Báo cáo: Thí nghiệm vi sinh môi trường ĐH Công nghiệp thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG


Báo cáo: THÍ NGHIỆM
VI SINH MÔI TRƯỜNG
SVTH: Ngô Thái Bảo : 3009110516
Trần Thị Hồng Cẩm:3009110470
Trần Thiên Ân:3009110373
Nguyễn Dũ:3009110440




TP.HCM,tháng 6 năm 2013

MỤC LỤC
PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 1
1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: 1
1.1. Dụng cụ 1
1.2. Thiết bị 5
PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH 10
2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời 10
2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường 11
2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : 12
2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật. 13
2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật. 15
2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu. 18
2.2.7 Phương pháp hộp đổ 19

2.2.8 Phương pháp hộp trải 20
2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn 22
2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) 23
2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi 26
PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG 28
3.1. Vi sinh vật phân giải cellulose 28
3.1.1. Nguyên tắc 28
3.1.2. Kết quả 28
3.1.3. Nhận xét: 31
3.2. Vi sinh vật phân giải phosphor 31
3.2.1. Nguyên tắc 31
3.2.2. Kết quả 31
3.2.3. Nhận xét: 32
3.3. Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá 32
3.3.1. Nguyên tắc 32
3.3.2. Kết quả 33
3.3.3. Nhận xét: 35
3.4. E.coli,Coliform 36

3.4.1. Nguyên tắc 36
3.4.2. Kết quả 36
3.5. Vi sinh vật trong xử lý nước thải: 38
3.5.1. Nguyên tắc 38
3.5.2. Kết quả 40
3.5.3. Nhận xét 41
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
4.1. Kết luận 42
4.2. Kiến nghị 42
4.3. Bài học kinh nghiệm 43

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 1

PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học:
1.1. Dụng cụ
Dụng cụ
Hình ảnh
Công dụng
Đĩa petri


Chứa môi trường nuôi
cấy VSV.



Ống nghiệm


Dùng để chứa đựng
dung dịch với thể
tích nhỏ, nuôi cấy vi
sinh vật trong môi
trường lỏng hay môi
trường thạch.
Bình tam giác.

Chứa môi trường nuôi

cấy hay dung môi hóa
chất trong pha chế môi
trường.

Phiến kính và lá
kính.


Phiến kính:chứa giọt
VSV ở trạng thái sống
hoặc nhuộm màu khi
quan sát bằng kính
hiển vi.






Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 2

Lá kính : dung để đậy
lên giọt VSV trên
phiến kính để quan sát
trạng thái sống của tế
bào VSV.

Cốc thủy tinh

Dùng để chứa cồn, hóa
chất…

Que trang

Trải giọt sinh khối
VSV lên bề mặt thạch.

Que cấy vòng

Ria trên bề mặt thạch
hay phân lập VSV
trên bề mặt thạch
hoăc cấy chuyền trên
môi trường lỏng




Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 3

Đèn cồn

Tạo không gian vô

trùng, khử trùng các
loại que cấy.
Micropipette

Định lượng một thể
tích chính xác VSV,
môi trường nuôi cấy
hay dung dịch hóa
chất.

Kính lúp

Quan sát các vật có
kích thước nhỏ.
Phễu thủy tinh.



Chuyển dung môi từ
dụng cụ chứa này
sang dụng cụ chứa
kia dùng khi miệng
dụng cụ chứa nhỏ.
Ống đong.

Sử dụng để định mức
lượng hóa chất cần
dùng với độ chính xác
cao.

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 4

Cối.

Nghiền nhỏ mẫu đất.

Bình tam giác có nút
mài.


Dùng để chứa cồn
hoặc các loại hóa chất
dễ bay hơi trong
không khí.

Chậu thủy tinh

Chứa rác như giấy
báo,gang tay, khẩu
trang … đã sử dụng.

