Báo cáo thí nghiệm vi sinh

Thực tập vi sinh đại cương

BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
1.Định nghĩa:
Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều
kiện có oxy phân tử
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí:
Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ
sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư
hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế
biến và bảo quản thực phẩm
Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất
lượng : 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư
hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=10 6 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu
hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 105 tế bào/g(ml) sữa bị
chua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm
có mùi hôi không chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi
cấu trúc
3.Quy trình kiểm tra:

Trang 1


Thực tập vi sinh đại cương
1ml(10-1)+ 9ml nước
nước vô trùng

1ml(10-1)+ 9ml nước
nước vô trùng

Stomacher .10gr

thực phẩm
10-2
10-3
+ 90ml NaCl 0.85%

(10-1)

Bước 1: đồng nhất mẫu
Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H 20 vô
trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30”
thu được nồng độ 10-1
Trang 2


Thực tập vi sinh đại cương

Bước 2 : pha loãng mẫu
Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng
lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng
lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc
ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10-2 .Làm
tương tự với các nồng độ kế tiếp
Lưu ý khi pha loãng mẫu:

-Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực
phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm
nghiệm….
-Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải
vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện
tượng sai số

-Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều
Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu
Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp
Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2
đĩa/nồng độ
Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vào
các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều
dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi
trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert
Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A
hoặc N.A

Trang 3


Thực tập vi sinh đại cương

Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc
Sabouraund
Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc
72h/30-370C
Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa)
Kết quả thí nghiệm
Nồng độ
Số khuẩn lạc

10-1
Đĩa 1 Đĩa 2
48

10-2
Đĩa 1 Đĩa 2

130

113

125

10-3
Đĩa 1 Đĩa 2
105

Bước 5: tính kết quả theo công thức
n = c/(n1+0.1n2)*d
n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml))
c : tổng số khuẩn lạc đếm được
n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất
n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai
d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm

  120).100
=>n==2104521000 (113  125  105
(2  0,1.2)

cfu/g(ml)
4.Môi trường sử dụng

4.1.Môi trường Nutrient Agar
Peptone

:5.0g

Meat extract

:3.0g

Agar

:12.0g

Nước cất

:1000ml

pH sau thanh trùng :

7.00.2

Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút
Trang 4

120


Thực tập vi sinh đại cương

4.2.Môi trường Plate Count agar
Peptone

:5.0g

Meat extract

:2.5g

D(+) glucose

:1.0g

Agar

:14.0g

Nước cất vừa đủ

:1000ml
7.00.2

pH sau thanh trùng :

Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút
4.3.Môi trường Sabouraund
Peptone

:20g

Glucose

:40g

Agar

:20g

Nước

:1000ml

Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút
BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ COLIFORM
1.Những kiến thức chung về COLIFORM
Coliform là nhóm trực khuẩn gram- , không bào tử , hiếu khí hoă ăc kị
khí tùy ý, có khả năng lên men đường lactose, sinh hơi ở 37oC /24 – 48h.
Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm vi sinh vâ tă
dùng để chỉ thị khả năng có sự hiê ăn diê ăn của các vi sinh vâ ăt gây bê ănh trong
thực phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vâ ăt hiếu khí và kị khí tùy ý,
gram - , không bào tử , hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong
môi trường lỏng, dựa vào nhiê ăt dô ă tăng trưởng, nhóm này được chia thành 2
nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân các loài đô ăng
vâ ăt. Trên thực tế kiểm nghiê ăm coliform phân được quan tâm nhiều hơn
coliform. Coliform phân có nguồn gốc từ ruô ăt người và các đô ăng vâ ăt máu
nóng bao gồm các giống escherichia, kebsiella, enterobater. Khi coliform
Trang 5


Thực tập vi sinh đại cương

phân hiê ăn diê ăn ở mô ăt số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng chứa các
vi sinh vâ ăt gây bê ănh hiê ăn diê ăn trong phân.

