PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
------------------

BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM

Chủ đề báo cáo:
Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả
năng sản xuất protease dùng để thủy phân
protein trong phế liệu thủy sản

Nha Trang-2016


2

Chủ đề báo cáo: Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sản
xuất protease dùng để thủy phân protein trong phế liệu thủy sản.

Tên chủ đề nghiên cứu:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS


3

I.

LỜI MỞ ĐẦU:

Hiện nay trên toàn cầu, có gần 70 triệu tấn thủy sản đang được chế biến ở dạng philê,
đông lạnh, đóng hộp hoặc ngâm tẩm. Hầu hết các quá trình này đều thải ra một số lượng
lớn các loại phụ phẩm và phế phẩm.
Cụ thể, trong năm 2011, trong khi sản lượng khai thác cá ngừ toàn cầu đạt khoảng
4,76 triệu tấn, thì lượng sản phẩm cá ngừ đóng hộp chỉ có gần 2 triệu tấn. Chất thải rắn
hoặc các phụ phẩm được thải ra từ sản xuất cá ngừ đóng hộp (bao gồm đầu, bộ xương,
nội tạng, mang, phần thịt màu sẫm, vây bụng và da) có thể chiếm khoảng 65% lượng
nguyên liệu ban đầu. Các số liệu báo cáo trong ngành sản xuất thịt cá ngừ cũng cho thấy
các phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 50% tổng nguyên liệu ban đầu. Khi philê cá, sản


4

phẩm đạt được thường chỉ chiếm khoảng 30-50% so với lượng nguyên liệu ban đầu. Sản
lượng cá hồi toàn cầu năm 2011 đạt khoảng 1,93 triệu tấn và hầu hết là các sản phẩm ở
dạng philê, sản phẩm này cũng được báo cáo đạt khoảng 55% tổng khối lượng nguyên
liệu. Một lượng lớn các sản phẩm philê cá rô phi và cá tra hiện cũng đang được bán trên
thị trường với hiệu suất philê đạt khoảng 30-37% cho cá rô phi và 35% cho cá tra.
Có thể thấy, ngành chế biến thủy sản đã và đang tạo ra một lượng đáng kể các phế
phẩm, phụ phẩm và thịt vụn từ các thành phần như đầu, bộ xương, bụng, gan và trứng.
Đây là những bộ phận chứa protein chất lượng cao, axit béo omega-3, vi chất dinh
dưỡng (như vitamin A, D, riboflavin, niacin) và khoáng chất (như sắt, kẽm, selen và iốt). Vì vậy, việc tối đa hóa gia trị thặng dư nhằm đảm bảo lợi nhuận tối đa cho các
doanh nghiệp chế biến là vô cùng quan trọng. Trong đó, việc tận dụng các protein từ phế
phẩm thủy sản sẽ đem lại giá trị kinh tế cao.
Với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện nay thì việc ứng dụng từ vi sinh vật
khá phổ biến bởi vi sinh vật dễ nuôi cấy, vòng đời ngắn, sinh sản nhiều, chi phí thấp…
này có khả năng sản xuất protease có hoạt tính cao và nhiều ưu thế hơn hẳn.


5

Hiện nay đã có nhiều doanh nghiệp thành công trong việc ứng dụng vi sinh vật thủy
phân protein từ phế phẩm thủy sản. Thời gian gần đây, một số nhà khoa
học đã tiến hành nghiên cứu sử dụng protease trong chế biến
thủy sản nhưng các nghiên cứu này vẫn chưa đầy đủ và cần được
tiếp tục. Nguồn protease từ vi sinh vật nhất là vi khuẩn Bacillus
subtilis là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng vì loại vi sinh vật
này có khả năng sản xuất protease có hoạt tính cao và nhiều ưu thế
hơn hẳn.
Với chủ đề báo cáo được chọn là: “Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng
sản xuất protease dùng để thủy phân protein trong phế liệu thủy sản”, chúng em đã
chọn chủ đề “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis” . Đây là
vi sinh vật có khả năng thủy phân protein trong phế liệu thủy sản. Đây
là một đề tài được nhiều nhà khoa học trẻ nghiên cứu và có thể phát
triển trong tương lai.
I.