Giá để ống nghiệm

Để ống nghiệm tránh
vỡ, lăn ra ngoài…
Kẹp sắt

Dùng để giữ vật mà
yêu cầu không sử
dụng tay để giữ, vd :
giữ phiến kính hơ trên
ngọn lửa cồn, tn phân
giải xenlulozo…





Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 5


Giá để pipet

Dùng để để pipet, đũa
thủy tinh.
Bình tia

Chứa nước cất.
Bóp cao su

Sử dụng hơi để hút

hóa chất thông qua
pipet.
1.2. Thiết bị
Thiết bị
Cách vận hành
Hình ảnh
Nồi hấp
khử trùng
- Mở nắp nồi hấp, lấy
hai giỏ inox ra ngoài.
- Cho nước cất vào nồi
hấp đến khi ngập con ốc cảm
ứng khoảng 1-2 cm tiếp tục
cho giỏ inox lớn vào nồi
hấp.
- Cho dụng cụ và môi
trường cần hấp khử trùng
vào giỏ nhỏ rồi đưa vào nồi
hấp.
- Đóng nắp và khóa van.





Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 6

- Bật công tắt ở bên

hông, cài đặt thông số nhiệt
độ,áp suất, thời gian, bấm
lần lượt các nút “set” và
“start”.
- Khi đã có tín hiệu thì
mở nồi hấp ra, chờ 1 phút
cho bớt nóng và lấy dụng cụ
môi trường ra (nếu muốn hạ
áp suất của nồi hấp thì mở
nắp nồi hấp ) .













Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 7

Tủ sấy
- Mở cửa tủ sấy cho vật
liệu sấy vào và đóng lại ( đẩy

thanh tay cầm sang trái để
mở, sang trái để đóng).
- Cắm nguồn điện chờ
10s rồi mới bật on/off để mở
máy.
- Nhấn phím “▲▼” để
chọn chương trình P3, chờ 5s
để xác nhận chương trình đã
chọn .
- Nhấn phím X/W để cài
nhiệt độ sấy( dùng phím
“▲▼” để cài nhiệt độ ).
- Nhấn phím X/W để cài
thời gian sấy ( dùng phím
“▲▼” để cài thời gian), nếu
chạy liên tục thì để thời gian
cài đặt bằng 0.
- Chờ 5s máy tự động
lưu thong số vừa cài ở bước 4
và 5.
- Khi đạt nhiệt độ sấy
màn hình nhấp nháy liên tục
hai thông số đã cài đặt, khi
thời gian cài đựt về 0 thì kết
thúc quá trình sấy, tắt tủ sấy
lấy vật liệu sấy ra.
- Vệ sinh tủ sấy

Cân điện tử

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 8

Máy lắc
ống nghiệm
- Cắm điện.
- Đặt ống nghiệm lên phần
núm đen .
+ Bật công tắc lên nếu
muốn sử dụng chế độ lắc
gián đoạn(Manual). Nhấn
nhẹ và giữ chặt ống nghiệm
trong vài giây rồi nhấc ống
nghiệm ra.
+ Bật công tắc xuống nếu
muốn sử dụng chế độ lắc liên
tục(Continuous)

Lò vi ba


Bếp điện

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 9

Máy dập
mẫu


Kính hiển
vi quang
học

- Đặt tiêu bản
lên bàn mẫu, dùng
kẹp để cố định tiêu
bản.
- Chọn vật kính:
tùy theo mẫu tiêu bản
và mục đích quan sát
mà ta chọn vật kính
thích hợp.
- Nhỏ 1 giọt dầu soi lên
phiến kính khi soi vật kính
x100.
- Điều chỉnh ánh sáng
- Điều chỉnh tụ quang
- Điều chỉnh cỡ màn
chắn tương ứng với vật kính.

- Mắt nhìn thị
kính, tay vặn ốc chỉnh
thô đến khi thấy hình
ảnh mờ, tiếp tục điều
chỉnh ốc chỉnh tinh
đến khi nhìn rõ vật





Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 10

PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN
TÍCH VI SINH
2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời
Nội dung công
việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Rửa sạch
lam và lamen
o Cho lam và
lamen vào chậu
thủy tinh
o Đổ dd HCl
10% vào và ngâm
trong phút

o Rửa lại
bằng nước


Sử dụng gang tay, khẩu
trang trong quá trình
thao tác.
Bước 2: cho một
giọt sinh khối
VSV lên phiến
kính.


