Ảnh hưởng của Phytohormone tới sự phát triển chòi, rễ của phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro và một số đặc điểm sinh lí của cây trước và sau giai đoạn ra ngôi

Header Page 1 of 149.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
-------------------------------------

TRẦN THỊ KIM NHUNG

ẢNH HƯỞNG CỦA PHYTOHORMONE
TỚI SỰ PHÁT SINH CHỒI, RỄ CỦA PHONG LAN VANDA
(Vanda sp) in vitro VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÍ CỦA
CÂY CON TRƯỚC VÀ SAU GIAI ĐOẠN RA NGÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2016

Footer Page 1 of 149.


Header Page 2 of 149.

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn “Ảnh
hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi, rễ của phong lan Vanda
(Vanda sp) in vitro và một số đặc điểm sinh lí của cây trước và sau giai đoan
ra ngôi” là trung thực, đầy đủ, rõ nguồn gốc và chưa được sử dụng để bảo vệ
một học vị nào. Các thông tin, tài liệu tham khảo sử dụng trong luận văn này

đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này
đã được cảm ơn.
Tôi xin chịu trách nhiệm trước Hội đồng bảo vệ luận văn, Khoa Sinh KTNN, Phòng Quản lý đào tạo sau đại học và Nhà trường về các thông tin, số
liệu trong đề tài.
Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Trần Thị Kim Nhung

Footer Page 2 of 149.


Header Page 3 of 149.

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi còn
nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các tổ chức, cá nhân trong và
ngoài trường.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS
Cao Phi Bằng người thầy đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn chuyên môn cho
tôi trong thời gian tiến hành nghiên cứu đề tài khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Sư Phạm
Hà Nội 2 cùng các thầy cô giáo trong Khoa Sinh - KTNN trường Đại Học Sư
Phạm Hà Nội 2, các cán bộ phòng sau đại học trường Đại Học Sư Phạm Hà
Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, các bạn trong lớp K18 – Sinh
học thực nghiệm , các sinh viên đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực
hiện đề tài và hoàn thành đề tài này.
Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng luận văn không tránh khỏi những
thiếu sót và hạn chế. Vì vậy, tôi mong nhận được sự quan tâm đóng góp ý
kiến của quý thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 25 tháng 11 năm 2016
Học viên

Trần Thị kim Nhung

Footer Page 3 of 149.


Header Page 4 of 149.

iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... viii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ....................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................................................... 2
4. Những đóng góp mới của đề tài ..................................................................... 2

PHẦN 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1.Tổng quan về lan Vanda ............................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc ................................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và chế độ chăm sóc .................................................... 5
1.1.3.1. Nhiệt độ, ẩm độ, sự tưới nước .................................................................. 5
1.1.3.2. Ánh sáng ................................................................................................... 6
1.1.3.3. Nhu cầu phân bón .................................................................................... 6
1.1.3.4. Giá thể trồng lan ...................................................................................... 6
1.1.3.5. Thay chậu và nhân giống ......................................................................... 7
1.1.3.6. Sâu bệnh ................................................................................................... 7
1.2. Phương pháp nhân giống in vitro................................................................ 7
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................... 7
1.2.2. Các giai đoạn nuôi cấy ............................................................................... 8
1.2.2.1. Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ.............................................. 8

Footer Page 4 of 149.


Header Page 5 of 149.

iv

1.2.2.2. Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động ............................................................. 9
1.2.2.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh......................................................................... 9
1.2.2.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh .......................................................... 10
1.2.2.5. Giai đoạn 5: Đưa cây mô ra ngoài vườn ươm....................................... 10
1.2.3. Các điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................ 11
1.2.4. Môi trường nuôi cấy in vitro.................................................................... 12

1.2.5. Chất điều hòa sinh trưởng ....................................................................... 13
1.2.5.1.Auxin........................................................................................................ 13
1.2.5.2. Cytokinin ................................................................................................ 13
1.3. Các nghiên cứu nhân giống in vitro lan Vanda ....................................... 14
1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................. 14
1.3.2.Trong nước ................................................................................................ 17
1.4. Các nghiên cứu về giai đoạn ra ngôi ........................................................ 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................. 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 21
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................. 21
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................... 21
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 21
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của phytohormone tới sự phát
sinh chồi và rễ..................................................................................................... 21
2.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý ............................................. 26
2.3.2.1. Xác định hàm lượng sắc tố quang hợp (diệp lục, carotenoid) ................ 26
2.3.2.2. Xác định hoạt độ catalase .................................................................... 27
2.3.2.3. Xác định hoạt độperoxidase ................................................................ 28
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 28

Footer Page 5 of 149.