NỘI DUNG:
1. Giới thiệu chung:
1.1.

-

Một số vi sinh vật thủy phân protein:

1.1.1. pseudomonas sp.p :
Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens là một loài vi khuẩn hình roi gram âm. Nó thuộc

chi Pseudomonas, dựa vào phân tích 16S rRNA nó được đặt vào nhóm P.
fluorescens của chi. Đối với ĐVTS khi còn sống: VSV tồn tại trên da (nhớt) số

-

lượng tứ 10 2 -105 tb/cm2: Pseudomonas fluorescens,
Trong quá trình bảo quản và chế biến: VSV cũng nhiễm vào nguyên liệu với số

-

lượng phụ thuộc vào phương pháp bảo quản và chế biến.
Khi ĐVTS chết, kháng thể không còn --> VSV sẽ phát triển rất mạnh, đặc biệt là
nhóm Pseudomonas, khi ươn thối số lượng VSV tăng lên đến 107-1010tb/gam.


6

1.1.2. Bacilus sp.p:
-

Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dưới
kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do đó, một số nơi gọi

-

là khuẩn que hoặc trực khuẩn.
Tuy nhiên, Bacillus (viết hoa và in nghiêng) là tên của một chi gồm các vi khuẩn
hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong Firmicutes. Trong
đó, B. subtilis là chủng được ứng dụng phổ biến trong thủy phân protein trong phế
phẩm thủy sản.
1.2.

Giới thiệu về B. subtilis:

1.2.1. Đặc điểm

-Điều kiện phát triển : hiếu khí, nhiệt độ tối ưu: 370C.

nuôi cấy:


7

- Điều kiện oxi: B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi
trường thiếu oxi.
- Độ Ph: thích hợp Ph= 7.0- 7.4.
- Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, tâm
sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính: 3-5 mm. sau 1-4 ngày, bề mặt
nhăn nheo, màu hơi sẫm.
- Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạ thành màu xám, rìa gợn sóng
- Môi trường canh TSB: B.subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng
cạn, kết lại như vầng mây ở đáy, khí tan đều.
- Dinh dưỡng cần các nguyên tố: C, H, O, N và các nguyên tố khác…
1.2.2. Đặc điểm phân bố:
-Vi khuẩn B.subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được phân bố
hầu hết trong tự nhiên: cỏ khô, bụi, đất, nước,…
-Phần lớn chúng tồn tại ở đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng: 10- 100 triệu
CFU/ gam.
-Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì B. subtilis rất hiếm.
-Nước và bùn ở cửa sông cũng như ở nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh
dưỡng B.subtilis.
1.2.3. Đặc điểm hình thái:
-B.subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0.5- 0.8 x 1.8- 3.0µ,

đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động 8- 12 lông.


8

-Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước 0.8- 1.8 µm, phát triển
bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm,
tia tử ngoại, tia phóng xạ.
1.2.4. Đặc điểm sinh hóa:
- Lên men không sinh hơi: các loại đường glucose, maltose, manitol, saccarose, xylose,
arabinose
- Indol(-), nitrat (-), VP (+), H2S(-), NH3 (+), catalase(+) , amylase (+), casein(+), citrat(+)
có khả năng di động hiếu khí.
- dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tác
động của hymolysine.
1.2.5. Cấu trúc kháng nguyên:
- B.subtilis có kháng nguyên H, O cấu trúc kháng nguyên D, L- acid glutamic
- Sản sinh kháng sinh subtiline và baccitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-,
- Bệnh học: đa số chủng B.subtilis không gây bệnh.
1.2.6. Ứng dụng:
- Bacillus subtilis trong sản xuất enzyme công nghiệp
Theo thống kê, Bacillus subtilis sản xuất số lượng 50% tổng số enzyme cung cấp cho các
lĩnh vực công nghiệp enzyme như thực phẩm, tẩy rửa, dệt may, da, giấy, thuốc men…
-

Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong lĩnh vực kiểm soát sinh học

Bacillus subtilis dùng để kiểm soát sinh học các bệnh thực vật, giúp ngăn ngừa và điều trị
nhiều loại bệnh ở cây trồng như bệnh phấn trắng, sương giá, bệnh do nấm …
-

Bacillus subtilis ứng dụng trong sinh học phân tử vi sinh vật học.