Nếu là nấm mốc thì ta
phải cố định bằng một
giọt nước.
Bước 3: Đặt lá
kính lên phiến
kính.
o Đặt lá kính
song song với
phiến kính cách
phiến kính
khoảng 2 cm
o Đặt lá kính
từ từ xuống
phiến kính, dung
khăn giấy khô
thấm nước tràn
ra bên ngoài.

Có thể đặt lá kính lên
phiến kính bằng cách:
đậy lá kính sao cho chân
của lá kính chạm vào
giọt nước hay giọt màu,
nghiêng một góc  45
0

và hạ lá kính xuống để
có bọt khí



Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 11

2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường
Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Cân từng thành
phần của môi trường

 Cân chính xác
lượng hóa chất
 Tắt hết thiết bị quạt
Bước 2: hòa tan từng

thành phần của môi
trường trong một lượng
nước nhỏ. Sau đó trộn lẫn
tất cả các thành phần dinh
dưỡng với nhau và thêm
nước cho đủ thể tích

 Đối với môi trường
đặt như agar phải
nấu tan chảy xong
mới hòa tan các
thành phần khác
Bước 3: Phân phối môi
trường vào các dụng cụ
chứa, đóng nút bông, bao
gói giấy báo




Bước 4: Đặt tiêu
bản lên bàn mẫu,
điều chỉnh kính
hiển vi để quan
sát.

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 12

Bước 4: Hấp tiệt trùng
trong nồi hấp và làm
nguội tới nhiệt độ thích
hợp và gieo cấy vsv

 Hấp tiệt trùng ở
121
0
C, trong 15
phút

2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng :
Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Rửa sạch dụng
cụ và hấp khử trùng

Bao gói dụng cụ trước
khi hấp
Bước 2:Cho vào mỗi
ống nghiệm 7-8 ml
môi trường

o Sử dụng gang
tay ,khẩu trang trong
quá trình thao tác.
o Khử trùng tay
và khu vực làm thí
nghiệm bằng cồn
trước khi tiến hành.
o Thao tác nhanh,
môi trường rất dễ
đông .

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 13

Bước 3: Làm nút bông
và bịt nắp ống nghiệm


Bước 4:
Để các ống nghiệm
nghiêng <25
0
, phần
thạch nghiêng khoảng
1/2-1/3 ống nghiệm.
Chờ môi trường
đông lại, bảo quản ở
nhiệt độ thích hợp.


Chú ý phần thạch
cách miệng ống
nghiệm 2 cm.
Không di chuyển
ống nghiệm khi môi
trường chưa đông đặc.
2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật.
Nội dung công việc

Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Chuẩn bị 1
ống nghiệm thạch
nghiêng có môi trường
phù hợp và 1 ống mẫu
chứa VSV.


Chuẩn bị mẫu VSV
phải đúng và phát
triển tốt.

o Sử dụng khẩu trang trong suốt quá trình cấy.
o Khử trùng sạch tay và bàn làm việc.
Bước 3:
o Tay trái cầm 2
ống nghiệm (ống chứa

Đốt que cấy trên
ngọn lửa đèn cồn đến
khi đỏ




Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 14

mẫu và ống cấy)
o Tay phải cầm
que cấy,ngón út và
lòng bàn tay của tay
phải cầm và giữ nút
bông





Không để ống
nghiệm ở quá xa đèn
cồn
Bước 4:
o Đưa que cấy đã
khử trùng vào bên
trong ống nghiệm
chứa vsv
o Lấy một ít sinh
khối vsv và đậy nút
bông lại



Để vào thành ống
nghiệm cho bớt nóng
Không để đầu que
cấy chạm vào miệng
và thành ống nghiệm

Bước 5:
o Mở nút bông ở
ống thạch cần cấy, khử
trùng miệng ống
nghiệm
o Rồi đưa que cấy
vào đáy ống nghiệm
ria theo đường dzích
dzăc từ dưới kéo về
hướng miệng ống
nghiệm

Tránh để vỡ thạch.
Không ria nhiều
lần.
Bước 6:
o Rút que
cấy ra, hơ miệng
ống nghiệm
o Đóng nút
bông lại
o Khử trùng
que cấy và để





Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 15

vào giá
Bước 7 : Dán nhãn, bao
gói, bảo quản.








