc biệt khi mẹ hoặc chị em gái bị ung thư
vú cả hai bên ở tuổi tiền mãn kinh thì nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ có
quan hệ gia đình này đạt tới mức gần như tuyệt đối . Nguy cơ ung thư vú
đối với con gái sẽ tăng từ 1,7 lần nếu người mẹ bị ung thư vú một bên, lên
đến 3,28 lần nếu người mẹ bị ung thư vú cả hai bên.
b. Tiền sử sinh sản
Tuổi có kinh, tuổi mãn kinh và tiền sử mang thai là những yếu tố liên
quan chặt chẽ với UTV. Người ta đã chứng minh rằng ở những phụ nữ có
kinh lần đầu sớm thì thường có hàm lượng estradiol cao hơn so với phụ nữ
bình thường, hormon này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển
UTV. Một số nghiên cứu bệnh chứng khác cứ chậm kinh lần đầu một năm
thì nguy cơ phát triển UTV sẽ giảm 20% . Mãn kinh muộn sau tuổi 55 và
tổng thời gian có kinh nguyệt trong cuộc đời người phụ nữ cũng là những
yếu tố quan trọng trong nguy cơ gây UTV. Phụ nữ chưa mang thai có nguy
cơ mắc bệnh UTV cao gấp 1,4 lần so với phụ nữ có mang thai. Sinh con
sau 30 tuổi có nguy cơ bị UTV cao gấp 2 -5 lần so với nhóm sinh con trước
tuổi 19 [12, 14].
c. Thuốc tránh thai và điều trị các hormon thay thế
Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa dùng thuốc tránh thai
trong thời gian dài với UTV. Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy
cơ mắc UTV tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng tới
4,1 lần. Dùng hormon thay thế ở phụ nữ mãn kinh là an toàn khi dùng trong
thời gian ngắn. Nếu dùng với liều trung bình trong thời gian từ 10 -20 năm
nguy cơ mắc UTV tăng từ 1,5 - 2,0 lần [12, 21].
d. Dinh dưỡng và rượu
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-7-
Thức ăn nhiều mỡ, cũng như rượu có thể làm gia tăng rủi ro mắc bệnh
ung thư vú. National Cancer Institute (Viện Ung Thư Quốc Gia) khuyến
khích phụ nữ nên dùng thức ăn ít mỡ, tập thể dục đều đặn, và chỉ nên dùng
rượu có chừng mực [8, 9, 17].
e. Yếu tố môi trường
Các yếu tố môi trường như thực phẩm, thuốc reserpin, cafein, thuốc xịt
tóc, sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hóa từ nguồn tự nhiên hay nhân tạo sẽ làm
tăng nguy cơ phát triển UTV. Gần đây, những nghiên cứu cũng chỉ ra mối
liên quan giữa khói thuốc lá và sự gia tăng nguy cơ mắc UTV. Nhiều nghiên
cứu gần đây cũng cho thấy các hợp chất hữu cơ chứa Clo như PCBs
(polychlorinated biphenyls) cũng làm tăng nguy cơ mắc UTV [6].
1.3.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán
a. Phương pháp vật lý: siêu âm, chụp cộng hưởng từ, chụp hình cắt lớp
phát xạ positron, chiếu xạ hình MIBI, chụp cắt lớp vi tính, nhiệt ký, chiếu
sáng qua mô và chụp thấu quang
b. Phương pháp giải phẫu bệnh lý: Sinh thiết, xét nghiệm giải phẫu
bệnh lý, chẩn đoán lâm sàng (kích thước u, hạch và di căn)
c. Phương pháp hóa sinh và hóa sinh miễn dịch: nguyên lý của
phương pháp dựa trên cơ sở khi cơ thể có khối u, bản thân tế bào ung thư sẽ
phát sinh ra những chất mới đặc hiệu, mà các chất này đóng vai trò như chất
nhận biết cho các tế bào ung thư này. Các chất này thường được gọi tên
“tumor marker” và được phát hiện bằng các phương pháp miễn dịch.
Tumor marker (TM): TM của cơ thể có thể là những phân tử protein,
axit nucleic, enzym, hormon hay một số tế bào đặc biệt trong cơ thể khi xuất
hiện những TBUT. Việc phát hiện những chất này được thực hiện bằng các
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-8-