Chỉ tiêu tổng coliform không thích
hợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân. Tuy
nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số vi
sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44 oC. Do
đó số lượng E. coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lý
nguồn nước.
Trong các thành viên nhóm coliform phân thì E.coli là loài được quan
tâm nhiều về vê ă sinh an toàn thực phẩm.
Loài vi sinh vâ ăt này phân bố ở mọi nơi, có trong ruô ăt người và các
đô ăng vâ ăt máu nóng.
*mô ôt số hình ảnh về coliform:

Fecal Coliform
375 x 294
ﾧ

Chromocult® Coliform Agar
ES
Trang 6


Thực tập vi sinh đại cương

297 x 300
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu
Coliform được xem là nhóm vi sinh vâ ăt chỉ thị. Số lượng hiê ăn diê ăn
của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị cho khả năng hiê ăn
diê ăn của các vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác. Số lượng coliforms cao thì khả
năng hiê ăn diê ăn của vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác cao.
Colifrorm chịu nhiê ăt( coliform phân):



Là thành phần trong hê ă vi sinh vâ ăt đường ruô ăt ở người và các

đô ăng vâ ăt máu nóng.


Được xem là vi sinh vâ ăt chỉ thị mức đô ă vê ă sinh trong quá trình

chế biến, bảo quản , vâ ăn chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chỉ
thị sự ô nhiễm phân trong môi trường.


Lên men đường lactose trong môi trường E.C ở 44.5oC.



Có khả năng sinh indol 24h/44.5oC.



Kết quả sinh hóa nghiê ăm pháp imvic là + + - -

3.Quy trình kiểm tra
Phương pháp MPN :
Nguyên tắc:
Mẫu được pha loãng thành mô ăt dãy thâ ăp phân , 2 nồng đô ă kế tiếp
nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống
durham. Mỗi nồng đô ă pha loãng được lă ăp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi
trong từng ống nghiê ăm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng đô ă pha loãng

và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vâ ăt tương ứng hiê ăn
diê ăn trong 1g hoă ăc 1ml mẫu ban đầu

Trang 7


Thực tập vi sinh đại cương

Sơ đồ quy trình kiểm tra :
1ml(10-1)+ 9ml nước

1ml(10-2)+ 9ml

nước vô trùng

nước vô trùng

Stomacher
10gr thực phẩm
10-2
10-3
+ 90ml NaCl 0.85%( 10-1 )

hình 1.1
Bước 1:
10gr thực phẩm + 90ml NaCl 0.85% hoă ăc là nước vô trùng,
stomacher thu được nồng đô ă 10-1. mục đích đồng nhất là để phân bố đều vi
sinh vâ ăt.
Bước 2:
Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vâ ăt có trong mẫu ban dầu.

Lấy 1ml mẫu ở nồng đô ă 10-1 cho vào ống nghiê ăm thứ nhất, sau đó cho 9ml
nước vô trùng. Ta được ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-2. Sau đó lấy 1ml mẫu ở
nồng 10-2 cho vào ống nghiê ăm thứ hai + 9ml nước vô trùng thu được ống
nghiê ăm có nồng đô ă 10-3 . tương tự như trên ta thu được các ống nghiê ăm có
nồng đô ă 10-4, 10-5…..
Trang 8


Thực tập vi sinh đại cương

Bước 3:
Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nồng đô ă
liên tiếp(10-1,10-2,10-3) như sau : Mỗi nồng đô ă lấy 3 ống nghiê ăm. Cho vào
mỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiê ăm sao
cho ngâ ăp ống durham. Ghi 3 nồng đô ă liên tiếp bên ngoài ống nghiê ăm(mỗi
nồng đô ă 3 ống nghiê ăm). Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ở nồng đô ă 10-1
vào 3 ống nghiê ăm có ghi nồng đô ă 10-1(chứa môi trường LT),tương tự cho các
ống nghiê ăm ở những nồng đô ă tiếp theo. (hình 1.1) ủ ở 37oC/24h
Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury
Trytose (LT):
-Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.
- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
Laury Trytose.
- Không lắc những ống có ống durham
Bước 4:
Đọc kết quả các ống Laury Tryptose . Có 3 trường hợp xảy ra:
+ ống durham không thay đổi
+ ống durham nổi lên trên
+ ống durham sinh hơi.
Đọc kết quả các ống LT dương tính, sau đó cấy chuyền các ống LT

dương tính này vào các ống môi trường BGBL 2% bằng cách lấy que cấy
vòng nhúng vào môi trường LT dương tính ở trên,rồi cho vào ống có môi
trường BGBL. Ghi nồng đô ă trên sản phẩm. Ủ 37oC /24h.
Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoă ăc có
bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tích
ống chuông).
Trang 9