2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật.
2.2.5.1. Kỹ thuật hộp ria.
Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Chuẩn bị
o Petri chứa
môi trường thạch
o Ống
nghiệm chứa vsv
cần cấy,nút bông
bằng gạc
o Dụng cụ
cần thiết (que
cấy, cồn, đèn
cồn, bông,…)

Petri không bị nhiễm
sv khác

Bước 2: Dùng bông
gòn thấm nước thấm
cồn sát trùng tay và
mặt bàn chuẩn bị cấy.





Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 16

Bước 3: Dùng máy lắc,
lắc đều ống nghiệm
chứa VSV

Giữ chặt ống nghiệm
tránh làm rơi ra ngoài.
Bước 4:
o Để petri
gần đèn cồn
o Tay trái
cầm ống nghiệm
chứa VSV vừa
lắc xong, tay
phải cầm que
cấy, dùng ngón
tay út mở nút
bông, khử trùng
miệng ống
nghiệm bằng
cách hơ qua
ngọn lửa đèn cồn

Đặt petri và ống
nghiệm gần ngọn lửa
đèn cồn trong phạm vi
< 15cm

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 17

Bước 5:
o Khử trùng
que cấy trên

ngọn lửa đèn cồn
cho đến khi nóng
đỏ.
o Đưa que
cấy vào giữa ống
nghiệm chứa
VSV lấy một ít
sinh khối VSV.
o Khử trùng
miệng ống
nghiệm, tiệt
trùng nút bông
và đóng bông
ống nghiệm và
để que cấy trong
không gian vô
trùng.
o Tay trái
mở nắp petri, tay
phải cầm que
cấy ria trên bề
mặt thạch, đậy
nắp petri lại

o Để que
cấy vào miệng
ống nghiệm cho
bớt nóng.
o Chú ý
thao tác cẩn

thận để không
làm vỡ thạch.
Bước 6:
o Khử trùng que
cấy khi cấy ria xong và
để vào giá đựng
o Ghi tên sinh
viên, môi trường, tên
VSV lên đĩa petri và
bao gói lại bảo quản.

Bao gói cẩn thận bảo
quản để không bị
nhiễm sv khác







Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 18

2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu.
 Với mẫu nước
Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú

Bước 1: Hút 10ml mẫu
cho vào bình tam giác đã
có 90ml nước cất

Lắc đều mẫu
trong bình tam
giác ít nhất 2 phút
ta có được mẫu có
độ pha loãng 10
-1

Bước 2: Dùng pipette vô
trùng hút 1ml mẫu cho
vào ống nghiệm chứa 9ml
nước cất.


Lắc đều ta được
mẫu có độ pha
loãng 10
-2

Làm tương tự như trên đến khi đạt nồng độ yêu cầu.
 Với mẫu đất
Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Chuẩn bị mẫu đất,
dùng cối giã đất nhuyễn
ra, cân 10g cho vào bình

tam giác có chứa 90ml
nước cất.

Lắc đều mẫu,ta
được nồng độ
10
-1
.




Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 19

Bước 2: Lắc đều bình tam
giác chứa mẫu, dùng
pipette hút 1ml cho vào
ống nghiệm chứa 9ml
nước cất.