9

Bacillus subtilis có thể biểu hiện 200 loại gen khác nhau nên được sử dụng trong các thí
nghiệm về biến đổi gen, chuyển gen …
-

Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong phụ gia thực phẩm

Bacillus subtilis được phép sử dụng trong thực phẩm vi không gây độc hại, cải thiện chức
năng đường ruột động vật, thúc đẩy sự tăng trưởng động vật và ngăn ngừa bệnh tật.
Bacillus subtilis có thể sinh bào tử do vậy có thể xâm nhập dễ dạng vào đường ruột của
động vật mà không bị dịch vị axit tiêu diệt, khi ở phần trên của ruột bào tử phục hồi và
nảy mầm đồng thời tiết ra hàng hoạt enzyme có hoạt tính sinh học cao như protease,
lipase, amylase, góp phần vào việc tiêu hóa thức ăn. Ngoài ra nó còn sản xuất ra peptide
đối kháng, kìm hãm các vi khuẩn gây bênh thối ruột phát triển. Do Bacillus subtilis hiếu
khí nên tiêu thụ oxy trong ruột ức chế các các vi khuẩn kỵ khí phát triển.
-

Bacillus subtilis được sử dụng trong lĩnh vực y tế và sức khỏe

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Bacillus subtilis có thể được sử dụng để điều trị
viêm ruột, viêm phế quản và tiêu chảy và các bệnh khác, nhưng cũng để phòng ngừa và
điều trị các nhiễm trùng vết bỏng.
-

Bacillus subtilis trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản, Bacillus subtilis protease và các enzym và kháng sinh, và phân
giải các chất một lượng lớn thức ăn còn sót lại, các chất bài tiết, chất thải, phế thải động
vật và thực vật và các loại khí độc hại (amoniac, hydrogen sulfide vv .), Chúng cũng phân
giải các chất có phân tử lượng lớn thành các phân tử nhỏ hơn va cuối cùng tạo thành
carbon dioxide, nitrat và sunfat, vv, làm giảm COD nước, BOD, cải thiện chất lượng
nước. Chúng cung cấp chất dinh dưỡng cho tảo tảo đơn bào chủ yếu là để thúc đẩy sinh
sản, thực vật phù du quang hợp, do vậy cung cấp oxy lại cho vật nuôi tạo thành một chu
trình sinh thái lành mạnh. Ngoài ra, chúng tiết ra một loại enzyme và thuốc kháng sinh có
thể ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác và do đó làm giảm hoặc thậm chí loại bỏ


10

tác nhân gây bệnh động vật thủy sản. Ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy vai trò
quan trọng của B. subtilis trong nuôi trồng thủy sản.
I.2.7. Bào từ:
– Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 –
1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,
peptidoglycan…
-

Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy
mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất

-

probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006).
Khả năng tạo bào tử:

Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (dinh
dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại
và nhiệt độ cao…).
– Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:
+ Hình thành những búi chất nhiễm sắc;
+ Tạo tiền bào tử;
+ Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ;
+ Tổng hợp các lớp vỏ bào tử;
+ Giải phóng bào tử.;
+ Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng
mới
2. Phân lập và tuyển chọn Baccillus subtilis trong đất:
2.1.

Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn:


11

Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2- 3 cm, lấy lớp đất ở dưới. Cân 10g
mẫu đất cho vào bình tam giác chứa 90ml nước muối sinh lí thanh trùng và lắc đều, được
nồng độ pha loãng 10-1 .
2.2.

Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis:

Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1-4. Dùng
micropipet hút 1ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10 -1 cho
vào ống nghiệm 1 và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10 -2, tiếp tục làm cho đến ống
nghiệm cuối cùng. Tiếp theo, chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,

dùng micropipet hút 0.1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA( mỗi
nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que cấy trang vô trùng, sau đó cho những đĩa
TSA này vào tủ ấm, ủ ở 37 oC/ 24h. Sau đó, quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn
những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacilus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy
giữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng.


12

MẪU ĐẤT
Đồng nhất và pha loãng mẫu.
Mẫu 1g mẫu : 9ml dd NaCl 9%

Dd pha loãng mẫu 10-1
Lần lượt pha loãng các nồng độ tiếp theo
Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA
ủ ở 37oC/24h
Chọn khuẩn điển hình, nhuộm Gram và phản ứng sinh hóa

Giữ giống trên môi trường TSA nghingê

Sơ đồ 2.1: Phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis trong môi trường đất
2.3.
-

Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được:

Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi

Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới

kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách
sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi
thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn, có hay không có bào
tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc


13

điểm của Bacilus subtilis(như: là trực khuẩn, hai đầu tròn, G +, bắt màu tím, đứng đơn lẻ
hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn
tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định.
-

Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập được.

T
h
ử
p
h
ả
n
ứ
Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính
hiển vi

Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-),
Nitrat(+), Voges-proskaues(+), citrat(+),

Khẳng định vi khuẩn Bacilus

Maltose(-).

subtilis

Sơ đồ 3.1: Định danh vi khuẩn Baccillus subtilis

2.4. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis:
2.4.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis:
 Mục đích : xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất


14

Chế độ sục khíí

Lô 1: sục khí liên tục

Thời gian
24 giờ

Hoạt độ amylase

Lô 2: không sục khí

Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease

48 giờ

 Cách làm:
Lấy vi khuẩn Bacilus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4- 5 ml nước
muối sinh lí đã hấp tiệt trùng ( 121 o C /15 phút), sau đó đo độ đục để cân bằng số lượng vi
khuẩn cho vào các lô.
Sau đó chuẩn bị 2 bình ( cho 1 ống giống), mỗi bình chứa 150ml môi trường TSB cấy
giống Bacilus subtilisvới tỉ lệ 3% cho vòi sục khí vào bình, với thời gian và chế độ sục
khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí. Lấy mẫu vào các thời điểm
24h, 48h. Thí nghiệm được trong 48h và ở nhiệt độ phòng và sau đó đọc kết quả.
Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần:
Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacilus subtilis thích hợp, lựa chọn 4 chủng
cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacilus subtilis:
 Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm
1
 Cách làm:
Cấy vi khuẩn từ các ống giống vaò các ống nghiệm chứa 4-5 ml nước muối sinh lí đã hấp
khử trùng đem đo độ đục.


15

Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử nghiệm: Rỉ đường +
2% tinh bột, rỉ đường+ 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ đường+ 1% tinh bột+ 0.5%
pepton với các điều kiện khảo sát:
-

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
Tỉ lệ giống: 3%
pH =6

Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1.

Sau đó, tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần:
Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:
-

Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth,
Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross+ Fluld
Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường tiến hành chọn
môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.2
Môi trường

Hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme protease
amylase
Lần 1 Lần 2
Lần 1
Lần 2

Rỉ đường + 2% tinh bột
Rỉ đường + 1 % tinh bột
Rỉ đường + 1 % tinh
bột + 0,5% pepton
TSB + 1% tinh bột

I.4.3. Khảo sát điều kiện (Ph, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các
chủng Bacillus subtilis:
 Mục đích:

Xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1
 Cách làm:


16

Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống chứa 4- 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử
trùng đem đo độ đục.
Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí nghiệm 2 ở các
Ph và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy pử chế độ đã chọn ở thí nghiệm 1.
Kiểm tra hoạt độ amylase và protease ( thí nghiệm được lặp lại 2 lần )
Bảng 4.3: Bố trí thí nghiệm 3
pH

6.0

Hoạt độ enzyme amylase

7.0
protease

amylase

protease

Thời gian
24h
48h

 Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacilus subtilis cho

hoạt độ enzyme tốt nhất.
2.5. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacilus
subtilis:
2.5.1. Quy trình thực hiện