Thực tập vi sinh đại cương

Ống LT - : không có hiê ăn tượng gì xảy ra
Bước 5:
Đọc kết quả ống BGBL dương tính. Lâ ăp tỷ lê ă các ống BGBL dương
tính ở 3 nồng đô ă liên tiếp. Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng
+ ống BGBL dương tính: môi trường đục và ống durham ( ống chuông)
nổi hoă ăc có bọt khí trong ống chuông( thể tích bọt khí =1/10 thể tích ống
chuông).
+ ống BGBL âm tính: không có hiê ăn tượng gì xảy ra.
Bước 6:
Tính kết quả:
Tổng số coliform (cfu/g hoă ăccfu/ml)= số MPN 10n
n là số nguyên dương của nồng đô ă pha loãng đầu tiên được nuôi cấy.
Bước 7:
Từ kết quả tính được, so sánh với tiêu chuẩn về an toàn vê ă sinh thực
phẩm.
4. Môi trường sử dụng:
Môi trường BGBL 2% : là môi trường dùng để phát hiê ăn và đếm
coliforms, coliforms phân, E.coli trong sữa, thực phẩm, nước.
Nguyên tắc:

Mâ ăt bò ( bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram + và
vi khuẩn gram

–

không phải coliform. Brilliant green có nồng đô ă đă ăc hiê ău

nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trưởng ở 44 0C , Tránh được
hiê ăn tượng dương giả, lúc này coliform phát triển làm đục môi trường và
sinh khí trong ống durham do lên men lactose.
5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm
Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiê ăm ,nồi autoclave, tủ sấy,
ống durham , micropipet, mẫu là tương ớt.
Trang 10


Thực tập vi sinh đại cương

6.Kết quả thí
nghiệm
_
_
_

10-1

Trang 11


Thực tập vi sinh đại cương

+
+
_

10-2

Trang 12


Thực tập vi sinh đại cương

_
_
_

10-3
Tỷ lê ă của BGBL dương tính ở 3 nồng đô ă (10-1:10-2:10-3) = (0,2,0)
Tra bảng Mac Crady ta được số MPN =6.2N/g
= 6.2 101=62 (cfu/ml)


 coliform

BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI
Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển
được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+),
không sinh aceton (phản ứng V.P-) và không sử dụng citrate làm nguồn
cacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêu
chảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân

và chất lượng vệ sinh thực phẩm.
Trang 13


Thực tập vi sinh đại cương

Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người :
- Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em.
- Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên
có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột.
- Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai.
- Các chủng gây lây nhiễm đường ruột.
1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm.
Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt.
2. Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ
kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có
ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống. Theo dõi sự sinh
hơi trong từng ống nghiệm. Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha
loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng
hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu.
3.Dụng cụ và hóa chất:
3.1.Thiết bị và vật liệu:
- Tủ ấm
- Bể điều nhiệt
- Máy lắc
- Cân
- Pipet tiệt trùng
Trang 14

Thực tập vi sinh đại cương

- Các bình chứa mẫu vô khuẩn
- Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng, có nút đậy
- Mẫu thực phẩm kiểm tra
- Ống durham
3.2.Môi trường và hóa chất:
- Môi trường E.C broth
- Môi trường Lauryl tryptose( LT)
- Môi trường endo agar
- Môi trường E.M.B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar).
- Môi trường N.A (nutrient agar)
4.Tiến hành thí nghiệm:
Bước 1: Lấy mẫu
Tùy loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu với số lượng và khối
lượng khác nhau cho phù hợp. Khi lấy mẫu cần đảm bảo :
- Mẫu phải có tính đại diện.
- Lượng mẫu vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý hóa,sinh học.
- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô khuẩn.
- Mẫu lấy xong phải phân tích ngay không để quá 24 giờ.
- Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu, ghi lại những đặc điểm của mẫu và nơi
thu mẫu.

Trang 15


Thực tập vi sinh đại cương

Lấy 10g tương ớt + 90ml NaCl 0.85%, stomacher thu được nồng độ
10-1

Bước 2: Pha loãng mẫu
Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu lỏng:
10ml

1ml

Mẫu

1ml

90ml NaCl vô trùng

10-3

1ml

10-2

10-4
10-1
NaCl

9ml NaCl

(nước vô trùng)

9ml

NaCl

vô trùng

vô trùng

Trang 16

vô trùng

9ml


Thực tập vi sinh đại cương

Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu rắn:
10ml

1ml

1ml

1ml

10g mẫu
Stomacher

90ml NaCl vô trùng
10-3

10 -2

10-4
10-1

(nước vô trùng)

9ml

NaCl

vô trùng

9ml NaCl

vô trùng

9ml NaCl

vô trùng

Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác
Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu:
- Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môi
trường dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu chỉ dùng nước cất vô trùng

