Đánh giá khả năng chịu lạnh và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ các giống lúa Xuân Châu Hương, Q5, C27, Khang Dân, U17 và Nhị Ưu 63 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (281.17 KB, 27 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
TĂNG THỊ NGỌC MAI
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH
VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG
CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG,
Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên – Năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực. Một số kết quả đã được công bố cùng
TĂNG THỊ NGỌC MAI
PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công
trình nào khác.
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH
Tác giả DÒNG
VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN
CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG,
Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
Tăng Thị Ngọc Mai
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.46.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm
Thái Nguyên – Năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực. Một số kết quả đã được công bố
cùng PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì
công trình nào khác.
Tác giả
Tăng Thị Ngọc Mai
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào và
vi sinh), KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Di truyền - Sinh học hiện đại)
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình
hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại
học, bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ
nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô giáo, cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tác giả luận văn
Tăng Thị Ngọc Mai
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
i
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4D
2,4D – Axit dichlorphenoxyacetic
ADN
Axit deoxyribo nucleic
BAP
6 – Benzyl amino purin
bp
Cặp base (base pair)
cs
Cộng sự
cADN
Sợi ADN bổ sung tổng hợp từ mARN nhờ enzym phiên mã ngược
ĐC
Đối chứng
ĐVHĐ
Đơn vị hoạt độ
EDTA
Axit ethylen diamin tetra axetic
kb
Kilobase
MS
Môi trường Murashige và Skoog
mARN
ARN thông tin
NAA
Axit α – naphthyl axetic (α – naphthyl acetic acid)
PCR
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase
R0
Cây tái sinh từ mô sẹo
R1
Thế hệ thứ nhất của cây tái sinh
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA - Phân tích đa hình của ADN
được nhân bản ngẫu nhiên
TAE
Tris axetat EDTA
TTC
2,3,5, Trichloterazolium- chlorid
CTAB
Cetyl trimetyl amoni bromua
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ii
MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt .................................................................................. iii
Mục lục ................................................................................................................. i
Danh mục các bảng ............................................................................................ iv
Danh mục các hình .............................................................................................. v
MỞ ĐẦU....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về cây lúa ............................................................................................ 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa.............................................................................. 3
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa ........................................................................................ 3
1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam ................................................ 4
1.1.4. Đặc điểm sinh học của cây lúa nước ...................................................................... 6
1.2. Lạnh và cơ chế chịu lạnh...................................................................................... 7
1.2.1. Khái niệm về tính chịu lạnh của thực vật .............................................................. 7
1.2.2. Tác động của lạnh lên thực vật ............................................................................... 8
1.2.3. Cơ chế chịu lạnh của thực vật và khả năng khắc phục ........................................ 9
1.2.4. Tác hại của lạnh và tính chịu lạnh ở lúa .............................................................. 10
1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá và nâng cao khả năng
chống chịu ở cây trồng ......................................................................................11
1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả năng chống chịu
của cây trồng ở mức độ mô - tế bào ................................................................................ 11
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu ở
cây trồng ................................................................................................................... 12
1.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích hệ gen thực vật ...............14
1.4.1. Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) .................. 14
1.4.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ............................... 14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iii
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................17
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu .....................................................................................17
2.1.1. Vật liệu thực vật ..................................................................................................... 17
2.1.2. Hoá chất và thiết bị ................................................................................................ 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................18
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ........................................................ 18
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng .................................................................. 20
2.2.3. Phương pháp phân tích hoá sinh .................................................................... 21
2.2.4. Phương pháp phân tích sinh lý ........................................................................ 23
2.2.5. Phương pháp sinh học phân tử.............................................................................. 24
2.2.6. Xử lý kết quả và tính toán số liệu ......................................................................... 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................27
3.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu lạnh của các giống lúa ....................................27
3.1.1. Khả năng chịu lạnh của các giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm ..................... 27
3.1.2. Khả năng chịu lạnh của các giống lúa ở giai đoạn cây mạ ...................... 33
3.1.3. Khả năng chịu lạnh của các giống lúa ở mức độ mô sẹo .......................... 37
3.2. Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh của các giống lúa nghiên cứu
bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro .........................................................................45
3.2.1. Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu lạnh ............................................................... 45
3.2.2. Phân tích mức độ biến động di truyền quần thể R0 ............................................ 46
3.2.3. Kết quả phân tích đa hình ADN của một số dòng lúa nghiên cứu bằng kỹ
thuật RAPD .......................................................................................................47