phản ứng miễn dịch với kháng thể đặc hiệu, có độ nhạy cao. Ví dụ, có thể
dùng kháng thể đơn dòng để nhận biết CD33, CD20,…
d. Phương pháp chẩn đoán thông qua một số gen đặc trưng: Sau đây
là một số gen đặc trưng được dùng để chẩn đoán bệnh UTV:
- Yếu tố phát triển mô HER2: Đây là phương pháp xác định sự khuếch
đại quá mức và biểu hiện quá mức của HER2 trong tế bào UTV. HER2 là một
thụ thể trên màng tế bào, có bản chất là một glycoprotein. HER2 đóng vai trò
quan trọng trong quá trình phát triển, biệt hóa, sự kết dính và sự chết của tế
bào. Cấu trúc, vai trò và chức năng của HER2 sẽ được trình bày chi tiết hơn ở
phần sau.
- Gen p53: đây là gen mã hóa cho phosphoprotein p53 của nhân, điều
hòa sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Thông thường p53 có
thời gian bán hủy rất ngắn nên không thể phát hiện được bằng phương pháp
hóa mô miễn dịch. Trong tế bào ung thư, gen p53 đột biến làm kéo dài thời
gian bán hủy của protein p53 nên có thể phát hiện bằng phương pháp hóa mô
miễn dịch.
- Gen telomerase: mã hóa cho ribonucleoprotein ADN polymerase, có
chức năng duy trì vùng telomersis của nhiểm sắc thể bị mất khi mỗi lần phân
chia.
- Gen CEA (carcinoembryonic antigen): mã hóa cho kháng nguyên bề
mặt của tế bào ung thư.
- Gen cytokeratin 19 (CK19): dùng để chẩn đoán di căn ung thư vú, đạt
tới 67%.
- Gen TMS-1 (target of methylation-induced silencing) có chức năng
trong điều hòa quá trình chết theo chương trình.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

-9-
- Gen BRCAI (breast cancer gene 1): Vào những năm đầu thập kỷ 90,
bằng việc nghiên cứu phân tích sự kết hợp một vị trí đặc hiệu ở nhóm nguy cơ

cao ung thư vú, người ta đã tìm thấy gen BRCAI. BRCAI nằm trên một locus
nhỏ của nhiễm sắc thể 17 đôi 12 và 21. Phụ nữ bị đột biến trên BRCAI ước
tính nguy cơ ung thư vú là 20% ở tuổi 40, 51% ở tuổi 50 và 81% ở tuổi 70.
- Gen BRCAII (breast cancer gene 2): BRCA2 nằm trên nhiễm sắc thể
13, được phân lập vào năm 1995. Gen này nằm ngay cạnh gen nguyên bào
võng mạc (RBI). BRCAII chiếm khoảng 35% đến 40% ung thư vú mang tính
di truyền và đã tìm thấy trong những gia đình bị ung thư vú, gặp cả ở nam và
nữ.
- Gen BRCAIII (breast cancer gene 3): Trong số những gia đình có
nguy cơ cao bị ung thư vú, có khoảng 10.20% không thấy có mối liên quan
hoặc BRCAI hoặc BRCAII. Giả thuyết có thể có một gen BRCAIII liên quan
đến ung thư vú. Phân tích mối liên quan trong 8 gia đình đã cung cấp một số
dữ liệu bước đầu cho thấy có một gen thứ 3 liên quan đến ung thư vú.
Ngoài ra, gần đây các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu đến đột
biến gen ti thể có liên quan tới chẩn đoán UTV.
1.3.4. Các phƣơng pháp điều trị
a) Hóa chất trị liệu: là phương pháp dùng hóa chất để tiêu diệt tế bào
ung thư vú như: adriamycin, cytoxan, taxol, taxotere, navelbine Mỗi loại lại
có cơ chế tác động riêng nhằm ngăn cản sự sinh sôi không kiểm soát của tế
bào. Ví dụ: adriamycin có tác dụng gắn vào chuỗi ADN làm cho tế bào không
thể phân chia được trong khi taxol và taxotere thì gây độc tế bào ung thư bằng
cách ức chế sự phân chia của tubulin.
b) Hormon trị liệu: đây là phương pháp điều trị ung thư bằng cách
ngăn cản hay cho thêm kích thích tố vào cơ thể. Rất nhiều trường hợp UTV
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 10 -
phát triển dưới sự kích thích của các kích thích tố. Nếu chế ngự được sự kích
thích này, các tế bào ung thư có thể ngừng phát triển hay bị tiêu diệt. Các biệt
dược thông thường được dùng trong nhóm này gồm tamoxifen, toremifene,

