BƯỚC đầu NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN AGLYCON TRONG HOA LOÀI HOA HUỆ (POLIANTHES TUBEROSA l)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ROÃN THỊ CHINH

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
THÀNH PHẦN AGLYCON TRONG HOA LOÀI HOA HUỆ
(POLIANTHES TUBEROSA L.)

Chuyên ngành: Hoá học

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Văn Khang

Thái Nguyên, năm 2016
1


2


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hợp chất thiên nhiên đã và đang có vai trò rất quan trọng trong đời sống
con người. Chúng là nguồn cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp,
nông nghiệp, mĩ phẩm, dược phẩm...Các hợp chất tìm thấy trong thiên nhiên có
hoạt tính sinh học tốt có thể được dùng trực tiếp trong y học [1-2] và chúng được
phát hiện ngày càng nhiều. Đến nay, hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng
chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng.
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thời tiết nóng ẩm nên có thảm thực

vật phong phú và đa dạng. Theo các số liệu thống kê mới nhất, có khoảng 3200
trong số 12000 loài thực vật được dùng làm thuốc chữa bệnh, đây là nguồn cung
cấp các hợp chất thiên nhiên quý báu.
Ở Việt Nam thực vật họ Thùa (Agavaceae) khá đa dạng[1], trong đó có
nhiều loài có giá trị sử dụng cao, được dùng làm thuốc chữa nhiều bệnh. Tuy nhiên,
việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài này chưa
đầy đủ, thậm chí có loài hầu như chưa được nghiên cứu. Hiện nay tỉ lệ người mắc
một số bệnh như: ung thư và các bệnh về thần kinh tăng nhanh ở Việt nam và trên
thế giới nên nghiên cứu các thực vật này là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực
tiễn.
Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành phần aglycon trong
hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)” nhằm góp phần nghiên cứu thành phần
hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này. Kết quả của đề tài sẽ góp phần
định hướng cho việc ứng dụng loài thực vật này để sử dụng trong chữa bệnh. Đồng
thời các kết quả của đề tài cũng góp phần nâng cao giá trị của loài thực vật này.
2. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Chiết xuất, phân lập aglycon trong sản phẩm thủy phân axit của hoa loài

Hoa huệ.
 Xác định cấu trúc của aglycon thu được bằng phương pháp vật lí.
3


3. Đối tượng nghiên cứu
Dịch chiết từ hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) trong các dung môi
có độ phân cực khác nhau.





4. Nội dung
Thu thập mẫu nghiên cứu.
Tổng quan về đối tượng nghiên cứu.
Phân lập các aglycon thừ mẫu nghiên cứu.
Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

 Cung cấp thông tin, cơ sở, làm tư liệu cho việc nghiên cứu sau này.
 Tì m hiể u nhữ n g đặ c trưng cấ u trú c nổ i bậ t củ a cá c hợ p chấ t có hoạ t tí n h và

khả năng biến đổi cấu trúc để có hoạt tính tốt hơn.
 Giải thích một cách khoa học một số kinh nghiệm dân gian trong ứng dụng
của Hoa huệ.
 Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên phục vụ cho giảng dạy ở trường
THPT sau này.
 Góp phần định hướng nuôi trồng, sử dụng và khai thác hợp lí loài Hoa huệ ở
Việt Nam.
 Tạ o cơ sở khoa học cho việ c sử dụng nguồn thực vật của Việt Nam một cách
hiệu quả.

4


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu sơ lược về loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)
1.1.1.Nguồn gốc
Hoa huệ có tên khoa học là Polianthes tuberosa L., thuộc họ Thùa
(Agavaceae). Đây là loài cho hoa quanh năm, có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và

hiện nay đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới như: Việt Nam, Singapore,
Indonexia, Iran,...Loài thực vật này đã được du nhập vào Việt Nam từ lâu và hiện
nay, Hoa huệ đang được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam, đặc biệt là
các vùng trồng hoa lân cận Hà Nội.
1.1.2.Phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vật học:
•

Giới : cây trồng (Plantae).

•

Lớp : một lá mầm (Monocotylendon).

•

Bộ : hành (Liliadae).

•

Họ : thủy tiên (Amaryllidaceae), sau này xếp vào họ Thùa (Agavaceae).

Ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm của hoa thì chia thành 2 giống, chủ
yếu là huệ đơn và huệ kép :
- Huệ đơn (huệ xẻ) : cây thấp, mảnh khảnh, cánh hoa nhỏ, bông chỉ có một
lớp cánh nhưng hương thơm rất đậm.
- Huệ kép (huệ tứ diện): cây cao, hoa dày và bông dài hơn huệ đơn nhưng
hương thơm kém hơn[3].

5

a) Hình ảnh của giống huệ đơn

b) Hình ảnh của giống huệ kép
Hình 1.1: Hình ảnh loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)
1.1.3. Đặc điểm thực vật học
Cây Hoa huệ là cây ưa ánh sáng, cho hoa quanh năm. Tuy nhiên, Hoa huệ
nở chủ yếu vào mùa hè còn mùa đông cho ít hoa, hoa nhỏ, bông ngắn hơn.
- Thân : Hoa huệ thuộc cây thân thảo, thân hành, hay còn gọi là thân giả
được kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp chồng lên bẹ lá sau,
thân thẳng đứng, không phân nhánh, vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,81m.

6


- Lá : cây Hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống góc lá
rộng và to thành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân
biệt rõ ràng, chiều dài lá khoảng 20-30cm, bề rộng của lá từ 0,5-1cm.
- Hoa : Hoa huệ có màu trắng, bao hoa hình phễu, nhị gắn giữa ống bầu,
hoa có vị ngọt, hơi chát, thơm, không độc. Hoa huệ có cấu tạo cánh khá đặc biệt,
khi không khí có độ ẩm cao, những khí khổng (lỗ trao đổi khí) trên cánh hoa tự
động mở to để dầu thơm thoát ra ngoài. Ban đêm tuy không có nắng, nhưng độ
ẩm không khí lại cao hơn ban ngày, cho nên các khí khổng mở to cho mùi thơm
thoát ra (mở túi thơm). Chính vì thế, ban ngày Hoa huệ chỉ toả hương thoang
thoảng, nhưng ban đêm nó lại thơm ngào ngạt. Hoa huệ toả mùi thơm theo độ ẩm,
vì vậy không chỉ ban đêm, mà vào ban ngày, kể cả khi trời mưa, độ ẩm không khí
cao, Hoa huệ cũng thơm hơn ngày nắng. Tập tính nở về đêm của Hoa huệ hình
thành qua quá trình tiến hóa. Do hoa tỏa ra mùi thơm để thu hút côn trùng đến thụ
phấn, duy trì nòi giống, vì vậy hoa thụ phấn nhờ vào các loại côn trùng hoạt động

vào ban đêm đặc biệt là Hoa huệ thụ phấn nhờ bướm đêm, nên phải nở vào ban
đêm để thu hút những loài côn trùng này. Nhiều người cho rằng hương thơm của
Hoa huệ không tốt cho sức khoẻ nên ít ai cắm Hoa huệ trong phòng ngủ, nếu có
thì ban đêm phải đưa ra ngoài sân. Ở Việt Nam, Hoa huệ là thứ hoa được dùng
nhiều trong việc cúng, lễ mà ít dùng để tặng nhau.
- Củ và rễ : cây Hoa huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ
yếu ở lớp đất mặt 0-15cm, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây, màu nâu,
có dạng như quả lê, to 10-12cm [3].
Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu chủ yếu trên hoa của loài Hoa huệ.
1.2. Các nghiên cứu sử dụng trong y học dân gian
Từ lâu trong dân gian đã sử dụng loài Hoa huệ để chữa bệnh sốt rét, ngoài
ra Hoa huệ còn có tác dụng lợi tiểu, gây nôn và củ huệ được dùng để làm thuốc
đắp ngoài da để giảm đau trong các trường hợp đau do thấp khớp, do bong gân,
do ngã, do đòn đánh. Nhưng do thành phần hoá học của củ huệ có 12 ancaloit
7