17

Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1

Môi trường nhân giống môi trường TSB với điều kiện môi trường đã chọn
Thời gian 48h, nhiệt độ 37oC
Môi trường sản xuất: cám gạo
Thu hoạch
Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40- 50oC

Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase

2.5.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản:
Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20
ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4- 1f 0o C và nhiệt độ phòng.
2.6. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacilus subtilis:
2.6.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacilus subtilis
Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24h, quan sát và
bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 6.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc
lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám.
Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kính
hiển vi ( độ phóng đại x1000 lần ) để khảo sát đặc điểm đặc điểm hình thái.

18

2.6.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacilus subtilis:
Nhuộm Gram tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần,
chúng tôi nhận thấy các chúng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống Bacilus
subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước
0,5-0,8m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh
dưỡng


19

Hình 6.2 : Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacilus subtilis
2.6.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là
Bacilus subtilis:
Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Baclilus subtilis được chọn làm
một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 6.3
Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10
chủng là Bacilus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng
sinh enzyme amylase và proteasetrong những môi trường và điều kiện cấy khác nhau
của chủng vi khuẩn Bacilus subtilis phân lập được.


20

Bảng 6.3. kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập
Chủng Các phản ứng sinh hóa
phân
catalase
lecithinase nitrate

citrate
lập
1
+
+
+
2
+
+
+
3
+
+
+
4
+
+
+
5
+
+
+
6
+
+
+
7
+
+
+

8
+
+
+
9
+
+
+
10
+
+
+
11
+
+
12
+
+
+
13
+
+
+
14
+
+
+
15
+
+

16
+
+
17
+
+
18
+
+
19
+
+
+
20
+
+
+
21
+
+
+
Với: (+): phản ứng dương tính; (-): phản ứng âm tính

MR-VP

maltose

+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

+

+
+
+
-

2.7. Các thí nghiệm
2.7.1. Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi
cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus
subtilics phân lập được
Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1-10
Các chủng vi khuản phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai chế độ sục khí
và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ phòng, pH=7, tiến


21

hành theo giỏi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme amylase và protease với kết quả như
sau:
Bảng7.1: Kết quả thí nghiệm 1
Chế độ sục Lô 1: sục khí liên tục (n=18)
Lô 2: không sục khí (n=18)
khí
Thời gian
Hoạt
độ Hoạt
độ Hoạt
độ Hoạt
độ
amylase
protease

amylase
protease
(Wo/ml)
(Hdp/ml)
(Wo/ml)
(Hdp/ml)
24 giờ
39.11
32.89
14.44
5.44
48 giờ
47.11
40
25.78
8
Hoạt độ trung 43.11
36.45
20.11
6.72
bình
Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.1 cho thấy hoạt độ trung bình của hai loại enzyme
trong 1ml canh thuần ở chế độ sục khí liên tục cao hơn hoạt độ trung bình của hai loauj
enzyme ở chế độ không sục khí.
Kết quả xử lí thống kê cho thấy có sự khác biệt ở hai chế độ nuôi cấy và sự khác biệt này
có ý nghĩa về mặt thống kê ở cả hai loại enzyme (với P<0.05). như vậy có thế thấy với
chế độ sục khí do cung cấp oxi nhiều nên giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh và sinh sản
rsa nhiều enzyme hơn so với chế độ không sục khí.
Kết quả xử lí thống kê cung cho thấy có sự khác biệt về hoạt độ của hai loại enzyme
giữa hai khoảng thời gian nuôi cấy ( 24giowf, 48 giờ). Theo kết quả nuôi cấy ở 48 giờ

với chế độ sục khí liên tục sẽ cho hoạt độ enzyme cao hơn so với điiều kiện nuôi cấy liên
tục trong 24 giờ. Như vậy chứng tỏ khi vi khuẩn được cung cấp oxi càng nhiều thì chúng
sẽ phát triển càng tốt và sinh càng nhiều enzyme.
Cũng theo kết quả thống kê, có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 9 chủng Bacillus
subtilis được nuôi cấy.
Tuy nhiên giữa hai chế độ sục khí và không sục khí thì hoạt độ enzyme trong cùng một
chủng không đồng nhất, có thể ở điều kiện cung cấp oxi một số chủng này phát triển tốt