Header Page 6 of 149.

v

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 29

3.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống hạt lan .................... 29
3.2. Ảnh hưởng của kinetin và BAP đến đường hướng phát sinh hình thái
của hạt nảy mầm ............................................................................................... 31
3.3. Ảnh hưởng của kinetin và BAP đến chiều cao chồi nảy mầm từ hạt.... 33
3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi ................................. 34
3.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến chiều cao chồi trong quá trình
nhân nhanh ....................................................................................................... 36
3.6. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến động thái ra lá của cây .................... 37
3.7. Ảnh hưởng của NAA và IAA đến khả năng ra rễ của cây ..................... 37
3.8. Huấn luyện cây con giai đoạn ra ngôi ...................................................... 40
3.8.1. Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây trong ống nghiệm.................... 40
3.8.2. Ảnh hưởng của loại giá thể trồng đến cây lan con ................................ 41
3.8.4. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến sự sinh trưởng của cây ............... 42
3.9. Hàm lượng sắc tố quang hợp .................................................................... 43
3.10. Hoạt độ catalase........................................................................................ 46
3.11. Hoạt độ peroxidase................................................................................... 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 49
1. Kết luận ......................................................................................................... 49
2. Kiến nghị ........................................................................................................ 49
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 51
PHỤ LỤC .......................................................................................................... viii

Footer Page 6 of 149.


Header Page 7 of 149.

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Viết

Đọc

ADPG

Axit 1,3 di photphoglixeric

ATP

Adenorin triphotphat

BA

6-Benzyladenin

BAP

6- Benzylaminopurine

Car

Carotenoit

Chl

Chlorophyl

Chla

Chlorophyla

Chlb

Chlorophylb

IAA

3-indoleacetic acid

IBA

3-indolebutiric acid

MS

Murashige và Skoog

NAA

Napthaleneacetic acid

NADPH

Nicotinamide cidenin dinucleotide photphate hydro

TDZ

1-phenyl-3-1,2,3-thiadiarol-5yl

VW

Vacin and Went

2,4 D

2,4- Dichloro phenoxy acetic acid

Footer Page 7 of 149.


Header Page 8 of 149.

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng nảy mầm của hạt lan .. 29
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến đường hướng phát
sinh hình thái của hạt lan Vanda ........................................................... 31
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi lan Vanda .................. 34
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của NAA và IAA đến khả năng ra rễ của cây ................. 37
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của loại giá thể trồng đến động thái tăng trưởng của cây lan con . 41
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến động thái ra lá và ra rễ của lan Vanda. 42
Bảng 3.7. Hàm lượng sắc tố quang hợp trong mô lá phong lanVanda thời kì ra
ngôi ex vitro .......................................................................................... 44

Footer Page 8 of 149.

Header Page 9 of 149.

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hoa lan Vanda ....................................................................................... 3
Hình 3.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng nảy mầm của hạt lan .. 30
Hình 3.2. Sự nảy mầm của hạt lan Vanda ........................................................... 30
Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến đường hướng phát
sinh hình thái của hạt lan Vanda ......................................................... 32
Hình 3.4. Sự phát sinh hình thái của hạt lan Vanda ............................................ 33
Hình 3.5. Ảnh hưởng của kinetin và BAP đến chiều cao chồi mới phát sinh .... 34
Hình 3.6. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi lan Vanda ......................... 35
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến chiều cao chồi .............................. 36
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến động thái ra lá của cây ................. 37
Hình 3.9. Ảnh hưởng của NAA và IAA đến số rễ TB/cây ................................. 38
Hình 3.10. Ảnh hưởng của NAA và IAA đến chiều dài rễ ................................. 39
Hình 3.11. Sự hình thành rễ lan Vanda ............................................................... 39
Hình 3.12. Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây trong ống nghiệm đến tỷ lệ
sống của cây. ....................................................................................... 40
Hình 3.13.Hàm lượng sắc tố quang hợp trong mô lá phong lanVanda thời kì
ra ngôi ex vitro .................................................................................... 44
Hình 3.14. Hoạt độ catalase phong lan Vanda thời kì ra ngôi ex vitro ............... 46
Hình 3.15. Hoạt độ peroxidase phong lan Vanda thời kì ra ngôi ex vitro .......... 48

Footer Page 9 of 149.

Header Page 10 of 149.

1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm gần đây kinh tế nước ta đang ngày càng phát triển, đời
sống của người dân không ngừng được cải thiện và nhu cầu chơi cây cảnh cũng
được chú ý đến nhiều. Nhu cầu sử dụng hoa nói chung và hoa lan nói riêng
cũng tăng nhanh. Hoa lan thực sự trở thành sản phẩm nông nghiệp có giá trị
kinh tế cao, nó thúc đẩy ngành sản xuất kinh doanh phát triển mạnh mẽ: Thái
Lan, Singapore, Malaysia, Indonesia. trong đó Thái Lan có kim ngạch xuất
khẩu hoa lan cắt cành năm 1987 là 21 triệu USD, năm 1990 26 triệu USD,
năm 1991 là 30 triệu USD, Singapore thu lợi nhuận từ hoa cắt cành mỗi năm
là 10 triệu USD.
Phong lan Vanda (Vanda sp) thuộc họ phong lan (Orchidaceae) giống
Vanda. Lan Vanda là loại lan phổ biến ở vùng nóng, phân bố rộng rãi trên
khắp thế giới như Trung quốc, Indonexia hay Bắc Châu Úc với gồm hơn 45
loài được biết và hơn 1000 loài cây lai tạo. Lan Vanda là một trong số những
giống lan đẹp, phù hợp với mục tiêu trang trí, làm cảnh, nên được nuôi trồng
rộng rãi và có giá trị kinh tế cao Choy [21].
Để đáp ứng được nhu cầu của con người với số lượng lớn, việc nhân
giống loài lan này bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) là
một biện pháp cần được tính đến. Trên thế giới, có một số ít công trình nghiên
cứu xây dựng quy trình nhân giống một số loài lan thuộc giống Vanda đã
được báo cáo [10; 18; 20; 29; 44]. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có công trình
nghiên cứu một cách có hệ thống về sự phát sinh cơ quan của lan Vanda dưới
ảnh hưởng của phytohormone được công bố. Bên cạnh đó, đối với công nghệ
nhân giống in vitro, giai đoạn ra ngôi (huấn luyện cây con để chuyển từ giai
đoạn ống nghiệm ra môi trường tự nhiên) đóng vai trò rất quan trọng. Trong