khác nhau nên có thể gây ngộ độc khi ăn phải. Vì vậy, sau khi đắp thuốc cho
người bệnh phải rửa sạch tay và dụng cụ cắt, giã. Nếu sơ ý cầm thức ăn trong khi
làm thuốc, tay có dính dịch thuốc chưa rửa, cần phải pha ngay nước chè (búp hay
lá xanh) đặc uống để giải độc[2].
1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
Đến nay, một số nghiên cứu đã công bố về thành hóa học của Hoa huệ đã
được đăng tải. Các kết quả cho thấy thành phần chính là các saponin có chứa các
sapogenin như hecogenin, tigogenin và một số aglycon khác, trong đó, tigogenin
là aglycon có hàm lượng lớn nhất trong loài Hoa huệ, thể hiện một loạt các hoạt
tính sinh học có giá trị như: ức chế tế bào ung thư, chống viêm, chống oxi hóa và
có vai trò trong điều trị bệnh tiểu đường.
Các aglycon đã phân lập ra từ loài thực vật này được xác định là saponin có
khung aglycon là spirostanol như: tigogenin, hay furostanol như hecogenin, 9dehydroxyhecogenin và 5α-spirostan-12-one, một số khung đã được mở dị vòng 6

cạnh chứa oxi[4-14]. Các ví trí số 3 và 26 (dạng mở vòng) thường có các liên kết
glycozit với một hoặc nhiều phân tử đường.

Hình 1.2: Cấu trúc của một số aglycon có trong saponin đã phân lập
được từ loài Hoa huệ.
Năm 2000, Mimaki và cộng sự [8] đã phân lập các hợp chất từ một số bộ
8


phân của loài thực vật này, kết quả cho thấy các chất này thuộc dạng saponin có
khung aglycon dạng cholesterol, (25R)-6α-hydroxy-5α-spirostan-3β-ol, hecogenin
và 5α-spirost-9-en-12-one (9-dehydroxyhecogenin).
Đến năm 2002, cũng nhóm nghiên cứu của Mimaki và cộng sự [7] đã tiếp tục
đăng tải việc phân lập các saponin từ phần dưới mặt đất của loài Hoa huệ thu được
các chất có khung aglycon là 5-alpha-spirostan-12-one liên kết với 5 phân tử
đường.

Năm 2004, Yang và cộng sự [15] phân lập từ Hoa huệ tươi 14 hợp chất
saponin thuộc dạng spirostanols và furostanol và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào
ung thư HeLa. Các hợp chất này có khung aglycon là tigogenin, chlorogenin, 5αfurost-3β,22α,26-triol, terrestrosin I.

9


Bên cạnh các hợp chất saponin đã phân lập được được báo cáo qua các
công trình đã công bố, trong loài Hoa huệ còn có nhiều tinh dầu và các thành dễ
hóa hơi. Thành phần hóa học và hàm lượng được xác định dựa trên phương pháp
GC/MS. Hơn ba mươi thành phần hóa học đã được nhận diện có trong loài hoa
này bằng các phương pháp chiết xuất khác nhau như: chiết xuất bằng lôi cuốn hơi
nước, chiết siêu âm siêu tới hạn, chiết xuất bằng dung môi hữu cơ.

10


Hình 1.3: Sắc ký đồ GC của nước ép Hoa huệ[13]
Bảng 1.1: Thành phần các chất trong nước ép Hoa huệ [13]
TT Peak Thời gian lưu(min) % Diện tích píc
Chất
1

10.996

30.17

Metyl benzoat

2

12.896

12.11

Metyl salicylat

3

14.567

1.78

Indole

14.818

1.47

(E)-citral

5

15.297

4.45

metyl anthranilat

6

16.021

1.80

metyl eugenol

7

17.306

8.83

(E)-metyl isoeugenol

8

17.373

13.33

7-decen-5-olit

9

20.755

2.43

(z)-beta-farnesene

10

21.943

23.64

benzyl benzoat

4

11

Hình 1.4: Sắc ký GC của dịch chiết n-hexan của Hoa huệ [13]
Bảng 1.2: Thành phần hóa học trong dịch chiết n-Hexan của Hoa huệ [13]
TT

Thời gian lưu(min)