3.2.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá lúa của một số dòng R1 có nguồn gốc
từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH ............................................................................. 48
3.2.3.2. Phân tích đa hình bằng kỹ thuật RAPD ............................................................ 49
3.2.3.3. Mối quan hệ di truyền giữa của các dòng lúa nghiên cứu ............................. 58
3.2.3.4. Kết luận phân tích đa hình ADN hệ gen của 5 dòng lúa có nguồn gốc từ mô
sẹo chịu lạnh giống XCH bằng kỹ thuật RAPD ................................................... 60
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................61
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ..................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................63
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống lúa nghiên cứu....................................................... 17
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu .........25
Bảng 3.1. Hàm lượng đường khử của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi
xử lý lạnh ở 120C ± 0,50C .........................................................................27
Bảng 3.2. Hoạt độ α - amylase của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi xử
lý lạnh ở 120C ± 0,50C ..............................................................................30
Bảng 3.3. Tương quan giữa hoạt độ α - amylase và hàm lượng đường khử ............32
Bảng 3.4. Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh ở 40C± 0,50C trong 32 giờ ở
giai đoạn mạ 3 lá của các giống nghiên cứu .............................................34
Bảng 3.5. Hàm lượng diệp lục trong lá lúa sau khi xử lý lạnh ở 120C ± 0,50C ở giai
đoạn mạ 3 lá của 6 giống lúa nghiên cứu .................................................35
Bảng 3.6. Khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh cây của các
giống lúa ...................................................................................................38
Bảng 3.7. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý lạnh ở 50C ± 0,50C và nuôi phục
hồi 3 tuần ..................................................................................................39
Bảng 3.8. Giá trị OD 485 nm của mô sẹo các giống lúa nghiên cứu .......................40
Bảng 3.9. Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau xử lý lạnh ........................41
Bảng 3.10. Khả năng tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý lạnh ...........................43
Bảng 3.11. Mức độ biến động một số chỉ tiêu nông học của quần thể R0 tái sinh từ
mô sẹo chịu lạnh của giống XCH .............................................................46
Bảng 3.12. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của 6 mẫu lúa nghiên cứu.................48
Bảng 3.13. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lúa khi phân tích với
10 mồi ngẫu nhiên ....................................................................................49
Bảng 3.14. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu
nhiên của 6 mẫu lúa nghiên cứu ...............................................................50
Bảng 3.15. Thống kê các phân đoạn ADN được nhân bản trong phản ứng RAPD với 6
mồi ngẫu nhiên...........................................................................................57
Bảng 3.16. Hệ số đồng dạng di truyền của các dòng của thế hệ R1 và giống gốc XCH.58
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ......................................................................18
Hình 3.1. Hàm lượng đường khử của 6 giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm
khi xử lý lạnh ở 120C ± 0,50C...................................................................29
Hình 3.2. Hoạt độ α - amylase của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi xử
lý lạnh ở 120C ± 0,50C ..............................................................................31
Hình 3.3. Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh 40C± 0,50C ở giai đoạn cây mạ
3 lá của các giống nghiên cứu ..................................................................34
Hình 3.4. Hàm lượng diệp lục của các giống sau khi xử lý lạnh ở 120C ± 0,50C ....36
Hình 3.5. Tỷ lệ mô sẹo sống sót sau khi xử lý lạnh và nuôi phục hồi .....................40
Hình 3.6. Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau xử lý lạnh ........................42
Hình 3.7. Khả năng tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý lạnh .............................43
Hình 3.8. Một số hình ảnh trong nuôi cấy in vitro ...................................................45
Hình 3.9. Kết quả điện di ADN tổng số tách từ 6 mẫu lúa của giống XCH ............48
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M2 ......................51
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M4 ......................52
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M7 ......................53
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M8 ......................54
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M10 ...................55
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M14 ...................56
Hình 3.16. Sơ đồ so sánh các dòng thế hệ R1 và giống gốc XCH ở mức độ phân tử khi
sử dụng các mồi M2, M4, M7, M8, M10, M14 ...........................................59
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của Việt Nam và nhiều nước khác
trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Á. Khoảng 40% dân số thế giới sử dụng lúa
gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia sản xuất và tiêu
thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất và mức tiêu thụ cao tập
trung ở khu vực châu Á. Ở Việt Nam, lúa là cây trồng chiếm vị trí quan trọng trong
nền kinh tế quốc dân. Lúa gạo không chỉ là nguồn cung cấp lương thực thiết yếu mà
còn là nguồn thu ngoại tệ đáng kể. Theo số liệu thống kê năm 2010 của Cục Trồng
trọt, sản lượng lúa cả nước năm 2010 ở mức 39,9 triệu tấn, trong đó, các tỉnh phía
Nam chiếm trên 23,5 triệu tấn, riêng vùng đồng bằng sông Cửu Long đạt sản lượng
21,5 triệu tấn với năng suất bình quân 5,47 tấn/ha [55], [57], [58].
Cây lúa (Oryza sativa L.) là loại cây trồng rất mẫn cảm với các điều kiện
ngoại cảnh. Các yếu tố ngoại cảnh bất lợi thường xuyên tác động đến quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây lúa là: nhiệt độ cực đoan, hạn hán hay ngập úng, độ
mặn, ánh sáng bất lợi… Một trong những yếu tố đó là nhiệt độ thấp. Vùng núi phía
Bắc, đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ là những khu vực thường xuyên chịu
ảnh hưởng của lạnh và đây cũng chính là nguyên nhân là giảm năng suất lúa của
vùng. Lúa vụ đông xuân chịu tác động mạnh nhất của nhiệt độ thấp. Vì vậy, nghiên
cứu khả năng chịu lạnh và tăng cường khả năng chống chịu với nhiệt độ thấp nhằm
nâng cao năng suất và ổn định sản lượng của các giống lúa là yêu cầu thiết thực đối
với các tỉnh miền Bắc và khu vục Bắc Trung Bộ [3], [4].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực nhằm cải tiến cây trồng,
đặc biệt trong chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại
cảnh bất lợi. Đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng đã được sử dụng và tạo
ra những giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao trong một thời gian ngắn
so với các phương pháp truyền thống [2].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‘‘Đánh giá khả
năng chịu lạnh và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