quá trình này, cây con phải thích nghi với sự thay đổi của môi trường sống từ

Footer Page 10 of 149.


Header Page 11 of 149.

2

nhân tạo đến tự nhiên trong một thời gian ngắn. Do đó, có thể cơ thể chúng sẽ có
những biến đổi về hình thái, giải phẫu cũng như sinh lý rất đáng chú ý để có thể
thích nghi với môi trường mới [11; 31; 34; 35]. Tuy nhiên, những nghiên cứu về
những động thái trên ở thực vật còn ít được thực hiện, đăc biệt với giống lan
Vanda. Những kết quả nghiên cứu về các những biến đổi hình thái, giải phẫu và
sinh lý của lan Vanda giai đoạn ra ngôi có ý nghĩa lớn, cung cấp các thông tin
khoa học bổ ích, đồng thời giúp con người đề ra các biện pháp kĩ thuật để luyện
cây một cách có hiệu quả.
Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu với tên gọi “Ảnh
hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi, rễ của phong lan Vanda
(Vanda sp) in vitro và một số đặc điểm sinh lí của cây trước và sau giai đoan
ra ngôi”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Đánh giá ảnh hưởng của auxin và cytokinin tới sự phát sinh chồi và rễ của
phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lí của cây lan Vanda in vitro trước và
sau giai đoan ra ngôi.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số phytohormone (auxin, cytokinin) tới sự
phát sinh chồi và rễ của phong lan Vanda in vitro.
- Nghiên cứu động thái sinh lý của cây lan Vanda có nguồn gốc in vitro

trong giai đoạn ra ngôi.
4. Những đóng góp mới của đề tài
Đánh giá ảnh hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi và rễ của
phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro
Cung cấp các thông tin khoa học về một số đặc điểm sinh lí của cây trước và
sau giai đoan ra ngôi, góp phần xây dựng quá trình nuôi cấy in vitro lan Vanda.

Footer Page 11 of 149.


Header Page 12 of 149.

3

PHẦN 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tổng quan về lan Vanda
1.1.1. Nguồn gốc
Vanda thuộc họ phong lan (orchideceae), bộ lan (orchidales), lớp Một
lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật Hạt kín (angiospermatophyta).
Vanda là một giống lan phụ sinh của vùng nóng, có một số rất ít mọc
trên đá hay trên đất. Đây là một giống có sự phân bổ rất rộng từ Trung Quốc
đến Hilnalaya và trải dài từ Inđônêxia đến Niu Ghine và phía Bắc Úc. Vanda
gồm hơn 45 loài được biết và trên 1.000 loài cây lai. Phần lớn Vanda đều
thích sống trên thân gỗ mục vì điều này giúp rễ của cây hút được hơi ẩm trong
không khí tốt hơn. Trong vườn nhà, nên trồng Vanda trong giỏ có nhiều lỗ
thoáng, khi lớn treo cao và thả rễ thòng xuống bên dưới.

Hình 1.1. Hoa lan Vanda
Thông thường người ta dùng từ ngữ Hy lạp để đặt tên cây lan, nhưng trong

trường hợp này lại dùng chữ Vanda (Sankrit dùng để chỉ tên cây V. tessellata).
Thế nhưng năm 1819 Robert Brown lại dùng chữ Vanda để đặt tên cho cây V.

Footer Page 12 of 149.


Header Page 13 of 149.