% Diện tích píc

Chất

1 Peak

14.804

3.70

(Z)-3-hexenyl

2

16.009

1.07

oxopropanoate
metyl
eugenol

3

16.744

2.32

metyl isoeugenol

4

17.294

1.89

(E)-metyl isoeugenol

5

17.364

14.96

7-decen-5-olit

6

17.494

8.36

2,4,-di-tert-butylphenol

7

18.449

8.85

1-hexadecene

8

20.736

1.94

alpha-farnesol

9

21.901

24.25

benzyl benzoat

10

24.198

1.39

benzyl salicylat

11

26.245

4.96

ecosanol

12

32.440

2.47

tricosane

13

36.972

19.23

pentacosane

14

43.542

4.60

heptacosane

1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài Hoa huệ
12


Loài Hoa huệ thuộc thực vật họ Thùa (Agavaceae) từ lâu đã được sử dụng
để chữa một số bệnh như : trị viêm nhiễm, thấp khớp,.... Gần đây, nhiều nghiên
cứu đã chứng minh dịch chiết và các hợp chất được phân lập từ loài thực vật này
có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, có khả năng bảo vệ các tế bào não
dưới các tác động của glutamat, hyperglycemia, β-amyloid và nhiều tác dụng
khác[2,4-6,5-7].
Các hợp chất đã phân lập được từ loài Hoa huệ chủ yếu thể hiện khả năng
ức chế các dòng tế bào ung thư như ung thư máu HL-60 [7-8], tế bào ung thư biểu
bì miệng HSC-2 [8], tế bào ung thư HeLa [9] và một vài dòng tế bào ung thư
khác. Bên cạnh khả năng ức chế tế bào ung thư, các hợp chất tách ra còn thể hiện
khả năng chống oxi hóa [9] và đây là một trong những cơ sở để tiến hành các
nghiên cứu bảo vệ tế bào. Đồng thời các hoạt tính này cũng bước đầu định hướng
cho việc nghiên cứu ứng dụng loài thực vật này.
1.5. Nghiên cứu về aglycon được tách ra từ loài Hoa huệ
Trong số các aglycon được phân lập ra từ loài này thì hecogenin, tigogenin
là hai trong số aglycon được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Các aglycon này
thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư, bảo vệ tế bào và ức chế các enzym gây
ra bệnh Alzheimer. Tuy nhiên hoạt tính của chúng thường không cao và có độc
tính lớn nên thường được làm nguyên liệu đầu cho các quá trình bán tổng hợp
hữu cơ.
Năm 2010, Poza[10] và các cộng sự đã tổng hợp dãy chất mới cephalostatin/

ritterazine từ hecogenin và 22-epi-hippuristanol thông qua sự khử và đồng phân
hóa và các phản ứng ngưng tụ giữa enaminoxeton và α-hydroxyxeton. Các dẫn
xuất tổng hợp được được tiến hành thử khả năng ức chế tế bào ung thư MDAMB-231, A-549, và HT-29. Kết quả cho thấy các dẫn xuất mới này có hoạt tính
mạnh hơn các 22-epi-hippuristanol.

13


Hình 1.5: Cephalostatin/ritterazine từ hecogenin axetat
Cũng trong năm 2010 [11], María và cộng sự tổng hợp dẫn xuất 26hydroxy-22-oxocholestanic từ hecogenin và bước đầu đánh giá hoạt tính của nó
trên dòng tế bào ung thư CaSki, các kết quả cho thấy sự tăng hoạt tính với dòng tế
bào này, đồng thời làm giảm độc tính của chúng so với chất đầu.

Hình 1.6: Trích mục sơ đồ tổng hợp 26-hydroxy-22-oxocholestanic
Năm 2012, Kelly Barbosa Gama đã nghiên cứu về hecogenin và các dẫn
xuất của nó. Nghiên cứu này đã được thực hiện để đánh giá axetat hecogenin có
các tính chất hạ sốt và kháng viêm.

Năm 2015[16], Gasparotto và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế tác dụng của
hecogenin axetat, kết quả đã đưa ra một phổ rộng hoạt tính dược lý. Ở đây, họ
cũng đã khảo sát ảnh hưởng của hecogenin axetat trên một dòng tế bào ung thư
14


phổi ở người. Hecogenin axetat có tác dụng ức chế đáng kể sự gia tăng các loại
phản ứng trong tế bào gây ra bởi H2O2.
Nhận xét: Qua đây, ta nhận thấy rằng thành phần hóa học quan trong nhất
trong loài Hoa huệ là các saponin có khung cacbon là spirostanols và futostanols.
Bên cạnh đó tinh dầu cũng góp phần quan trọng tạo nên sự đa dạng về thành phần
hóa học của loài thực vật này.