anastrozole, letrozole
c) Kháng thể đơn dòng: hiện nay trên thị trường đã có nhiều loại
kháng thể đơn dòng để phòng chống bệnh UTV như: muMAb, Herceptin,
Lapatinib, immunoliposomes. Các kháng thể đơn dòng sẽ được trình bày rõ
hơn trong phần tiếp theo.
1.4. KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UNG THƢ VÚ
1.4.1. Khái quát về kháng nguyên HER2
EGF (Epidermal growth factor) là một trong những yếu tố tăng trưởng
được biết đến sớm nhất. Stanley Cohen và cs tìm thấy yếu tố này lần đầu tiên
vào năm 1962.
Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì – gọi là EGFR (epidermal
growth factor receptor) nằm trên bề mặt tế bào. Đây là một glycoprotein
xuyên màng, phần nằm bên trong tế bào của thụ thể này gắn với một tyrosine
kinaze. Tyrosine kinaze này được hoạt hóa khi EGF đến gắn với thụ thể này.
Thụ thể này do một gen nằm trong tế bào quy định. Sự khuếch đại của gen
này sẽ làm thay đổi thụ thể này và có thể gây gia tăng nguy cơ ung thư ở súc
vật thí nghiệm và ở người. Gen quy định EGF và thụ thể EGFR đã được tìm
thấy ở mô tuyến vú bình thường và nhiều loại mô khác, nó điều hòa sự phân
bào, sự sống và sự biệt hóa của nhiều loại tế bào.
Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì cũng là một nhóm, gồm 4 loại
thụ thể: EGFR hay HER-1, HER-2, HER-3 và HER-4 (Human Epidermal
growth factor Receptor). Trong đó được biết đến và được nghiên cứu nhiều
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 11 -
nhất là HER-2. Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của NST 17, mã
hóa một thụ thể có chứa tyrosine kinse xuyên màng.
1.4.2. Cấu trúc của HER2
1.4.2.1. Cấu trúc gen HER2
Gen HER2 được nghiên cứu phát hiện ra với tên HER-2 và c-erbB-

eerG bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập vào năm 1985 (Coussens et al., 1985;
Semba et al., 1985). Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó cho thấy hai gen này
hoàn toàn giống nhau và thống nhất đặt tên gọi HER-2/neu (HER2). HER2
thuộc họ gen mã hóa các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu bì HER
(Human Epidermal Growth Factor Receptor). Nó còn có các tên gọi khác như
v-erb-b2, Neu, TKR1, NGL, HER2, nằm ở nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm
động, ở vị trí q11.2 - q12.0. HER2 là một gen tiền ung thư (proto-oncogen) có
chiều dài 30528 bp chứa 27 exon, tổng chiều dài các exon là 4477 bp trong đó
exon dài nhất có 969 bp, exon ngắn nhất có chiều dài 48 bp, gen này có 3 bản
sao tương đồng tương ứng với 3 allele B1( Ile-654/Ile655); allele B2 (Ile-
654/Val-655); allele B3 (Val-654/Val-655).
Mặc dù kích thước gen HER2 trong hệ gen là rất lớn nhưng quá trình
hiệu chỉnh sau khi phiên mã tạo ra mARN trưởng thành với khoảng 1800 bp
[1, 5, 18, 20, 22].
1.4.2.2. Cấu trúc protein HER2
Protein HER2 có khối lượng phân tử 185 kDa, gồm 3 phần chính:
+ Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N của thụ thể.
Nằm ở vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu
tố tăng trưởng biểu mô.
+ Vùng xuyên màng lipit.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 12 -
+ Vùng nội bào có chứa đuôi C có mang các gốc tyrosine được
phosphoryl hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể.
Hình 1.1. Cấu trúc của protein HER2 [74]
Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất
cảm ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và
CR2); (3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt
tính tyrosine kinase (TK); (5): Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)