4

roxburghii đã nở hoa tại Anh quốc để vinh danh William Roxburgh, Giám đốc
vườn thảo mộc Calcutta.
Ở Việt Nam có 7 loài Vanda rừng được biết là: V. concolor, V. liouvillei,
V. lilacina, V. denisonaliana, V. fuscoviridis, V. bidupensis và Vanda pumila.
Cả 3 loài sau đều là lan vùng mát có nhiều ở Lâm Đồng. Vanda có sự biến đổi
rất lớn về tính chất thực vật và sự xuất hiện của hoa, nhưng hầu hết chúng đều
là những cây lan có giá trị vì có chồi loa dài mang nhiều hoa to [1].
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Lan Vanda có thân hình trụ với các lóng khá dài, không có giả hành. Lá
hình trụ hoặc tròn dẹp phẳng. Lá dẹp thẳng ở tận cùng thường có răng nhọn
không đều. Phát hoa đứng thẳng và không bằng nhau, phân nhánh. Hoa khá
lớn và khá bền. Lá đài và cánh hoa gần như nhau, bờ mép hơi cong vào. Môi
gắn chặt vào trụ ngắn, vách hoặc cục u. Môi có 3 thùy, thùy giữa có sọc dọc
và 2 cục có nắp che hai phấn khối với vĩ phấn ngắn to và gót đĩa lớn. Quả lan
thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc. Quả có dạng cải dài đến hình
trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở
phía đỉnh và phía gốc. Hạt lan rất nhiều, hạt liti. Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp
chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trưởng
thành sau 2 - 18 tháng.
Dựa vào đặc điểm của lá, chia Vanda thành 2 nhóm lớn:

- Nhóm có hình trụ tròn, đòi hỏi có ánh sáng nhiều nên phải trồng ở nơi
sáng hoàn toàn, không che chắn, thuận tiện cho vùng nóng.
- Nhóm có lá dẹp phẳng, đòi hỏi ánh sáng ít hơn nên có thể trồng ở
những vùng ôn đới có khí hậu lạnh.
Cây lai giữa 2 dạng này cho ra dạng lá thay đổi từ hình lòng máng đến
hình chữ U, cần ánh sáng cao hơn lá dẹp phẳng nhưng thấp hơn lá trụ tròn

Footer Page 13 of 149.


Header Page 14 of 149.

5

Lan Vanda có nhiều màu sắc sặc sỡ, hình dáng vừa tròn, vừa dày. Lan
Vanda có đài hoa luôn lớn hơn hoặc bằng cánh hoa, đồng thời cánh hoa rất
mỏng nhưng độ bền của hoa thì ở thời gian dài. Hoa lan Vanda thường tươi
lâu từ 4 đến 8 tuần, tùy theo khí hậu và giống. Có vài loại lan Vanda tỏa mùi
thơm như V. amesiana, V. denisonianum, V. cristata và V. dearei. Có loại có
vân như V. coerulea hoặc đốm như V. tricolor hay V. sanderiana. Lan Vanda
có thể ra hoa 2 hoặc 3 lần trong một năm nếu được chăm bón đủ điều
kiện.Trồng lan Vanda không khó, nếu ta trồng đúng cách và tạo đủ điều kiện
thích hợp cho cây phát triển thì cây sẽ sống lâu và ra hoa thường xuyên [8].
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và chế độ chăm sóc
Lan Vanda là loài lan đẹp, nó sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 2530oC, độ ẩm cao và thoáng khí. Trong năm Vanda thường xuyên tăng trưởng
không ngừng nghỉ, vì vậy cần cung cấp lượng nước và chất dinh dưỡng đầy
đủ cho cây, không để cây bị khô hạn bất chợt dễ gây nên hậu quả không tốt
cho cây. Có thể cung cấp lượng nước cần thiết cho cây tùy thuộc vào từng mùa
và từng thời điểm thích hợp. Lan Vanda là loại lan nở hoa phụ thuộc vào nhiệt
độ, nó có thể trổ hoa quanh năm, đặc biệt vào mùa nắng, khi nhiệt độ trong

không khí tăng cao [8].
1.1.3.1. Nhiệt độ, ẩm độ, sự tưới nước
Ở Việt Nam Vanda rừng là một loại lan vùng mát, nhưng các Vanda lại
là một loài lan của của vùng nóng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ
25ºC-30ºC, các loài Vanda cần được trồng trong vườn với độ ẩm cao, nhưng
ẩm độ cục bộ trong chậu phải thoáng. Cây tăng trưởng suốt năm không có
mùa nghỉ vì thế không nên để cây bị khô bất cứ thời điểm nào trong năm. Bị
khô hạn bất chợt sẽ gây cho cây mất ổn định về ẩm độ và hậu quả là cây bị
tuột lá, yếu đi. Vì thế đối với các loài thuộc giống này ta phải tưới nước
thường xuyên 2 lần/ngày từ đầu tháng 5 đến cuối tháng 11 và 3 lần/ngày từ

Footer Page 14 of 149.


Header Page 15 of 149.