15


Chương 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nghiên cứu lí thuyết
Tìm kiếm, thu thập thông tin, tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước.
Trao đổi, học hỏi kinh nghiệm từ thầy cô, bạn bè.
2.1.2. Nghiên cứu thực nghiệm
2.1.2.1. Phương pháp xử lí và chiết mẫu
Từ mẫu khô, xử lý bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi
thích hợp để thu được các cao chiết dùng cho nghiên cứu.
Nguyên tắc lựa chọn dung môi: dung môi chiết phải có độ phân cực phù
hợp với aglycon. Đối với aglycon chưa biết thì bắt đầu thăm dò từ dung môi kém
phân cực đến dung môi phân cực mạnh.
2.1.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các aglycon
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các aglycon, sử dụng các
phương pháp sắc ký như: Sắc ký cột thường sử dụng silicagel cỡ hạt 230400/mesh; sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng nhôm
silicagel tráng sẵn (dày 0,2 mm). Hiện màu với thuốc thử là dung dịch H 2SO4 và
đèn UV 254 nm.
2.1.2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp
phổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H và cacbon 13C và các phương pháp
khác.
2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết, khi
dùng cho sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung
môi được sử dụng là: n-hexan, etylaxetat (EA), clorofom, etanol là các dung môi tinh

khiết.
16


Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và

13

C-NMR được đo trên máy

Bruker 500MHz.
2.3. Nghiên cứu định tính các nhóm chất trong dịch chiết loài Hoa huệ[3]
2.3.1. Định tính polyphenol
- Phản ứng với muối sắt (III)
Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà
cho màu lục, xanh hoặc nâu.
- Tác dụng với H2SO4 đặc
Khi nhỏ H2SO4 lên các dẫn xuất của flavon và flavonol thì cho màu vàng
đậm, đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi; flavanon cho màu
đỏ da cam do sự chuyển thành chalcon.
2.3.2. Định tính alkaloit
* Các thuốc thử sử dụng
-

Thuốc thử Dragendorff
Dung dịch A: Hòa tan 0,05 g bitmut nitrat (Bi(NO 3)3 .5H2O) trong 20 mL
dung dịch axit axetic 20%. Dung dịch B: 5 mL dung dịch KI 40% trong nước.
Trước khi sử dụng trộn 20 mL dung dịch A, 5 mL dung dịch B và 70 mL H2O.

-

Thuốc thử Mayer
Dung dịch A: hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60mL H2O. Dung dịch B: Hòa tan
5g KI trong 10mL H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước vừa đủ 100mL.
* Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết cho thêm 5 mL H2SO4 5%, khuấy đều, lọc
qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL nước lọc axít rồi thêm:

-

Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính.
* Hiện tượng
- Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam.
- Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.

2.3.3. Định tính các flavonoit
17


* Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% và bột Mg kim loại.
* Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết thêm 10mL CH3OH, đun nóng cho tan và
lọc qua giấy lọc. Lấy 2mL nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim
loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút đến
và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các
flavonoit .
* Hiện tượng: Dịch metanol có màu hồng. Khi thêm thuốc thử thì có màu hồng
hơn.
2.3.4. Định tính các cumarin
* Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%
* Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 mL dịch thử, cho vào một

trong hai ống đó 0,5 mL dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách
thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4mL nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có
kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá ống
nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốt
hoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính.
2.3.5 Phản ứng của Steroit
Phản ứng Liebermann – Burchardt: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn
glycozittim 1ml anhydrit axetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 45 0, cho từ
từ theo thành ống 0,5ml axit sunfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở
mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất
lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
2.4. Nghiên cứu các aglycon từ hoa loài Hoa huệ
2.4.1 Mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là mẫu khô hoa loài Hoa huệ được bảo quản cẩn thận
trước khi tiến hành nghiên cứu.
2.4.2. Phân lập các hợp chất
Mẫu khô (3kg) sau khi lấy về được chiết hồi lưu với etanol 90% ở nhiệt độ
70˚c trong thời gian 3h và lặp lại 3 lần. Cất thu hồi dung môi được 700 gam cặn
18


chiết etanol, sau đó chiết với cloroform để loại diệp lục và chất béo. Phần dịch
chiết được tiến hành thủy phân trong dung dịch H 2SO4 10% trong thời gian 6 giờ
có đun hồi lưu. Sau khi kết thúc thủy phân, hỗn hợp được trung hòa đến môi
trường trung tính bằng NaOH đặc. Phần chất rắn và dung dịch được chiết với các
dung môi cloroform, etyl axetat. Cất thu hồi dung môi được các cao chiết tương
ứng có khối lượng là: 50 gam; 50 gam.
Cao chiết cloroform được tiến hành sắc ký cột silicagel (500 g) với hệ dung
môi n-hexan:axeton = 25:1 (v/v), trên cột có kích thước 9 x 60 cm với hệ dung
môi rửa giải là PE/Axeton với tỉ lệ từ 50/1-5/1 (v/v) thu được 7 phân đoạn. Phân