22

hơn và ở chế độ không cung cấp oxi một số chủng khác lại phát triển tốt hơn. Điều này
cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm sinh học giưa các chủng.
Từ kết quả có đượ như trên, quyết định chọn chế độ sục khí liên tục trong thời gian 48
giờ và chon bốn chủng 2,7,9,10 trong 9 chủng phân lập được để tiếp tục khảo sát hoạt độ
của hai loại enzyme trong các môi trường nuôi cấy khác nhau ở các thí nghiệm tiếp theo.
2.7.2. Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của môi tường đến hoạt độ enzyme của
vi khuẩn Bacillus subtilis
Tiến hành xác định hoạt độ enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis trên 4 loại môi
trường: rỉ đường+ 2%tinh bột, rỉ đường +1%tinh bột, rỉ đường +1% tinh bột + 0.5%
pepton, TSB +1% tinh bột với 4 chủng đã chọn và điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ phòng,
tỉ lệ giống là 3%, sục khí liên tục trong 48h (mỗi chủng 4 loại môi trường), thí nghiệm
lặp lại hai lần. kết quả được trình bày ở bảng 7.2.
Bảng 7.2: ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn
Môi trường

Hoạt độ enzyme amylase
(Wo/ml)
26

Hoạt độ enzyme protease
(Hdp/ml)
30

Rỉ đường + 2%tinh bột(1)
(n=8)
Rỉ đường + 1% tinh bột (2) 18.5
22
(n=8)
Rỉ đường + 1% tinh bột + 20
32
0.5% pepton (3)
(n=8)
TSB + 1% tinh bột (4)
14.5
20
(n=8)
Qua kết quả khảo sát hoạt độ hai loại enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis, thấy rằng
môi trường rỉ đường +2% tinh bột có hoạt độ enzyme trung bình cao hơn hoạt độ
enzyme trung bình trên các môi trường còn lại.
Kết quả xử lí thống kê cho thấy có sự khác biệt ở 4 loại môi trường trên. Từ kết quả này
quyết định chọn môi trường rỉ đường +2% tinh bột để tiến hành ở các thí nghiệm tiếp
theo.


23

. khảo sát điều kiện pH, thời gian thích hợp cho sản xuất enzyme của Bacillus subtilis
Dựa trên kết quả có được ở các thí nghiệm trên, tiến hành nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis đã chọn trên môi trường rỉ đường + 2% tinh bột ở hai điều kiện ph khác

nhau: pH=6 và pH=7, thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, với tỉ lệ giống 3%, nhiệt độ
phòng. Kết quả được trình bày ở bảng 7.3.
Bảng 7.3: khảo sát điều kiện pH, thời gian thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng
vi khuẩn Bacillus subtilis
pH
thời gian

6.0
Hoạt
amylase

7.0
độ Hoạt
protease

độ Hoạt
amylase

độ Hoạt
protease

độ

24h
27
13
32
18
(n=8)
48h

32
18
36
18
(n=8)
Qua kết quả khảo sát trên ta thấy ở ph=7 thì hoạt độ enzyme trung bình của vi khuẩn cao
hơn so với ph=6 và ở thời gian nuôi cấy là 48h thì hoạt độ enzyme cũng cao hơn nuôi ở
24h.
Tuy nhiên kết quả xử lí thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa hai điều kiện pH
và thời gian ở cả hai loại enzyme và cũng không có ý nghia về mặt thống keeboiwr vì
mức ý nghĩa của hai loại enzyme đều lớn hơn mức ý nghia cho phép.
2.8. Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất
Sau khi đã chọn được 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, tiến hành nuôi tăng sinh trong
môi trường TSB, sau đó trộn với cám gạo để thử nghiệm thời gian bảo quản va nhiệt độ
bảo quản sau khi đã thành chế phẩm của Bacillus subtilis.
Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-10 0C) và ở nhiệt độ phòng (30-370C) rong
thời gian là 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày.