6

tháng 7 đến cuối tháng 4. Khác với một số giống lan khác, nguyên nhân chủ
yếu quyết định sự ra hoa các loài thuộc giống Vanda là điều kiện nhiệt độ.
Chính vì thế các loài thuộc giống này có thể trổ hoa suốt năm. Nhưng ở thành
phố Hồ Chí Minh, mùa trổ hoa nhiều nhất vẫn là mùa nắng, vào tháng 2, khi
nhiệt độ trong không khí cao nhất trong năm [8].
1.1.3.2. Ánh sáng
Vanda là giống ưa sáng, có những loài thuộc giống này cây trổ hoa lý
tưởng khi được phơi bày ra ánh sáng hoàn toàn. Vanda trổ hoa khi được trồng
dưới điều kiện gần 100% ánh sáng. Tuy nhiên đa số loài chỉ cần 60% ánh sáng,
tức giàn che 40% ánh sáng là đủ.. Do đó độ biến động về cường độ ánh sáng
thay đổi tới 30.000 - 40.000 m/m² [8].
1.1.3.3. Nhu cầu phân bón

Vanda là một trong những giống có nhu cầu về phân bón khá cao và
chúng dễ dàng sử dụng bất cứ một dạng phân bón loại nào, phân bò khô có
thể là loại phân tốt hoặc có thể dùng phân bánh dầu phọng, nhưng hữu hiệu
hơn hết vẫn là phân hóa học với công thức 3-10-10 tưới 2 ngày/lần với nồng
độ 1 muỗng cà phê/4 lít nước. Sở dĩ ta dùng phân bón với chu kỳ cách nhật vì
Vanda không có giả hành nên không dự trữ được dưỡng liệu, ngoài ra giá thể
của Vanda là giá thể thông thoáng đến mức cực đoan chỉ gồm chậu gạch nung
hay giỏ gỗ với các cục than thật to. Do đó sự lưu lại của dưỡng liệu trong giá
thể là không đáng kể cho việc hấp thụ của lan trong thời gian ngắn. Tốt nhất
là dùng phân bón với dạng phun sương, vì loài này là loài phụ sinh và có rất
nhiều rễ trên không [8].
1.1.3.4. Giá thể trồng lan
Vanda là một loại lan không có mùa nghỉ, một biến cố khô hạn rất dễ
làm các loài giống này rụng hết phần lá gần gốc, mà giới chơi lan Việt Nam
thường gọi là “chuồn lá” . Tuy nhiên, ẩm độ cục bộ trong chậu quá cao dễ làm

Footer Page 15 of 149.


Header Page 16 of 149.

7

cho các rễ bị thối. Vì thế, cấu tạo giá thể thật thoáng cho các loài thuộc giống
Vanda. Việc duy trì ẩm độ ổn định là cố gắng của các nhà vườn thông qua sự
tưới hàng ngày [8].
1.1.3.5. Thay chậu và nhân giống
Sự thay chậu các loài thuộc giống Vanda, thường chỉ do nguyên nhân
duy nhất là cây phát triển quá lớn gây ra sự mất cân đối giữa cây và chậu.
Việc thay chậu có thể thực hiện suốt năm nhưng đầu mùa mưa vẫn là thời

điểm lý tưởng cho việc thay chậu.
Cách nhân giống tương tự Hồ điệp. Khoảng 3 tháng 1 lần, ta phun một
dung dịch NAA với nồng độ 0,1 phần triệu (ppm) để kích thích sự mọc rễ.
Đối với loài Vanda, mỗi lần bạn phun kích thích tố rễ sẽ mọc tăng lên 1 bậc.
Như vậy, sau một thời gian cây lan Vanda sẽ có một bộ rễ thật mạnh đủ đáp
ứng các yêu cầu cần thiết [8].
1.1.3.6. Sâu bệnh
Vanda thường bị loài rệp dính màu vàng tấn công, chúng thường nằm trên
bề mặt lá. Loại này cũng thường hút nhựa các lá của giống Dendrobium, cách trừ
cũng là các loại thuốc sát trùng, serpa phun sương lên lá. Bệnh thối đọt tỏ ra
nguy hiểm cho các loài thuộc giống Vanda, khi có hiện tượng này xảy ra, dùng
kéo cắt bỏ đọt lan, sau đó bôi vôi vào vết cắt, phần ngọn được khử trùng trước
khi sử dụng để cắt cây lan khác. Nếu không bệnh sẽ lan truyền trong toàn bộ
vườn lan. Tốt nhất nên ngừa bệnh thường xuyên bằng cách phun các loại thuốc
ngừa nấm Topsin, Zineb, Benomyl nồng độ 1/400, nửa tháng 1 lần [8].
1.2. Phương pháp nhân giống in vitro
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
* Tính toàn năng của tế bào
Theo Haberlandt (1902), mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào
đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo

Footer Page 16 of 149.


Header Page 17 of 149.

8

quan niệm sinh học hiện đại thì: “Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang
toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.

Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh”. Đó chính là tính toàn năng của tế bào, cơ sở lý luận của phương
pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật [2].
* Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
“Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể”. Tuy
nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn
mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích
hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ.
Quá trình đó gọi là sự phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất
là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kĩ thuật nuôi cấy
mô tế bào xét cho đến cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế
bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo, vô trùng) một
cách định hướng dựa và sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở
tính toàn năng của tế bào thực vật [2].
1.2.2. Các giai đoạn nuôi cấy
1.2.2.1. Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải chuẩn bị được nguồn nguyên
liệu thực vật cho quá trình nuôi cấy. Khâu đầu tiên của giai đoạn này có thể
coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu
nuôi cấy) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi
trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và
chủ động nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc
biệt là bệnh virut và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Thông thường, cây mẹ là

Footer Page 17 of 149.