đoạn 2 gồm các ống số 6 đến 10 được gộp lại, được tiến hành sắc ký cột silicagel
lần 2 với hệ dung môi n-hexan:EA = 15:1 (v/v), kết tinh lại thu được 2 chất tinh
khiết : 30 mg chất rắn 1 không màu và 20mg chất rắn 2 màu trắng vô định hình.
Chất rắn 1 và 2 được đem đo các phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu
trúc.
Sơ đồ 2.1 : Sơ đồ nghiên cứu hoa loài Hoa huệ.
3 kg mẫu hoa
- Thủy phân bằng axit H2SO4 đặc
- Trung hòa bằng NaOH
- Lọc thu cặn
- Chiết lần lượt trong cloroform, etylxetat
- Làm nhỏ
- Chiết trong etanol (90%)

Cao etyl axetat
55g
Phần không tan
Cao cloroform
50 g
Cặn chiết etanol
700 g

19


Sơ đồ 2.2 : Sơ đồ phân lập hợp chất 1 và 2.
Phân đoạn1
ống 01-05
Phân đoạn 3
ống 11-15

Phân đoạn 2
ống 06-10
Phân đoạn 4
ống 16-18
Phân đoạn 6
ống 23-25
Phân đoạn 5
ống 19-22
Phân đoạn 7
ống 26-28

- Sắc kí cột silicagel
- Hệ dung môi n-hexan:axeton = 25:1 (v/v)

Cao CHCl3
( 50g)
Kết tinh lại thu được 20mg Chất rắn 2
Kết tinh lại thu được 30mg Chất rắn 1
Xác định cấu trúc
- Sắc kí cột silicagel
- Hệ dung môi n-hexan:EA = 15:1 (v/v)

20


Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định tính các nhóm chất của cao chiết tổng số
Kết quả định tính nhóm chất trong dịch chiết etanol 90% của loài Hoa huệ
được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 3.1: Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ
có trong dịch chiết etanol 90% của hoa loài Hoa huệ
Số TT

Nhóm chất

Phản ứng

Kết quả

1

Phenolic

dd FeCl3 5%

Xanh nhạt

H2SO4 đặc

Màu hồng

Dragendoff

Không rõ

Mayer

Không rõ

2

Alkaloit

3

Flavonoit

Mg/HCl đặc

Xuất hiện màu đỏ nhạt

4

Coumarin

NaOH đặc

Có vẩn đục màu vàng
nhạt

5

Steroit

Phản ứng

Hiên tượng rõ

LiebermannBurchardt

Từ kết quả phân tích ở bảng trên ta thấy trong dịch chiết etanol của hoa
loài Hoa huệ có mặt nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học như hợp chất
phenol, flavonoit, coumarin, steroit. Các nhóm hợp chất này có ý nghĩa trong
việc ứng dụng làm thuốc chữa bệnh: flavonoit có tác dụng chống oxi hóa, tác
động lên enzim, các bệnh tim mạch; hợp chất phenol có tác dụng kháng sinh,
chống viêm; steroit có tác động tới hệ thần kinh, điều trị ung thư, diệt khuẩn,
hạ huyết áp; coumarin có tác dụng chống đông máu, giảm đau, loãng xương,
làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi, có tác dụng chống co thắt, một số
chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật… Đây là cơ sở để tiến hành các
nghiên cứu tiếp theo.
21