Thụ thể HER2 bao gồm phần ngoại bào khoảng 632 amino acid, vùng
xuyên màng dài 22 amino acid và vùng tyrosine kinase nội bào được cấu trúc
từ 580 amino acid. Vùng ngoại bào của HER2 gồm 4 tiểu vùng: Tiểu vùng I
bao gồm các gốc amino acid từ vị trí số 1 đến vị trí 195 (SEQ1); tiểu vùng II
từ 196 - 319 (SEQ2); tiểu vùng III từ 320 - 488 (SEQ3); tiểu vùng IV từ 489 -
630 (SEQ4). Thụ thể HER bình thường tồn tại ở trạng thái đơn phân bất hoạt.
Sự hoạt hóa thụ thể xảy ra khi có ligand bám vào và làm hoạt hóa một dãy các
quá trình dẫn đến sự nhị hợp giữa các thụ thể, và cuối cùng làm trung gian
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 13 -
cho các quá trình sinh học như sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào [7, 10, 11,
27].
1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 và cơ chế gây ung thƣ của HER2
Tất cả các tế bào biểu mô bình thường chứa đựng 2 bản sao của gen
HER2 và là mức thấp nhất của thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào. Trong một
vài trường hợp, số lượng các bản sao của gen HER2 tăng lên dẫn đến sự phiên
mã ra mARN tăng, số lượng các thụ thể HER2 cũng tăng lên trên bề mặt tế
bào gọi là sự biểu hiện quá mức của gen HER2.
Hình 1.2. Sự biểu hiện quá mức của HER2 trên bề mặt tế bào
Thụ thể HER2 không cần có các chất liên kết để hoạt hóa mà cấu trúc
của nó luôn luôn trong trạng thái “mở”, bắt chước trạng thái liên kết với
ligand, làm cho nó có khả năng bắt cặp hình thành trạng thái nhị hợp (dimer)
với bản thân nó hoặc với các thành viên khác trong họ như HER1, HER3,
HER4.
Sự biểu hiện quá mức của HER2 là tác nhân làm tăng dimer hóa giữa
HER2 với chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3). Đó cũng là những tín
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 14 -

hiệu khởi đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau. Dưới đây là một đề
xuất của Moaser về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của
HER2.
Hình 1.3. Sự bất bình thường trong việc truyền tín hiệu do sự biểu hiện quá mức
của HER2
Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa.
Tăng dimer HER2-EGFR dẫn tới sự tăng sinh và sự xâm lấn của tế bào. Sự tăng
dimer hóa đồng hình HER2 làm mất tính phân cực của tế bào. Sự tăng dimer
HER2-HER3 có ảnh hưởng tới sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức
năng trao đổi chất của tế bào. Tăng sự biểu hiện quá mức của HER2 dẫn tới tăng
cường độ truyền tín hiệu. Một vài yếu tố phiên mã được cảm ứng trong những tế
bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kết quả của những sự thay đổi biểu hiện gen
ở mức dư thừa .
Feldman và cs (2007) đã đưa ra mô hình về con đường truyền tín hiệu
của những thụ thể hoạt động này. Ở trạng thái hoạt động nó kích thích con
đường truyền tín hiệu phosphatidyl inositol 3′-kinase (PI3K) thông qua việc
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 15 -
gắn tiểu phần p85 vào Akt, dẫn tới hoạt hóa Akt. Akt làm bất hoạt các phân tử
tiền apoptosis bao gồm Bad, caspase-9 và p53. Thêm vào đó, dưới tác động
của Akt, các hoạt động chuyển hóa glucose, các kênh vận chuyển glucose
(GLUT) (nhờ sự phosphoryl GSK3) và sự tổng hợp protein, chu trình phát
triển của tế bào (thông qua sự phosphoryl hóa của protein p90RSK, p70S6K,
mTOR) đều tăng lên là những nhân tố ngăn chặn quá trình apoptosis. Hơn thế
nữa, sự hoạt hóa các yếu tố phiên mã κB (nuclear factor κB) còn kích ứng sự
biểu hiện của các gen anti-apoptosis thông qua các protein c-IAP1-2, TRAP
1-2, và A1/Bfl-1. Kết quả của sự tăng sinh này cũng là một trong những
nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành ung thư [13, 15].
Hình 1.4. Cơ chế gây ung thư của HER2