Header Page 18 of 149.

9

cây có những tính trạng tốt, đạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là
những đối tượng đang có nguy cơ tuyệt chủng. Trong trường hợp cần thiết có
thể làm trẻ hoá vật liệu giống [9].
1.2.2.2. Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Khi đã có
nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những
điều kiện vô trùng. Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp: đúng loại
mô, đúng giai đoạn phát triển: người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để
nuôi cấy in vitro. Ngoài ra cũng có thể sử dụng đoạn thân, mảnh lá, ... để tiến
hành nuôi cấy. Người ta thường sử dụng một số loại hoá chất như: HgCl2
0,1%, cồn 700, H2O2, Ca(OCl)2... để khử trùng mẫu cấy. Để tăng tính linh
động của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các chất làm
giảm sức căng bề mặt như tween 20, tween 80, teepol ...Mẫu sau khi được
khử trùng được cấy vào môi trường nuôi cấy khởi động.
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ
sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt [9].
1.2.2.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so
với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy giai
đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân
giống. Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lượng thông qua các con đường: Hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo
phôi vô tính. Phải xác định được môi trường dinh dưỡng và môi trường vật lý
phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất. Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng, chất
phụ gia (nước dừa, khoai tây,...) là đặc biệt quan trọng. Tăng cường chiếu sáng
(16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan

Footer Page 18 of 149.


Header Page 19 of 149.

10

trọng kích thích mô phân hoá mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt 20 - 300C. Yêu cầu
cần đạt được trong giai đoạn này là tạo được hệ số nhân cao [9].
1.2.2.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ
môi trường ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây
hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng
lượng auxin để rễ phát triển. Các chất α - NAA, IBA, IAA thường được sử
dụng ở nồng độ 1 - 5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng. Từ những
chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Lúc này cây con
rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu,
cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng. Yêu cầu cần đạt được trong giai
đoạn này: Cây con tạo ra đủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rễ) [9].
1.2.2.5. Giai đoạn 5: Đưa cây mô ra ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngoài trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần
với môi trường tự nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp thì mang trồng. Để
đưa cây từ ống nghiệm ra môi trường bên ngoài đạt tỷ lệ sống cao cần đảm
bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn về hình thái
nhất định: chiều cao cây, số lá, số rễ. Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích
hợp: giá thể tơi xốp, thoát nước, sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa
cây từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nước
đặc biệt trong 2 - 3 tuần lễ đầu, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh
nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tượng thối nhũn. Điều kiện môi trường trong

giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng
cáp và phòng bệnh cho cây. Đây được xem là công đoạn quyết định khả năng
ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất [9].

Footer Page 19 of 149.


Header Page 20 of 149.

11

1.2.3. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
* Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình nuôi cấy mô
tế bào. Nếu không mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn sẽ thối và chết.
Vô trùng dụng cụ và môi trường: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các
thao tác mẫu cấy được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Để vô trùng dụng cụ
và môi trường nuôi cấy, có thể sử dụng một trong các phương pháp khử trùng
khô (các dụng cụ bằng kim loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt),
khử trùng ướt (môi trường và các dụng cụ nuôi cấy), màng lọc (môi trường
mà thành phần của nó bị phân huỷ ở nhiệt độ cao).
Vô trùng mẫu cấy: với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu
cấy nhưng ở các vị trí khác nhau... thì phương pháp khử trùng mẫu cấy là
khác nhau. Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng
hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật.
Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hoá
chất khử trùng. Một hoá chất được lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo 2 thuộc
tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu thực
vật. Các hoá chất hay được sử dụng đó là: hypoclorit canxi (nồng độ 5-15%
w/v), hypoclorit natri (nồng độ 10- 20% v/v), oxy già (nồng độ 10-12% v/v),

thuỷ ngân clorua (nồng độ 0,1-1% w/v), chất kháng sinh (50-100 mg/l)... Để
tăng tính linh động của hoá chất diệt khuẩn,người ta thường sử dụng thêm các
chất làm tăng sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol...
hoặc có thể phối hợp xử lý với cồn 700 [3].
* Ánh sáng và nhiệt độ.
Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phòng nuôi ổn định về
ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trường hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ
một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình nhân giống của

Footer Page 20 of 149.


Header Page 21 of 149.

12

chúng cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phòng nuôi cây thường được
duy trì từ 25 - 280C nhờ các máy điều hoà nhiệt độ [3].
1.2.4. Môi trường nuôi cấy in vitro
* Thành phần hóa học của môi trường
Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lượng và vi lượng)
được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Thành phần hữu cơ: Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol, thành phần hữu
cơ phức hợp, dịch chiết hoa quả, củ, nước ép cà chua, nước ép cam, nước ép chuối
xanh, nước dừa.
Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng là thành
phần không thể thiếu được trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng
trong phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều
hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử
dụng trong nuôi cấy.