Trang 17


Thực tập vi sinh đại cương

vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trường
dinh dưỡng.
- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. Các dụng
cụ phải được vô trùng.
- Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinh vật
phân tán đều trong mẫu.
- Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipet
khác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các
tế bào ở độ pha loãng sau.
- Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc:
 Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng, điều kiện bảo
quản, quy trình chế biến...).
 Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm, thao tác....).
Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT)
Tiến

hành

nuôi cấy dịch
mẫu trong môi
trường Laury
Trytose ở 3
nồng độ liên
tiếp, 3 ống/
nồng độ, 1ml
dịch

pha

loãng/ ống LT.

Ủ 37ºC/24h.

Trang 18


Thực tập vi sinh đại cương
10-2

10-3

10-4

Môi trường Laury Trytose( LT)

Rồi để yên cho thạch đông lại, đem đĩa ủ trong tủ ấm. Ủ ở 37 oC trong
24h
Sau khoảng thời gian trên lấy đĩa đã ủ ra và đếm khuẩn lạc, tính kết
quả.
Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury
Trytose (LT):
- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.
- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
Laury Trytose.
- Không lắc những ống có ống durham
Bước 4 : Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính( +), cấy chuyền
các ống LT(+) vào các ống môi trường E.C. Ủ 44ºC/24h.
E.coli phát triển ở 44ºC,ở nhiệt độ này một số vi khuẩn khác đã bị
hạn chế khả năng sinh trưởng .Hơn nữa môi trường E.C muối mật ức chế cá
vi khuẩn Gr + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột
Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoă ăc có

bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tích
ống chuông).
Trang 19


Thực tập vi sinh đại cương

Ống LT - : không có hiê ăn tượng gì xảy ra
Từ các ống E.C (+), cấy phân lập trên môi trường endo agar và E.M.B
agar. Ủ 37ºC/24h
Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar
và E.M.B agar:
 Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.
 Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩn trên
môi trường endo agar và E.M.B agar
Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình:
- Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại
- Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh
kim.
Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A. Ủ
37ºC/24h.
Buớc 6 : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn đã cấy ở bước 5
I : indol
M :methyl red
V : V.P
C : simon citrat
Phản ứng sinh hóa kiểm tra sự có mặt của trực khuẩn đường ruột Gr–
có khả năng sử dụng simon citrat
Kết quả :
+ + - - : E.coli type I

- + - - : E.coli type II
BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Trang 20


Thực tập vi sinh đại cương

1. Đặc điểm của Stapylococcus aureus:
1.1. lịch sử:
Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có
mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu.
1.2. Phân bố:
 Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật như thịt,
sữa…
 Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi.
 Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh.
 Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội(opportunist type) vì sự có mặt
rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để
xâm nhập.
1.3. Hình dạng tế bào:
Là vk gram+, hình cầu không bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý.
Trong vết thương và máu thường thấy hình dạng giống chùm nho
1.4. Đặc điểm và điều kiện sinh trưởng:
Phát triển tốt ở các môi trường tổng hợp, đặc biệt phát triển tốt ở môi
trường thạch máu hoặc huyết thanh.
Nhiệt độ tối thích là 37oC , pHop=7.2.
Trên môi trường thạch ,khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng,đục vun mờ.
Ở môi trường lỏng, tế bào ở dạng cặn, vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm ở bề
mặt môi trường .
1.5. Đặc điểm sinh hoá:

 Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol,
manitol
 Không lên men salicin, raffinose,inulin.
 Có khả năng chịu mặn cao
Trang 21


Thực tập vi sinh đại cương

 Làm đông tụ sữa
 Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu.
 Phản ứng indol-,NH3-, thuỷ phân gelantine, đông huyết tương.
1.6. Khả năng gây bệnh:
Gây ngộ độc thực phẩm:
Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực
phẩm đó và bị ngộ độc. Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống
trong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng. Loại này thường có tính
chất cục bộ, ít có khả năng truyền nhiễm
Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy có
vsv gây bệnh.
Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực
phẩm đó bị ngộ độc).
Bản chất của ngoại độc tố là protein nên chúng kém chịu nhiệt (trừ
độc tố của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc
hiệu(tính kháng nguyên mạnh) do vậy có thể phát hiện được bằng phản ứng
kháng nguyên – kháng thể.
Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột. Type A và D gây ngộ độc thực
phẩm cho người.
Triệu chứng bệnh:
Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộc

vào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắt
bụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức ở mức nghiêm trọng,
đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72 h, nạn
nhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội.
Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc.

