Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc

1
BỘ GIÁO DỤC

VIỆN KHOA HỌC VÀ

VÀ ĐÀO TẠO

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------------------

HỨA THỊ SƠN

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối
kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum
gây bệnh héo xanh cây lạc

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




2

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn
đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum
gây bệnh héo xanh cây lạc

Chuyên ngành:

Hóa sinh học

Mã số:

60 42 40

Học viên:

Hứa Thị Sơn

Hƣớng dẫn khoa học:

TS. Lê Nhƣ Kiểu

Hà Nội – 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau
đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
học tập.
Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Như Kiểu, Phó viện
trưởng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa–Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho tôi trong suốt thời
gian thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bộ môn Vi sinh vật-Viện Thổ nhưỡng
Nông hóa và tập thể bộ môn Sinh học Môi trường Nông nghiệp-Viện Môi
trường Nông nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm
thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong công việc để tôi có
thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia
đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm luận văn.
Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó./.
Hà nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010.
Học viên

Hứa Thị Sơn

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




4

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A, T, G, C
ADN
ALIV
BIV
bp
DGIV
EBI
EDTA
EHNV

Adenine, Thyamine, Guanine, Cytosine
Acid deoxyribonucleic
African lampeye iridovirus
bream iridovirus
base pair
Dwarf gourami iridovirus
European Bioinformatics Institute
Ethylenediamin Disodium Tetra Acetate
Epizootic haematopoietic necrosis virus

GIV
GSDIV
ISKNV

Grouper iridovirus
Grouper sleepy disease iridovirus
Infectious spleen and kidney necrosis virus

kb
LCDV
MCP
NCBI
OIE
OSGIV
PCR
RBIV
RSIVD
SBIV
SN-PCR
TAE

kilo base
Lymphocystis disease virus
Major capsid protein
National Center for Biotechnology Information
World Organisation for Animal Health
orange spotted grouper iridovirus
Polymerase Chain Reaction
Rock bream iridovirus
red sea bream iridoviral disease

Red sea bream iridovirus
Semi-nested - Polymerase chain reaction
Tris - Acetic – EDTA

TE
TGIV

Tris - EDTA 10 mM
Taiwan Grouper Iridovirus

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




5

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2
1.1. Tình hình trồng trọt trên thế giới và Việt Nam
2
1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới
2
1.1.2. Tình hình sản xuất lạc trong nước
3
1.2. Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới và Việt Nam

7
1.2.1. Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới
7
1.2.2. Tình hình bệnh hại lạc ở Việt Nam
14
1.3. Khái niệm về kiểm soát sinh học
16
1.4. Tại sao kiểm soát sinh học lại phổ biến
17
1.5. Những vấn đề trong kiểm soát sinh học
18
1.6. Cơ chế đối kháng
19
1.6.1.Cơ chế kháng sinh
19
1.6.2.Những hợp chất dễ bay hơi và enzim
21
1.6.3.Sự cạnh tranh
22
1.6.4.Sự kí sinh
23
1.6.5.Sự giảm độc tính
23
1.6.6.Kháng hệ thống (Sự kích kháng)
24
1.7.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong và ngoài nước
25
1.7.1.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở ngoài nước
25
1.7.2.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở trong nước

29
CHƢƠNG II.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
31
2.1.Vật liệu nghiên cứu.
31
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
31
2.1.2. Các môi trường phân lập vi khuẩn
31
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
31
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
33
2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng
33
2.2.2. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp đục lỗ thạch
34
2.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp cấy chấm điểm
35
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng
36
2.2.5. Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen
mã hóa phần tử 16S ARN riboxom
39
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




6

2.2.5.1. Phương pháp PCR thông thường (đơn)
2.2.5.2. Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ
2.2.5.3 Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR
2.2.5.4 Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen
a. Phương pháp tách dòng
b. Phương pháp giải trình tự gen
2.2.5.5 Phương pháp tin sinh học (sử dụng phần mềm NCBI, EBI, Expasy…)
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng
3.2. Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn
3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng
3.4. Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng
3.4.1.Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng
3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng đến quá trình nảy
của lạc
3.4.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R. solanacearum của các
chủng vi khuẩn đối kháng
3.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng lên quá trình sinh
trưởng và phát triển của lạc
3.5. Xác định vi trí phân loại các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phương pháp
giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN
CHƢƠNG V. KIẾN NGHỊ
CHƢƠNG VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

39
40
41
43
43
46
46
47
47
50
52
54
54
57
58
61
63
75
76
77


7

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn

Trang
47

phân lập được
Bảng 3.2 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn 50
gây bệnh héo xanh R. Solanacearum
Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của 8 chủng vi khuẩn đối kháng

52

Bảng 3.4 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng

55

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng lên khả năng nảy mầm

57

của hạt lạc

Bảng 3.6 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R. solanacearum của các

58

chủng vi khuẩn đối kháng trên lạc trong điều kiện nhà kính
Bảng 3.7 Các chỉ tiêu sinh trưởng của lạc khi có bổ sung