Nguồn cacbon: Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang
hợp hoặc quang hợp nhưng ở cường độ rất thấp. Vì vậy phải đưa thêm những
hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy. Loại hydratcacbon
được sử dụng phổ biến là đường saccarozơ với hàm lượng từ 2 - 6% (w/v).
Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol,... rất ít dùng.
Hàm lượng đường thấp được sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngược lại hàm
lượng đường cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi.
Tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Chất
tạo gen được sử dụng phổ biến là agar (thạch). Hàm lượng agar sử dụng từ 0,510 % (w/v) tuỳ theo chất lượng của chúng và môi trường sử dụng.
Than hoạt tính: được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol,
các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp... Trong trường hợp những chất đó có tác

Footer Page 21 of 149.


Header Page 22 of 149.

13

dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào
môi trường, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng [3].
* pH của môi trường
pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5
-6,0. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0
agar có thể rất cứng. Nếu trong môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị
pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển sang
dạng không có hoạt tính [3].
1.2.5. Chất điều hòa sinh trưởng
1.2.5.1.Auxin
Tác dụng kích thích phân chia và kéo dài tế bào. Chồi đỉnh cung cấp

auxin gây ức chế sinh trưởng chồi bên khi kết hợp với etylen. Kích thích sự
mọc rễ ở cành giâm, kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô. Có
vai trò khác nhau trong sự rụng lá, quả, đậu quả, sự chín của quả. Có vai trò
trong quá trình tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus), kích thích tạo chồi bất định
ở nồng độ thấp. Nồng độ thường sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào 0,1- 5mg/l.
Auxin gồm hai nhóm tự nhiên: IAA (3-indoleacetic acid) và nhân tạo: IBA
(3-indolebutiric acid), NAA (Napthaleneacetic acid), 2,4-D (2,4-DDichlorophenoxyacetic acid) [3].
1.2.5.2. Cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormon liên quan chủ
yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi
cấy mô. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine
(BAP) hoặc 6- benzyladenin (BA), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6- amine
(kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin).
Zeatin là cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo [3].

Footer Page 22 of 149.


Header Page 23 of 149.

14

1.3. Các nghiên cứu nhân giống in vitro lan Vanda
1.3.1. Trên thế giới
Năm 1985, Mathews và Row nuôi cấy in vitro cây lai hoa lan Vanda
(Vanda TMA x Vanda Miss Joaquim) nghiên cứu ảnh hưởng của mô phân
sinh đỉnh, lá và đoạn rễ đến sự nhân giống, ảnh hưởng của các chất điều hòa
sinh trưởng auxin (IAA, IBA, BTOA, 2,4D) và cytokinin (BA, Kn, i-P) và
than hoạt tính đến sự nhân giống hoa lan. Kết quả cho thấy, đỉnh sinh trưởng
kích thước 0,2 – 0,3 mm cho kết quả phản ứng tốt nhất. Môi trường có bổ

sung 1 mg/l IAA có phát sinh chồi đạt 50%, môi trường bổ sung 2,4D 1 mg/l
có phát sinh mô sẹo đạt 40% từ đỉnh sinh trưởng [20].
Năm 2004, Sinha và Roy nhân giống lan bản địa V. teres (Roxb.) Lindl. qua
nuôi cấy in vitro từ hạt. Sử dụng môi trường VW (Vacin and Went) bổ dung 1,0
mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, 2% sucrose và 2 g/l peptone. Tỷ lệ nảy mầm tốt nhất
đạt được trong môi trường có bổ sung 10% nước dừa. Rễ phát triển dài nhất trong
môi trường bổ sung 2 g/l bột chuối và 100 mg/l carein. Cây trồng ngoài tự nhiên
sau 2 đến 3 năm cho hoa nở [46].
Năm 2006, Nguyễn Thị Lạng và Ngô Thị Hằng sử dụng phương pháp
công nghệ sinh học để nhân giống lan Vanda. Đầu rễ và các mẩu lá được
nuôi trong môi trường 1/4MS bổ sung 1-phenyl-3-(1,2,3- thiadiazol- 5yl) –
urea (TDZ, 0,1-3mg/l), 2,4 D , 3-10mg/l) trong 4 tuần. Các mô sẹo được cấy
duy trì trong cùng môi trường, sau hai tháng tỷ lệ mô sống đạt 90% [32].
Năm 2010, Kaur và Bhutani thực hiện nhân giống in vitro V. testacea
(Lindl.) Reichb.f. một loại lan quý hiếm có giá trị dược liệu cao. Nghiên cứu ảnh
hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự ra rễ và tỷ lệ sống sót của cây con.
Kết quả cho thấy môi trường Mitra có bổ sung 1,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA và
than hoạt tính cho hệ số nhân chồi cao và cây con phát triển tốt. Cây con trồng
trong giá thể chứa 1 than : 1 gạch : 1 sơ dừa, tỷ lệ cây sống đạt 75% [29].

Footer Page 23 of 149.


Header Page 24 of 149.