Trang 22


Thực tập vi sinh đại cương

Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố
này. 100oC/30’; 137oC/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực.
Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon, kem tổng hợp,
nước súp (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40oC) và các loại thuỷ sản, thực
phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv này.
Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá
trình chế biến.
Biện pháp phòng ngừa:
 Kiểm tra sức khoẻ công nhân.
 Không lấy sữa từ động vật bị viêm vú.
 Trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả năng sinh độc tố.
 Hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển.
 toC = 60oC/ 0.5h phá huỷ các tế bào, một số bị phân huỷ ở to= 80 oC /
0.5h.
 Hoá chất: fenol 1%, fenol 2%/15’, hgcl 0.5%/1h, formaldehyt
10%/10’, gentiant violet1:25.000/5 – 10’, xử lý nhiễm vết thương
trên da ở người và động vật do Staphylococcus gây ra dùng dung
dịch gentiant violet 2%.
Một số hình ảnh về Staphylococcus aureus

ﾧﾧ

2. Ý nghĩa của việc kiểm tra
vi khuẩn:

Trang 23


Thực tập vi sinh đại cương

Sự hiện diện với mật độ cao của Sta. Aureus trong thực phẩm chỉ thị
điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.
3. Quy trình kiểm tra:
3.1. Quy trình kiểm tra định tính
Bước 1: đồng nhất mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml
nước vô trùng .stomacher.
Bước 2: tăng sinh: hút 1ml ở dịch đồng nhất đưa vào môi trường MSB có
màu đỏ. Ủ 37oC/ 24h. Sau đó đọc kết quả:
-Ống tăng sinh âm:có môi trường MSB vẫn giữ màu đỏ
-Ống tăng sinh dương: Có môi trường MSB chuyển từ đỏ sang vàng.
Bước 3: từ ống tăng sinh dương, cấy phân lập lên môi trường baird parker
agar (hoặc MSA). Ủ 37oC/24h.
Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình.
 Trong môi trường Baird Parker: Sta. Aureus có đặc điểm tròn, lồi, có
tâm đen, bóng vun có vòng sáng quanh khuẩn lạc.
 Trong môi trường MSA : môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, vi
khuẩn tròn, bóng.
Bước 5: Từ khuẩn lạc điển hình làm phản ứng pastorex, staphylatex, đọc kết
quả.
Bước 6: Kết luận.

3.2 Quy trình kiểm tra định lượng.
Bước 1: đồng nhất mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml
nước vô trùng .stomacher.
Bước 2:pha loãng mẫu tới các nồng độ thích hợp.
Bước 3:nuôi cấy 0.1 ml dịch mẫu /đĩa. 3 đĩa/ nồng độ, tiến hành thao tác
bằng que cấy trang. Nuôi cấy dịch mẫu trên môi trường baird parker. Ủ
37oC/ 48h.
Trang 24


Thực tập vi sinh đại cương

Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình. Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình và 5
khuẩn lạc không điển hình rồi cấy chúng từ môi trường BPA sang môi
trường TSA.Ủ 37oC/ 24h.
Bước 5: cấy chuyển VK sang ống nghiệm có chứa 0.3 ml huyết tương thỏ.
Ủ 37oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau 1,3,6,24h.
-Phản ứng dương tính :có khối đông hình thành.
-Phản ứng âm tính: không có khối đông hình thành, dịch mẩu giống
như ban đầu.
Bước 6: tính kết quả
Số lượng Staphylococci coagulase dương tính:
cs=(f1*nt*ht)+(f2*na*ha)
trong đó
cs:số lượng Staphylococci coagulase dương tính.
f: nồng độ pha loãng của mẫu
nt:tổng số khuẩn lạc điển hình trên các đĩa
na:tổng số khuẩn lạc không điển hình trên các đĩa
ht=số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ số khuẩn lạc điển hình
được thử nghiệm

ha=số khuẩn lạc không điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ khuẩn lạc điển
hình được thử nghiệm
Chú ý : nếu số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng 20 – 200, đếm số khuẩn
lạc điển hình và không điển hình, sau đó tính kết quả như công thức trên và
ghi rõ trong biểu mẫu.
3.3 phản ứng sinh hoá Saulatex
Dùng để định danh cả giống và loài Sta.aureus.
Quy trình:
Bước 1:lấy dd muối vào tiêu bản
Trang 25