24

Kết quả được trình bày ở bảng 8.1
Bảng 8.1: khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm
4-10oC

Nhiệt độ
Thời gian

30-37oC

0 ngày

Hoạt
amilase
56

độ Hoạt
protease
38

độ Hoạt
amilase
56

độ Hoạt
protease
38

10 ngày

5.25

0.0

4.75

0.0

20 ngay

5.25

0.0

4.25

0.0

30 ngày

5.0

0.0

4.5

0.0

độ

Từ kết quả ở bảng trên cho thấy trong điều kiện bảo quản lạnh thì hoạt độ của hai loại
enzyme cao hơn so với điều kiện bảo quản thường. hoạt độ của hai loại enzyme giảm rất
nhanh chỉ sau 10 ngày bảo quản.
ở kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy kết quả cụ thể cho từng loại enzyme. Với enzyme
protease kết quả thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghia giữa hai nhiệt độ và
thời gian bảo quản.
Qua những kết quả trên do có sự giảm đáng kể hoạt độ của enzyme trong khoảng thời
gian 10 ngày bảo quản, trong khảo sát cho thấy cám gạo không phải là chất nền thích
hợp cho chế phẩm enzyme protease.
3. Đặc tính sinh lí-sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis

3.1.

Thành phần hóa học của vi khuẩn b.subtilis

Thành phần hóa học của B.subtilis có thể xác định bằng các kỹ thuật phân tích hóa học.
Bao gồm các thành phần sau:
3.1.1. Nước
−
−

Nước chiếm 80%-90% trọng lượng khô của tế bào.
Có 2 loại nước chính:


25
+

Nước tự do: là nước tham gia vào quá trình trao đổi chất, có khả năng hòa

tan các chất, có khả năng di chuyển.
+ Nước liên kết: nước tham gia tạo liên kết với các chất đa phân tử. Loại
nước này không tham gia vào hoạt động trao đổi chất của tế bào.
− Nếu tế bào thiếu nước tự do thì vi khuẩn B.subtilis sẽ bị ức chế, các phản ứng
sinh hóa trong nội bào không xảy ra  trao đổi chất và trao đổi năng lượng
không diễn ra  quá trình sinh trưởng và phát triển bị gián đoạn.
− Tế bào mất nước liên kết vi khuẩn bị chết vì các liên kết, cấu trúc tế bào bị phá
vỡ.
3.1.2. Protein
Protein chiếm khoảng 50-70% trọng lượng khô của tế bào vi khuẩn.
Có 2 loại:

+ Protein đơn giản: trong thành phần có các acid amin.
+ Protein phức tạp: ngoài acid amin còn chứa các thành phần khác.
− Protein đóng nhiều vai trò quan trọng trong tế bào: tham gia xây dựng cấu trúc,
−
−

xú tác cho các phản ứng sinh hóa, vận chuyển chất dinh dưỡng, …
− Các yếu tố làm biến tính protein: nhiệt độ, pH, cồn, …
+ Biến tính thuận nghịch: sẽ bị ức chế dẫn đến các chức năng protein thực
hiện sẽ bị đình chỉ.
+ Biến tính không thuận nghịch: chức năng sẽ không được phục hồi dẫn đến
tế bào sẽ bị chết.
3.1.3. Lipid
Chiếm 3-10% trọng lượng khô của tế bào vi khuẩn.
Có 2 loại:
+ Lipid đơn giản: trong thành phần gồm acid béo và glycerol.
+ Lipid phức tạp: bao gồm acid béo, glycerol và các thành phần khác.
− Vai trò của lipid: tham gia cấu trúc tế bào, dự trữ năng lượng(hạt dự trữ).
−
−

3.1.4. Glucid
−
−
−

Chiếm 10-30% trọng lượng khô của tế bào vi khuẩn.
Có 2 loại: glucid đơn giản và glucid phức tạp.
Vai trò: tham gia cấu trúc tế bào và dự trữ năng lượng.