61

vi khuẩn đối kháng
Bảng 3.8 Kết quả so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng TH24 với

71

các chủng vi khuẩn trong ngân hàng gen quốc tế
Bảng 3.9 Kết quả so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng NA10 với

72

các chủng vi khuẩn trong ngân hàng gen quốc tế
Bảng 3.10 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên



73


8

MỤC LỤC HÌNH
Trang
Hình 3.1 Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng với

51

R. solanacearum BHT gây bệnh héo xanh lạc
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng

53

vi khuẩn đối kháng đại diện
Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn TH24 chụp dưới kính hiển vi

54

điện tử với độ phóng đại 20.000 lần
Hình 3.4 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các chủng

60

vi khuẩn đối kháng trên Lạc
Hình 3.5 Điện di đồ ADN tổng số của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu

64

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn nghiên cứu

65

Hình 3.7 Tuyển chọn các khuẩn lạc mang gen mã hóa đoạn 16S ARN riboxom 66
của các chủng vi khuẩn NA10 và TH24 bằng phương pháp colony PCR
Hình 3.8 Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen mã hóa phần tử 16S

67

riboxom của các chủng vi khuẩn đối kháng
Hình 3.9 Kết quả tinh sạch vectơ tái tổ hợp bằng enzim ARNaza

68

Hình 3.10 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của

70

chủng TH24
Hình 3.11 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của
chủng vi khuẩn NA10

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên



70


9

MỞ ĐẦU
Bệnh héo xanh cây trồng do khuẩn Ralstonia solanacearum là một bệnh
phổ biến và nghiêm trọng ở nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, lạc, ớt,
gừng... (1, 2, 54,58,57). Đây là bệnh chủ yếu làm giảm năng suất và mất mùa lạc
ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt nam, Indonesia... Hàng năm dịch
bệnh có thể gây thiệt hại từ 50-80% năng suất cây trồng. Tình hình gây hại là
như vậy nhưng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc
và vừng chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân
bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống
hiện có.
Kiểm soát dịch bệnh bằng phương pháp sinh học (kiểm soát sinh học)
đang dần trở thành xu hướng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nông
nghiệp ở nhiều nước trên thế giới. Bằng việc áp dụng các biện pháp sinh học

người ta có thể thay thế các loại thuốc trừ sâu hóa học có hại đến sức khỏe con
người và môi trường sinh thái. Trong đó biện pháp sử dụng vi sinh vật như một
tác nhân kiểm soát và phòng ngừa bệnh hại đang dần trở lên phổ biến (5, 7) vì
hiệu quả rõ rệt mà nó mang lại, các chủng vi sinh vật lựa chọn phải có hoạt tính
đối kháng cao, ổn định trong thời gian dài và không gây hại cho động, thực vật.
Với mục đích này tôi được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài “Tuyển chọn
và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia
solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc”.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




10

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình trồng lạc trên thế giới và Việt nam
1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới
Trong các loại cây trồng làm thực phẩm cho con người, lạc có vị trí quan
trọng. Mặc dù có nguồn gốc từ lâu đời nhưng tầm quan trọng kinh tế của cây lạc
36 được xác định cách đây khoảng trên 100 năm. Khi những xưởng ép dầu ở
Macxây (Pháp) bắt đầu nhập cảng lạc từ Tây Phi, mở đầu cho thời kỳ dùng lạc
ép dầu trên qui mô lớn. Công nghiệp ép dầu đã hình thành và phát triển nhanh
chóng ở các nước Châu Âu và lan ra trên toàn thế giới. Phần lớn diện tích trồng
lạc trên thế giới còn sản xuất theo lối cổ truyền, kỹ thuật canh tác lạc hậu. Những
năm gần đây nhờ ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất năng
suất lạc đã được nâng lên. Tuy nhiên các tiến bộ kỹ thuật ở các nước không đồng
đều, ở các nước phát triển năng suất lạc tăng nhanh còn ở các nước chậm phát
triển thì hàng năm năng suất lạc tăng không đáng kể. Các nước có năng suất lạc

tăng nhanh đó là: Mỹ trong vòng từ năm 1961 đến 1975 năng suất bình quân đã
tăng từ 1.564kg/ha lên 2.875kg/ha. Ở Trung Quốc chương trình nghiên cứu nâng
cao năng suất lạc được tiến hành từ 1979 và đã đạt được kết quả khả quan. Các
thành tựu về chọn giống lạc trong những năm 80 đã được ứng dụng vào sản xuất
tạo nên các điển hình năng suất cao như giống Nonghua 22 đạt năng suất trung
bình 4.219kg/ha ở miền trung và miền nam Trung Quốc. Ngoài ra nhiều giống
lạc mới có năng suất cao đã và đang được đưa ra sản xuất và mở rộng (5, 14).
Cây lạc được trồng ở tất cả các châu lục với trên 100 nước trên thế giới,
diện tích trồng lạc khoảng 20-21 triệu ha, năng suất biến động từ 11-12tạ/ha và
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....