3.2. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc
3.2.1. Kết quả phân lập các hợp chất
Mẫu hoa khô (3kg) sau khi lấy về được đem nghiền nhỏ và chiết hồi lưu
với etanol 90% ở nhiệt độ 70˚ c trong thời gian 3h và lặp lại 3 lần. Dịch chiết
được tiến hành thủy phân trong dung dịch H 2SO4 10% trong thời gian 6 giờ có
đun hồi lưu thu được phân rắn và dung dịch. Phần chất rắn và dung dịch được
chiết với các dung môi cloroform, etyl axetat. Cất thu hồi dung môi được các
cao chiết tương ứng có khối lượng là: 50 gam và 55 gam. Tiến hành sắc ký cột
silicagel (500 g) trên cột có kích thước 9 x 60 cm với hệ dung môi rửa giải là
PE/Axeton với tỉ lệ từ 50/1-5/1 (v/v) thu được 2 chất tinh khiết 1 và 2.
3.2.2. Kết quả xác định cấu trúc
3.2.2.1. Chất 1
Kết quả dữ liệu phổ của chất 1 được tổng hợp ở Bảng 3.2 và các hình
dưới đây.
Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của 1 và hợp chất tham khảo.
13

Số liệu đo C
Ví trí

1

NMR (ppm) chất
1

Số liệu tham khảo

H NMR (ppm), J (Hz)

Stigmasterol

chất 1

13

C NMR (ppm)[12]
1

37,21

37,24

1,53-1,78 (m)

2

31,62

31,65

1,16-1,78 (m)

3

71,81

71,81

3,53 (m)

4

42,29

42,30

1,40-1,67 (m)

5

140,72

140,74

6

121,71

121,73

5,35 (br d, 3,5)

7

31,87

31,90

1,40-1,95 (m)

8

31,88

31,91

1,78 (m)
22


9

50,08

50,15

1,76 (m)

10

36,48

36,51

11

21,08

21,09

1,56 (m); 1,67 (m)

12

39,65

39,77

1,55 (m); 1,65 (m)

13

42,29

42,30

14

56,83

56,87

15

24,35

24,37

16

28,92

28,93

17

55,90

56,05

18

12,03

11,99

0,84 (s)

19

19,38

19,41

1,03 (s)

20

40,50

40,51

21

21,05

21,22

0,91 (d, 6,6)

22

138,32

138,33

5,16 (dd, 8,5, 15,4)

23

129,22

129,27

5,03 (dd, 8,5, 15,4)

24

51,21

51,24

2,01 (m)

25

31,87

31,90

1,87 (m); 1,89 (m)

26

21,20

21,22

0,84 (t, 8,5)

27

25,40

25,41

1,98 (m)

28

18,95

19,04

0,81 (d, 6,9)

29

12,25

12,26

0,86 (d, 9,6)

2,03 (m)

23


Hình 3.1: Phổ 1H NMR của chất 1

Hình 3.2: Phổ 13C NMR của chất 1.

24


Hợp chất 1 thu được dưới dạng tinh thể màu trắng. Phổ 1H-NMR thấy
xuất hiện tín hiệu của nhóm β-OH (δH 3,53, m, H-3). Trên phổ cộng hưởng
proton cũng xác nhận sự có mặt của liên kết đôi tại δH 5,32 (br s) và một liên
kết đôi trans khác tại δH 5,16 (dd, 8,5, 15,4) /5,03 (dd, 8,5, 15,4). Tín hiệu cộng
hưởng của 2 nhóm metyl bậc ba tại δH 0,84 (s), 1,03 (s); 3 nhóm metyl bậc hai
tại δH 0,91 (d, J = 6,6 Hz), 0,81 (d, J = 6,9 Hz), δH 0,86 (3H, d, J = 9,6 Hz) và
1 nhóm thế metyl bậc một tại δH 0,84 (t, J = 8,5 Hz). Phổ

13

C-NMR của 1

xuất hiện 29 tín hiệu cacbon, đặc biệt, tín hiệu của hai cặp olefin được xác
nhận tại C-5 (δC 140,75)/C-6 (δC 121,73) và C-22 (δC 138,33)/C-23(δC 129,27).
Dựa vào các phân tích trên và kết hợp so sánh số liệu phổ 13C-NMR của 1
với các số liệu đã được công bố của stigmasterol[12] thấy hoàn toàn phù hợp.
Như vậy, 1 có thể được khẳng định là stigmasterol (C29H48 O).

Hình 3.3: Cấu trúc của stigmasterol
3.2.2.2 .Chất 2

Kết quả dữ liệu phổ của chất 2 được tổng hợp ở Bảng 3.2 và các hình dưới đây.
Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của 2 và hợp chất tham khảo.
13

Ví trí

Số liệu đo C

1

Số liệu tham khảo
25

H NMR (ppm), J (Hz) của