Lắc đều dung dịch
ta được mẫu có
nồng độ pha loãng
10
-2
.
Tiếp tục thực hiên như các bước trên ta sẽ được nồng độ theo yêu cầu.
2.2.7 Phương pháp hộp đổ

Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Chuẩn bị
o Pha chế môi trường
cần sử dụng để cấy
o Petri, pipette,bao gói
giấy báo và đem hấp khử
trùng


Bước 2:
o Khử trùng tay và nơi
làm việc bằng đèn cồn
o Dùng pipette đã hấp
khử trùng hút 1ml dịch vsv
cho vào đĩa petri vô trùng
chưa có môi trường

o Mẫu chứa
vsv phải dược lắc
đều trước khi hút
o Sử dụng
găng tay và khẩu
trang trong suốt
quá trình thao tác
thí nghiệm

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 20

Bước 3:
Đỗ khoảng 15 – 0ml môi
trường nóng chảy ở 45
0
C
vào đĩa petri đã cấy giống
vsv, đậy nắp đĩa petri
Đặt đĩa petri lên mặt
phẳng ngang, xoay nhẹ đĩa
petri theo 2 chiều ngược
nhau mỗi chiều từ 3 – 5 lần
để dịch vsv dàn đều ở mặt
đáy của đĩa petri và trộn
đều trong môi trường cấy

Xoay đều đĩa
petri để vsv dàn
đều và mặt thạch
bằng phẳng.
Các thao tác
phải được thực
hiện trong không
gian vô trùng (gần
ngọn lửa đèn
cồn).

Bước 4:
Để đông tự nhiên gần
ngọn lửa đèn cồn
Dán tên sinh viên ,môi
trường, VSV,…lên đĩa
petri
Đợi môi trường đông, lật
ngược đĩa petri lại, bao gói
và đem bảo quản ở nhiệt độ
thích hợp



2.2.8 Phương pháp hộp trải
Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1:
o Sử dụng các đĩa petri
chứa môi trường đã chuẩn
bị trước
o Chuẩn bị dụng cụ và
nút bông
o Hấp khử trùng dụng
cụ Khử trùng tay và bàn
làm việc bằng cồn

Sử dụng găng tay
và khẩu trang
trong suốt quá

trình tiến hành



Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 21

Bước 2: Dùng pipette vô
trùng hút 0,1ml dịch vsv
lên bề mặt môi trường
thạch đĩa trong không gian
vô trùng

Hút trong không
gian vô trùng gần
ngọn lửa đèn cồn
Bước 3:
o Nhúng đầu
que trang vào cốc
thủy tinh chứa cồn
70
0
, đốt trên ngọn
lửa đèn cồn để khử
trùng.
o Mở đĩa petri,
dùng que trang gạt
và xoay đều giọt vsv
trên bề mặt thạch

Trong khi gạt,xoay
đĩa petri tới lui 3 – 4
lần, mỗi lần ½ chu vi
cho dịch vsv trải đều
khắp trên bề mặt môi
trường








Thao tác cấy được
thực hiện trong
không gian vô
trùng
Bước 4:
o Rút que trang
khỏi đĩa, đậy đĩa,úp
ngược petri
o Dán nhãn, bao
gói, bảo quản ở nhiệt
độ thich hợp cho
từng vsv mục tiêu

Bao gói kỹ và bảo
quản đúng thời
gian và nhiệt độ

Nhóm 1

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 22

2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn
Nội dung công việc
Hình ảnh minh họa
Ghi chú
Bước 1: Chọn 1 phiến kính
sạch,cố định vsv bằng cách
cho 1 giọt sinh khối vsv
trải đều lên phiến kính, hơ
trên ngọn lửa đèn cồn cho
đến khi khô

Hơ đến khi khô
nhưng không để
cháy.
Bước 2: Cho 1 giọt lớn
phẩm nhuộm đơn
(methylene blue) lên vết
VSV đã cố định để trong 5
phút

Cho giọt dầu đủ
lớn để lắp giọt
VSV.
Bước 3: Hơ lại trên ngọn
lửa đèn cồn, để yên khoảng
2 – 3 phút, dùng bình tia
rửa sạch,tiếp tục hơ khô,
đặt lam kính lên



















Không hơ cháy

Rửa vừa phải
cẩn thận tránh để
vsv trôi theo nước
Bước 4: Nhỏ 1 giọt dầu