15

Năm 2009, Rahman và cộng sự tiến hành nhân giống in vitro lan V.
tessellata L. từ chồi cây nuôi cấy mô. Thí nghiệm tiến hành trên môi trường
MS với nồng độ auxin và cytokinin khác nhau. Kết quả cho thấy môi trường

MS có bổ sung 1,5 mg/l NAA và 1,0 mg/l BAP cho hệ số nhân chồi cao nhất
cũng như chiều dài chồi tốt nhất. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA
và 1,0 mg/l IBA cây ra rễ tốt nhất. Cây con được trồng trong giá thể chứa sơ
dừa, đá, than củi và gạch theo tỷ lệ 2:1:1:1 [38].
Năm 2010, Jawan và cộng sự nuôi cấy in vitro lan V. dearei, nghiên cứu
ảnh hưởng của môi trường, chất phụ gia và nguồn đường lên sự phát sinh
protocorm của lan. Kết quả cho thấy protocorm phát sinh trên cả 3 loại môi
trường thí nghiệm là ½ MS tiếp đến là Knudson và phát sinh tốt nhất trên môi
trường VW. Các môi trường có bổ sung 0,2% (w/v) cao nấm men làm tăng
khả năng phát sinh protocorm. Sự tạo thành lá và rễ tốt hơn khi nồng độ
đường trong môi trường giảm, nồng độ thích hợp là 2% (w/v) và sử dụng
đường sucrose là tốt nhất. Khi nồng độ đường tăng lên 4% (w/v) tạo thành
cây có kích thước lớn [26].
Năm 2011, Manners và cộng sự nhân giống in vitro lan Vanda coerolea
bằng hạt 10 đến 11 tháng. Kết quả cho thấy trong môi trường Murashige và
Skoog (MS) tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 71,8%, trong môi trường MS có bổ sung 5
µM BAP hoặc 5 µM IAA tỷ lệ hạt nảy mầm tăng lên đạt 94,4% và 92,6%.
Trong môi trường MS có bổ sung 5 µM BAP và 15 µM IAA hệ số nhân chồi
đạt 13,2 chồi và số rễ trung bình đạt 5,1 rễ [33].
Năm 2012, Islam và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai
tây đến sự nảy mầm và phát sinh chồi của hạt lan V. roxburgii cho thấy dịch
chiết khoai tây tăng cường khả năng nảy mầm và phát triển chồi của hạt lan.
Nồng độ dịch chiết 200 ml/l làm tăng sự nảy mầm của hạt từ 17,2% lên
74,28%. Đặc biệt sự phát sinh chồi, chiều dài chồi, số lượng rễ và chiều dài

Footer Page 24 of 149.


Header Page 25 of 149.

16

của rễ cũng được tăng cường trong môi trường có bổ sung thêm 100 ml/l dịch
chiết khoai tây [23].Năm 2013, Prakash và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của
pH đến quá trình nhân giống hạt lan V. tessellata (Roxb.) Hook.Ex.G. Thí
nghiệm được tiến hành trên môi trường MS với các giá trị pH khác nhau. Kết
quả cho thấy tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất tại giá trị pH 5,5 đạt 95% [37].
Năm 2014, Islam và cộng sự sử dụng công nghệ in vitro để nhân giống V.
roxburghii từ hạt. Sử dụng môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 15%
nước dừa hạt nảy mầm và phát triển tốt nhất. Sử dụng môi trường này thời gian
nảy mầm cũng được rút ngắn từ 35 ngày xuống 22 ngày so với đối chứng [24].
Năm 2015, David và cộng sự cải tiến môi trường nhân giống in vitro lan
V. helvola Blume bằng việc thêm các nguồn hữu cơ khác nhau vào môi
trường. Sử dụng quả lan 120 ngày tuổi để nhân giống trong 3 loại môi trường
MS, Knudson và VW, kết quả cho thấy hạt nảy mầm tốt nhất trong môi
trường Knudson, tỷ lệ nảy mầm đạt 66,4%. Các nguồn hữu cơ khác nhau
được bổ sung vào môi trường Knudson như: nước ép cà chua, nước dừa,
peptone, cao nấm men với các nồng độ khác nhau. Sau 90 ngày nuôi cấy cho
thấy 90% hạt nảy mầm trong môi trường có bổ sung 10% đến 15% nước ép cà
chua. Môi trường trên kết hợp với 0,1% peptone kích thích hạt nảy mầm sớm
hơn, sau 90 ngày cây đạt trung bình 3 lá và 2 rễ [14].
Năm 2015, Sachin nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tạo
thành protocorm của V. tessellata (Roxb.) Hook. ex G.Don. Thí nghiệm được
tiến hành trong giải nhiệt độ (15°C, 20°C, 25°C, 30°C) và pH (4.5, 5.5, 6.5,7.5).
Kết quả cho thấy protocorm được tạo thành và phát triển tốt nhất trong môi
trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng ở nhiệt độ 20°C và pH 5,5. Các
điều kiện nhiệt độ và pH khác sự tạo thành protocorm kém hơn [41].

Footer Page 25 of 149.