1.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KHÁNG THỂ - KHÁNG THỂ ĐƠN
DÒNG
1.5.1. Cấu tạo chung của kháng thể (Immunoglobulin)
Kháng thể (antibody) là các globulin có trong huyết thanh của động vật
và có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 16 -
Kháng thể theo định nghĩa trên đây được gọi là kháng thể miễn dịch
(Immunoglobulin, Kí hiệu là Ig).
Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm một hay nhiều đơn
vị hợp thành. Mỗi đơn vị là một phân tử protein chứa 4 chuỗi polypeptide, 2
chuỗi nặng (kí hiệu là H) và 2 chuỗi nhẹ (kí hiệu là L). Chuỗi nặng và chuỗi
nhẹ được nối với nhau bằng 1 cầu disulfide, hai chuỗi nặng được nối với nhau
bởi 2 cầu disulfide.
Chuỗi nhẹ: Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi
nhẹ, chuỗi nhẹ kapa (κ) và lambda (λ). Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai
chuỗi nhẹ lambda hoặc hai chuỗi nhẹ kapa mà không bao giờ chứa cả hai loại.
Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin, một vùng có trật tự axit amin
có thể thay đổi gọi là vùng biến đổi có ki hiệu VL(variable). Vùng này nằm ở
phía đầu amin (-NH2) của phân tử. Vùng còn lại có trật tự axit amin không
thay đổi gội là vùng hằng định kí hiệu CL(constant). Vùng này nằm ở phía đầu
cacboxyl (-COOH).
Chuỗi nặng: có 5 loại chuỗi nặng là μ, γ, δ, α và ε ứng với 5 lớp kháng
thể là IgM, IgG, IgD, IgA và IgE. Chuỗi nặng chứa 4 vùng axit amin, một
vùng biến đổi và 3 vùng cố định. Cũng tương tự như ở chuỗi nhẹ, vùng biến
đổi của chuỗi nặng nằm ở phần đầu amin. Vùng này có kí hiệu là VH. Vùng
cố định nằm ở đầu cacboxyl. Ba vùng cố định của chuỗi nặng được kí hiệu là
CH 1, CH 2, CH 3. Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau
tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do vậy đảm bảo tính đa

dạng của kháng thể [2].
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

- 17 -
Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo của kháng thể
1.5.2. Kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng là kháng thể được tạo ra từ một dòng tương bào
biệt hóa từ lympho B ban đầu sau khi được kích thích bởi một quyết định
kháng nguyên. Kháng thể đơn dòng do quyết định kháng nguyên nào kích
thích thì chỉ kết hợp đặc hiệu với quyết định kháng nguyên ấy mà thôi.
1.5.3. Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể
Trong cấu tạo của bất kỳ một kháng thể tự nhiên nào đều có 4 vùng biến
đổi (V - Variable). Sự kết hợp giữa 1 vùng biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và
1 vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên
(paratope). Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên.
Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có thể gắn được với
2 kháng nguyên giống nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là
phần nhận biết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding). Vùng kháng
nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên