Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ex vitro đến sự biến đổi hình thái và sinh lý, sinh hoá của phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) nuôi cấy mô giai đoạn ra ngôi

Header Page 1 of 149.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

TRƢƠNG TRỌNG KIÊN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN ex vitro
ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA
PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM (Dendrobium anosmum)
NUÔI CẤY MÔ GIAI ĐOẠN RA NGÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI, 2016

Footer Page 1 of 149.


Header Page 2 of 149.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

TRƢƠNG TRỌNG KIÊN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN ex vitro
ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA
PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM (Dendrobium anosmum)
NUÔI CẤY MÔ GIAI ĐOẠN RA NGÔI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS.Cao Phi Bằng

HÀ NỘI, 2016

Footer Page 2 of 149.


Header Page 3 of 149.

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản luận văn này, tôi Ďã nhận Ďược rất nhiều sự giúp Ďỡ
của các quí thầy cô, bạn bè, Ďồng nghiệp và gia Ďình. Trước hết, tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới thầy giáo hướng dẫn là TS.Cao Phi
Bằng Ďã tận tình chỉ bảo, giúp Ďỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Sinh lí thực
vật, Khoa Sinh học và Phòng Sau Ďại học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 Ďã tạo Ďiều kiện cho tôi Ďược học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các cán bộ, công nhân viên, các thầy
cô giáo và các em sinh viên khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Hùng
Vương, tỉnh Phú Thọ Ďã tạo mọi Ďiều kiện giúp Ďỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia Ďình, người thân và
toàn thể bạn bè, Ďồng nghiệp Ďã cổ vũ, Ďộng viên, giúp Ďỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2016
Tác giả

Trƣơng Trọng Kiên

Footer Page 3 of 149.


Header Page 4 of 149.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam Ďoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và không trùng lặp với các Ďề tài khác. Tôi cũng xin cam Ďoan
rằng mọi sự giúp Ďỡ cho việc thực hiện luận văn này Ďã Ďược cảm ơn và các
thông tin trích dẫn trong luận văn này Ďã Ďược ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả

Trƣơng Trọng Kiên

Footer Page 4 of 149.


Header Page 5 of 149.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu..............................................................2
5. Giả thuyết khoa học....................................................................................2
PHẦN 2. NỘI DUNG ...................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU............................. 4
1.1. Giới thiệu chung về phong lan Phi điệp tím .................................................... 4
1.1.1. Vị trí phân loại, phân bố ............................................................................. 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 4
1.1.3. Ý nghĩa, tầm quan trọng của phong lan Phi điệp tím……………4
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào........................................................................ 6
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào ................................................... 7
1.2.2. Các giai đoạn nuôi cấy ................................................................................ 8
1.3. Các nghiên cứu nhân giống phong lan và giai đoạn ra ngôi ...................... 11
1.3.1. Các nghiên cứu nhân giống phong lan..................................................11
1.3.2. Các nghiên cứu về giai đoạn ra ngôi ......................................................13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 16
2.1. Đối tƣợng, phạm vi và thời gian nghiên cứu ................................................. 16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 16

Footer Page 5 of 149.


Header Page 6 of 149.

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái .......................................................17
2.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh ...........................18

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu giải phẫu ......................................................24
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu (4) ........................................................................... 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 25
3.1. Đặc điểm hình thái của phong lan Phi điệp tím giai đoạn ra ngôi ............ 25
3.1.1. Đặc điểm của lá ..........................................................................................25
3.1.2. Đặc điểm của thân .....................................................................................26
3.1.3. Đặc điểm của rễ .........................................................................................27
3.2. Hàm lƣợng nƣớc, hàm lƣợng chất khô trong mô lá cây Phi điệp tím...... 28
3.3. Khả năng giữ nƣớc của mô lá .......................................................................... 31
3.4. Cƣờng độ thoát hơi nƣớc của mô lá ................................................................ 33
3.5. Hàm lƣợng sắc tố quang hợp ........................................................................... 35
3.6. Huỳnh quang diệp lục ........................................................................................ 37
3.7. Hoạt độ catalase .................................................................................................. 39
3.8. Hoạt độ peroxidase ............................................................................................. 41
3.9. Hàm lƣợng prolin trong mô lá ......................................................................... 42
3.10. Đặc điểm giải phẫu của lan Phi điệp tím giai đoạn ra ngôi...................... 45
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 47
Kết luận ........................................................................................................................ 47
Kiến nghị ...................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 498
Tài liệu tiếng việt ..................................................................................... 499
Tài liệu tiếng nƣớc ngoài .......................................................................... 49
PHỤ LỤC ẢNH

Footer Page 6 of 149.


Header Page 7 of 149.

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Hàm lƣợng nƣớc, hàm lƣợng chất khô trong mô lá phong lan Phi
điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro ...............................................................................29
Bảng 3.2. Động thái sự mất nƣớc của mô lá phong lan Phi điệp tím thời kì ra
ngôi ex vitro .................................................................................................................32
Bảng 3.3. Cƣờng độ thoát hơi nƣớc của mô lá phong lan Phi điệp tím thời kì
ra ngôi ex vitro ............................................................................................................34
Bảng 3.4. Hàm lƣợng sắc tố quang hợp trong mô lá phong lan Phi điệp tím
thời kì ra ngôi ex vitro ...............................................................................................35
Bảng 3.5. Huỳnh quang diệp lục lá phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex
vitro………………………………………………………..………..…………38
Bảng 3.6. Hoạt độ catalase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro ...39
Bảng 3.7. Hoạt độ peroxidase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex
vitro............................................................................................................................40
Bảng 3.8. Hàm lƣợng prolin của cây phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex
vitro……………………………..………………………………….………….43

Footer Page 7 of 149.


Header Page 8 of 149.

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Phong lan Phi điệp tím .............................................................................. 5
Hình 3.1. Sinh trƣởng tƣơng đối của lá phong lan Phi điệp tím thời kì luyện
ex vitro.. ........................................................................................................................25
Hình 3.2. Sinh trƣởng tƣơng đối của thân cây phong lan Phi điệp tím thời kì
luyện ex vitro.. .............................................................................................................27
Hình 3.3. Sinh trƣởng tƣơng đối của rễ cây phong lan Phi điệp tím thời kì
luyện ex vitro… ..........................................................................................................28
Hình 3.4. Hàm lƣợng nƣớc và hàm lƣợng chất khô trong mô lá phong lan Phi

điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro. ..............................................................................29
Hình 3.5. Khả năng giữ nƣớc cả lá cây phong lan Phi điệp tím thời kì luyện
ex vitro…………………………………………………………….….………33
Hình 3.6. Cƣờng độ thoát hơi nƣớc cả lá cây phong lan Phi điệp tím thời kì
luyện ex vitro. ..............................................................................................................34
Hình 3.7. Huỳnh quang diệp lục lá phong lan phi Điệp tím thời kì ra ngôi ex
vitro……………………………………………………………………………38
Hình 3.8. Hoạt độ catalase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex
vitro.…...............................................................................................................40
Hình 3.9. Hoạt độ peroxidase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex
vitro….................................................................................................................41
Hình 3.10. Hàm lƣợng prolin của cây phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi
ex vitro. .........................................................................................................................43
Hình 3.11. Lát cắt ngang của rễ cây phong lan Phi điệp tím.............................45

Footer Page 8 of 149.


Header Page 9 of 149.

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ/giải nghĩa

1

AC

Than hoạt tính

2

APX

Ascorbate peroxidase

3

Car

Carotenoid

4

Chl

Chlorophyll

5

CNSH

Công nghệ sinh học

6

D

Day/ Ngày

7

ĐC

Đối chứng

8

PLB

Protocorm like body

9

SD

Độ lệch chuẩn

10

Χ

Trung bình

11

TN

Thí nghiệm

Footer Page 9 of 149.


Header Page 10 of 149.

1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Phong lan Phi Ďiệp tím (Dendrobium anosmum) thuộc giống Hoàng thảo
(Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae). Đây là loài lan có hoa Ďẹp, phù
hợp với mục tiêu trang trí, làm cảnh, nên Ďược nuôi trồng rộng rãi và có giá trị
kinh tế cao. Để Ďáp ứng Ďược nhu cầu của con người với số lượng lớn, việc
nhân giống loài lan này bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro)
Ďược thực hiện ở nhiều nơi. Hiện nay, nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình
nhân giống loài lan này Ďã Ďược báo cáo [16]. Đối với công nghệ nhân giống in
vitro, giai Ďoạn ra ngôi (huấn luyện cây con Ďể chuyển từ giai Ďoạn ống nghiệm
ra môi trường tự nhiên) Ďóng vai trò rất quan trọng. Trong giai Ďoạn này, cây
con chịu ảnh hưởng của môi trường sống thay Ďổi từ môi trường nhân tạo Ďến
môi trường tự nhiên trong một thời gian ngắn. Để thích nghi, cơ thể chúng sẽ
có những biến Ďổi về hình thái, giải phẫu cũng như sinh lý rất Ďáng chú ý Ďể có
thể phù hợp với môi trường mới [24; 38; 39]. Những nghiên cứu về những
Ďộng thái trên ở thực vật còn ít Ďược thực hiện, Ďặc biệt với loài lan Phi Ďiệp
tím. Những kết quả nghiên cứu về các biến Ďổi hình thái, giải phẫu và sinh lý
của lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi có ý nghĩa lớn, cung cấp các thông tin
khoa học bổ ích, Ďồng thời giúp con người Ďề ra các biện pháp kĩ thuật Ďể luyện
cây một cách có hiệu quả.

Từ những lí do trên, chúng tôi Ďề xuất Ďề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng
của điều kiện ex vitro đến sự biến đổi hình thái và sinh lý, hóa sinh của
phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) nuôi cấy mô giai đoạn ra
ngôi”.

Footer Page 10 of 149.


Header Page 11 of 149.

2
2. Mục đích nghiên cứu
- Xác Ďịnh Ďược những biến Ďổi hình thái của lan Phi Ďiệp tím trong giai
Ďoạn ra ngôi dưới tác Ďộng của môi trường tự nhiên ex vitro.
- Xác Ďịnh Ďược những Ďộng thái sinh lý, hóa sinh của cây phong lan Phi
Ďiệp tím có nguồn gốc in vitro trong giai Ďoạn ra ngôi.
- Xác Ďịnh Ďược Ďặc Ďiểm cấu tạo, giải phẫu của rễ phong lan Phi Ďiệp
tím giai Ďoạn ra ngôi.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu và phân tích các Ďặc Ďiểm hình thái một số cơ quan sinh
dưỡng (lá, thân, rễ) của cây phong lan Phi Ďiệp tím có nguồn gốc nuôi cấy mô
tế bào thực vật ở giai Ďoạn ra ngôi.
- Nghiên cứu các Ďộng thái sinh lý, hóa sinh của cây phong lan Phi Ďiệp
tím dưới ảnh hưởng của môi trường tự nhiên trong giai Ďoạn ra ngôi.
- Nghiên cứu Ďược Ďặc Ďiểm cấu tạo, giải phẫu của rễ phong lan Phi Ďiệp
tím giai Ďoạn ra ngôi.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: Phong lan Phi Ďiệp tím (Dendrobium
anosmum) có nguồn gốc in vitro.
Phạm vi nghiên cứu: Những biến Ďổi về hình thái, sinh lý, hóa sinh

của phong lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi.
5. Giả thuyết khoa học
Đánh giá Ďược sự biến Ďổi các chỉ tiêu hình thái của cây phong lan Phi
Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Đánh giá Ďược sự biến Ďổi các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cây phong
lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Footer Page 11 of 149.


Header Page 12 of 149.

3
Cung cấp các dẫn liệu khoa học về những biến Ďổi hình thái và sinh lý,
hóa sinh của phong lan Phi Ďiệp tím (Dendrobium anosmum) nuôi cấy mô giai
Ďoạn ra ngôi. Kết quả nghiên cứu của luận văn có thể dùng làm tài liệu tham
khảo cho các nghiên cứu tiếp theo, làm tài liệu cho việc ứng dụng nuôi cấy
mô thực vật và nhân giống cây trồng trong nông nghiệp và lâm nghiệp.

Footer Page 12 of 149.


Header Page 13 of 149.

4
PHẦN 2. NỘI DUNG
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về phong lan Phi điệp tím
1.1.1. Vị trí phân loại, phân bố

Phong lan Phi Ďiệp tím có tên khoa học là Dendrobium anosmum, thuộc
giống Hoàng thảo (Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae), Bộ Lan
(Orchidales), lớp một lá mầm (Monocotyledone), ngành Ngọc Lan, thực vật
hạt kín (Mangoliophyta) [1].
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) rộng rãi từ Ấn Độ qua Malaysia Ďến
Philippines, trong Ďó có Việt Nam [46].
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Lan Phi Ďiệp còn có tên gọi khác như Giả hạc… Đây là một giống
phong lan thông thường thân cao chừng 40-60cm có khi tới 2m buông rũ
xuống. Lá mọc Ďối cách dài 8 – 12cm, rộng từ 4 – 7cm. Hoa to tới 10cm mọc
từ 1- 3 chiếc ở các Ďốt Ďã rụng lá, nở vào mùa Xuân. Dendrobium anosmum
có hai màu sắc chính là tím hồng và trắng. Tuy nhiên có khá nhiều biến dạng
hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím. Hoa có hương thơm ngào
ngạt và lâu tàn (3 – 4 tuần lễ). Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh
khỏe có thể ra tới 50 – 70 hoa [1].
Rễ: Cây có hệ rễ khí sinh, có một lớp hút ẩm dày bao quanh gồm những
lóp tế bào chết chứa Ďầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc. Vì vậy, rễ
hút Ďược nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không
khí, hơi sương và hơi nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt
khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn. Một số loài có thân lá
kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp
cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp [46].

Footer Page 13 of 149.


Header Page 14 of 149.

5

Hình 2.1. Phong lan Phi Ďiệp tím
Thân: Dendrobium thuộc nhóm Ďa thân (còn gọi là nhóm họp trục) có
hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong Ďất gọi là
thân rễ. Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chống tàn chủng
vàng úa và rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không có lá là nơi dự
trữ năng lượng [1].

Footer Page 14 of 149.


Header Page 15 of 149.

6
Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng
một cuống hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất
Ďa dạng [1]. Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại
mọng nước nạc, dai, có màu xanh bóng, Ďậm hay nhạt tuỳ thuộc vào vị trí
sống của cây. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt
hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V. Những lá sát dưới gốc Ďôi khi
giảm Ďi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành [1].
Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ
các mắt ngủ giữa các Ďọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây. Sự biểu
hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa.
Thời gian ra hoa Ďầu mùa mưa hay Ďầu tết. Hoa Phi Ďiệp tím thường mọc ở
gần Ďốt trên thân cây [1; 46].
Quả: Họ Orchidaceae Ďều có quả thuộc quả nang, khi hạt chín, các nang
bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở Ďỉnh và gốc. Ở một số loài, khi chín quả
không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [1].
Hạt: Những hạt giống không chứa các chất dinh dưỡng do gió gieo vãi,
Ďể Ďược nẩy mầm cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết, Ďặc biệt ở

Ďầu các giai Ďoạn phát triển [1].
1.1.3. Ý nghĩa, tầm quan trọng phong lan Phi điệp tím
Phong lan Phi Ďiệp tím là loài lan Ďẹp, phổ biến, dễ trồng, hoa dạng
chùm rủ xuống, lâu tàn, có hương thơm nồng nàn và lan tỏa nên lan Phi Ďiệp
tím ngày càng Ďược người tiêu dùng ưa chuộng. Ngoài việc dùng trang trí,
làm cảnh ra ở một số nước trên thế giới lan Phi Ďiệp tím còn Ďược dùng làm
thuốc chữa bệnh (tên thuốc Ďược dùng trong Ďông y là Thạch hộc hay Kẹp
thảo) như tác dụng giảm Ďau, chống viêm [24].

Footer Page 15 of 149.


Header Page 16 of 149.

7
Trên thế giới, lan Phi Ďiệp tím Ďược nuôi trồng phổ biến ở nhiều nước
như Myanmar, Thái Lan, Malaysia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc,... và Ďã
mang lại giá trị kinh tế cao.
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào
Kỹ thuật nhân giống in vitro Ďã Ďược phát triển trên những cơ sở lý
thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý học thực vật.
Tính toàn năng của tế bào
Theo Haberlandt (1902) mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật Ďa bào
Ďều có khả năng tiềm tàng Ďể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo
quan niệm sinh học hiện Ďại thì: “Mỗi tế bào riêng rẽ Ďã phân hóa Ďều mang
toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và Ďủ của cả cơ thể sinh vật Ďó.
Khi gặp Ďiều kiện thích hợp, mỗi tế bào Ďều có thể phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh”. Đó chính là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào
chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Cho Ďến nay, con

người Ďã hoàn toàn chứng minh Ďược khả năng tái sinh của một cơ thể thực
vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [2].
Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng khác nhau, trong Ďó có nhiều loại tế bào khác nhau thực
hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào Ďó Ďều
bắt nguồn từ tế bào phôi sinh “Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào
phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, Ďảm nhận các chức năng khác
nhau trong cơ thể”. Tuy nhiên, khi tế bào Ďã phân hoá thành mô chức năng
chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp
cần thiết, Ďiều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và

Footer Page 16 of 149.


Header Page 17 of 149.

8
lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình Ďó gọi là sự phản phân hoá tế bào, ngược lại
với sự phân hoá tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực chất là kết quả
của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào
xét cho Ďến cùng là kĩ thuật Ďiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực
vật (khi nuôi cấy tách rời trong Ďiều kiện nhân tạo, vô trùng) một cách Ďịnh
hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn
năng của tế bào thực vật. Để Ďiều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy, người ta thường bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy hai nhóm chất
Ďiều tiết sinh trưởng thực vật Ďó là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hai nhóm chất này
trong môi trường sẽ kéo theo sự phát sinh hình thái khác nhau của thực vật [2].
Sự trẻ hóa

Trong nuôi cấy in vitro, khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau
là rất khác nhau. Vì vậy Ďể chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái
sinh lý hay tuổi mẫu. Các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các Ďiều kiện và
môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, Ďặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi.
Ngoài ra mô non trẻ mới Ďược hình thành, sinh trưởng mạnh, mức Ďộ nhiễm
mầm bệnh ít hơn. Vì vậy việc trẻ hoá là một biện pháp quan trọng nhất trong
nhân giống sinh dưỡng [2].
1.2.2. Các giai đoạn nuôi cấy
Giai đoạn chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Mục Ďích chủ yếu của giai Ďoạn này là chọn Ďược nguồn nguyên liệu
thực vật cho quá trình nuôi cấy. Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy)
Ďược Ďưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên Ďể chúng thích ứng với môi trường
mới, Ďồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ Ďộng
nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh, Ďặc biệt là

Footer Page 17 of 149.


Header Page 18 of 149.

9
bệnh virut và ở giai Ďoạn sinh trưởng mạnh. Thông thường, cây mẹ là cây có
những tính trạng tốt, Ďạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những Ďối
tượng Ďang có nguy cơ tuyệt chủng. Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ
hoá vật liệu giống [8].
Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Là giai Ďoạn khử trùng và Ďưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Khi Ďã có
nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những
Ďiều kiện vô trùng. Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp, Ďúng loại
mô, Ďúng giai Ďoạn phát triển, thường lấy chồi Ďỉnh hay chồi nách Ďể nuôi cấy

in vitro, cũng có thể sử dụng Ďoạn thân, mảnh lá, ... Ďể tiến hành nuôi cấy.
Một số loại hoá chất thường Ďược sử dụng là HgCl2 0,1 %, cồn 700, H2O2,
Ca(OCl)2... dùng Ďể khử trùng mẫu cấy. Để tăng tính linh Ďộng của hóa chất
diệt khuẩn, thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như
tween 20, tween 80, teepol, ... Mẫu sau khi Ďược khử trùng Ďem cấy vào môi
trường nuôi cấy khởi Ďộng. Giai Ďoạn này cần Ďảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ
nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt [8].
Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so
với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Giai Ďoạn
nhân nhanh Ďược coi là giai Ďoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống.
Giai Ďoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lượng thông qua các con Ďường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất Ďịnh và tạo
phôi vô tính. Phải xác Ďịnh Ďược môi trường dinh dưỡng và môi trường vật lý
phù hợp Ďể Ďạt hiệu quả cao nhất. Vai trò của các chất Ďiều hòa sinh trưởng,
chất phụ gia (nước dừa, khoai tây,...) là Ďặc biệt quan trọng. Tăng cường chiếu
sáng (16 giờ/ngày, cường Ďộ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu

Footer Page 18 of 149.


Header Page 19 of 149.

10
tố quan trọng kích thích mô phân hoá mạnh. Bảo Ďảm chế Ďộ nhiệt 20 - 300C.
Yêu cầu cần Ďạt Ďược trong giai Ďoạn này là tạo Ďược hệ số nhân cao [8].
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi Ďã Ďạt kích thước nhất Ďịnh và Ďược chuyển từ môi trường ở
công Ďoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ Ďể hình thành cây hoàn chỉnh. Ở
giai Ďoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin Ďể rễ

phát triển. Các chất α-Naphthalene acetic acid (α-NAA), indole-3-acetic acid
(IAA), Indole-3-butyric acid (IBA) thường Ďược sử dụng ở nồng Ďộ 1 - 5 mg/l
Ďể tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng. Từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất
hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm Ďộ
và bệnh tật do hoạt Ďộng của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang
giai Ďoạn tự dưỡng. Yêu cầu cần Ďạt Ďược trong giai Ďoạn này là cây con tạo
ra Ďủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rễ) [8].
Giai đoạn ra ngôi
Đây là giai Ďoạn quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con
dễ bị chết do sự khác biệt về Ďiều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Cây in
vitro Ďược nuôi cấy trong Ďiều kiện ổn Ďịnh dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt Ďộ, Ďộ
ẩm nên khi chuyển sang môi trường mới với Ďiều kiện hoàn toàn khác hẳn như
dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường Ďộ mạnh, nhiệt Ďộ cao, Ďộ ẩm thấp… cây
con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn Ďến hiện tượng chết [8].
Ở giai Ďoạn này cây con phải chịu nhiều sự thay Ďổi của môi trường sống Ďể
thích nghi với Ďiều kiện mới thì chúng phải có những biến Ďổi nhất Ďịnh về sinh lý
thay Ďổi các thông số quang hợp Ďảm bảo khả năng tự dưỡng của cây trồng với tỷ
lệ tương ứng với Ďiều kiện tự nhiên, hàm lượng diệp lục tăng lên giúp cây thích
nghi với Ďiều kiện ánh sáng cao, Ďộ ẩm không khí giảm, bộ rễ phát triển giúp cây
hút nước nhờ Ďó mà cây tồn tại, sinh trưởng và phát triển Ďược [8].

Footer Page 19 of 149.


Header Page 20 of 149.

11
1.3. Các nghiên cứu nhân giống phong lan và giai đoạn ra ngôi
1.3.1. Các nghiên cứu nhân giống phong lan
Do là loài có nhiều giá trị nên các loài lan, trong Ďó có chi Hoàng thảo

(Dendrobium) thu hút Ďược nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Đầu
tiên là những người làm công tác giống. Trong lĩnh vực nhân giống, Ďối với
lan Hoàng thảo có thể nhân giống bằng phương pháp tách thân hoặc nhân
giống bằng hạt nhưng phương pháp tốt nhất Ďể nhân giống loại lan này là
phương pháp nhân giống in vitro.
Do là chi lan có nhiều giá trị nên Ďến tháng 1 năm 2015 Ďã có khoảng
gần 100 nghiên cứu nhân giống in vitro các loài Hoàng thảo Ďược công bố,
trong Ďó các loài Ďược nghiên cứu nhiều là D. candidum (D. officinale), D.
nobile, D. huoshanense và các giống lai [54]. Kết quả nghiên cứu nhân giống
hạt phong lan Phi Ďiệp tím lấy từ quả 7-9 tháng trên môi trường rắn cho tỷ
lệ nảy mầm tốt trên môi trường MS bổ sung 100ml/l nước dừa [16; 56].
Ở Việt Nam, một số loài thuộc chi Hoàng thảo cũng Ďã Ďược nhân
giống in vitro thành công. Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Thạch hộc Ďã
Ďược báo cáo. Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5
tháng tuổi; môi trường gieo hạt là MS + (100ml ND + 10g saccharose +
6,0g agar)/lít môi trường. Trong nhân in vitro kinh Ďiển, môi trường nhân
nhanh protocorm tối ưu là KC+ (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g
agar)/lít; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS+ (100ml ND + 10g
saccharose + 6,0g agar)/lít. Trong nhân in vitro cải tiến thì nuôi cấy lỏng
lắc nút bông và lỏng lắc màng thoáng khí Ďã tăng hệ số nhân protocorm Ďạt
1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh Ďiển. Nuôi cấy Ďặc thoáng khí giúp
giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân
protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh Ďiển. Nhân nhanh cụm chồi
bằng kỹ thuật bioreactor giảm nửa thời gian nhân giống. Môi trường tối ưu

Footer Page 20 of 149.


Header Page 21 of 149.

12
tạo cây hoàn chỉnh là RE+ (10g sucrose + 0,5g THT)/lít, cường Ďộ ánh
sáng 2300lux [3]. Sau Ďó, lan Thạch hộc thiết bì (D. officinale Kimura et
Migo) cũng Ďược nhân giống thành công. Nhân giống bằng gieo hạt trên
môi trường VW+ 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa (ND)/lít môi
trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100ml ND +
20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường. Nhân giống vô tính
thông qua nuôi cấy Ďoạn thân mang mắt ngủ sử dụng Ďoạn thân in vitro
mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND
+ 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α-NAA + 6g agar/lít môi trường. Môi trường tạo
cây hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg/l αNAA [7]. Lan Hoàng thảo Long nhãn (D. fimbriatum Hook.) là loài lan Ďẹp
Ďược sử dụng làm cảnh và làm thuốc, Ďang Ďe dọa tuyệt chủng. Tiến hành
nghiên cứu nhân in vitro với mục Ďích bảo tồn và phát triển nguồn gen loài
lan quý. Kết quả nghiên cứu Ďã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3
tháng tuổi; Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của
hạt là môi trường MS + 100ml ND + 10g saccharoza + 6,0g agar/lít môi
trường; Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường KC +
100ml ND + 10g sucrose + 60g khoai tây + 6,0g agar/lít môi trường; Môi
trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 60g chuối chín + 6,0g agar/lít môi
trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro ; Môi trường tạo cây
hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 1g THT + 6,0g agar/lít môi trường [6].
Lan Phi Ďiệp tím cũng Ďã Ďược nhân giống thành công nhờ công nghệ in
vitro ở Việt Nam. Cac chồi lan D. anosmum cấy trên môi trường MS có bổ
sung 0,5 mg/l BA và 1,0 mg/l kinetin sinh trưởng mạnh. Khi phối hợp 0,5
mg/l BA với 1,0 mg/l IBA có hiệu quả nhất trong việc kích thích tạo chồi
cây lan D. anosmum in vitro và các chỉ tiêu khác như chiều cao cây, dài rễ,
trọng lượng tươi và khô [9]

Footer Page 21 of 149.

Header Page 22 of 149.

13
1.3.2. Các nghiên cứu về giai đoạn ra ngôi
Các nghiên cứu về các Ďặc Ďiểm hình thái, sinh lí, hóa sinh của cây trồng
trước những biến Ďổi của khí hậu, Ďiều kiện nuôi trồng cũng Ďược quan tâm
sâu sắc. Gần Ďây, những Ďặc Ďiểm này của cây trong giai Ďoạn ra ngôi ex vitro
các cây có nguồn gốc nuôi cấy mô cũng Ďược quan tâm.
Hofman nghiên cứu giai Ďoạn ra ngôi ở Ďối tượng là cây thuốc lá khi
chuyển từ trạng thái in vitro sang ex vitro sau 35 ngày có sự biến Ďổi về hàm
lượng diệp lục, khả năng quang hợp và hàm lượng tinh bột [22].
Tương tự, cây phong lan Doritaenopsis in vitro cũng có những sự thay
Ďổi về Ďặc Ďiểm của hệ sắc tố quang hợp (tăng tỉ lệ carotenoid), hình thái lá
sau 30 ngày ra ngôi ex vitro [27].
Trên phương diện hóa sinh, Van Huylenbroeck nghiên cứu trên cây
Spathiphyllum thấy có sự giảm hoạt tính enzyme sucrose-p-synthase và sự
hoạt hóa ADPG pyrophosphorylase sau giai Ďoạn ra ngôi [57].
Sự hóa gỗ của cây trong quá trình ra ngôi ex vitro cũng Ďược nghiên cứu
ở cây dương [29].
Trong thời kì ra ngôi ex vitro, ở một số thực vật có những lá hình thành
trong Ďiều kiện in vitro không thể tiếp tục phát triển tiếp và dần Ďược thay thế
bằng các lá mới hình thành [17; 41].
Nghiên cứu của Pospóšilová trên cây thuốc lá, ở loài này, số lượng lá
tăng ngay khi chuyển cây ra môi trường ex vitro, trong Ďiều kiện in vitro cây
thuốc lá có 6,7 lá; sau ra ngôi 17 ngày và 45 ngày số lượng lá lần lượt là 13,3
lá và 22,7 lá [40]. Trong một số nghiên cứu trước Ďây cũng chỉ ra rằng khi
chuyển cây từ Ďiều kiện in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên, Ďộ dày lớp biểu
bì, lớp cutin có xu hướng tăng lên [58].
Nghiên cứu hàm lượng nước giai Ďoạn ra ngôi trên cây Malus pumilacủa

Díaz-Pérez, hàm lượng nước của cây này giảm sau 10 ngày ra ngôi và Ďược

Footer Page 22 of 149.


Header Page 23 of 149.

14
phục hồi tương Ďương với hàm lượng nước cây in vitro ở thời kì sau ra ngôi,
hàm lượng chất khô của cây này tăng sau 10 ngày ra ngôi và thời kì sau ra ngôi
hàm lượng chất khô tương Ďương với thời Ďiểm cây trong Ďiều kiện in vitro [19].
Tác giả Nautiyal, 1994 nghiên cứu về hàm lượng chất khô trên thân và rễ
cây bạch Ďàn in vitro, hàm lượng chất khô của cây này tăng mạnh trong thời
kì 4 ngày Ďưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên, sau Ďó giảm dần vào thời kỳ
sau ra ngôi [37].
Nghiên cứu của các tác giả Sciutti và Morini trên cây Prunus cerasifera,
cây trong ống nghiệm với Ďộ ẩm tương Ďối là 100% sẽ bị mất nhiều nước hơn
so với cây Ďược trồng ở Ďộ ẩm tương Ďối từ 70% Ďến 80% [47]; theo Khan et
al, cây Quercus robur trong bình thủy tinh mất nước mạnh hơn so với cây
ngoài tự nhiên trong thời gian 30 phút Ďến 90 phút thí nghiệm [31]; nghiên
cứu của tác giả Romano & Martins-Loucao cho thấy cây in vitro mất nước
nhiều hơn so với cây ex vitro, mất tới 53% và 14% trong 30 phút thí nghiệm
[44]. Theo một số nghiên cứu trước Ďây, khi chuyển cây in vitro ra ngoài môi
trường tự nhiên, lớp biểu bì, lớp cutin có xu hướng dày lên cùng với sự giảm
số lượng khí khổng bề mặt lá và hoạt Ďộng Ďóng mở khí khổng hiệu quả hơn.
Do vậy, khi Ďưa cây ra ngoài sẽ xảy ra hoạt Ďộng bất thường của khí khổng là
nguyên nhân làm cho cường Ďộ thoát hơi nước ở lá diễn ra mạnh hơn [48; 52].
Chỉ số Fv/Fmở một số loài, trong thời kì Ďầu ra ngôi lá bị mất nước
nhanh, chỉ số Fv/Fm giảm xuống nhanh chóng như cây thuốc lá [22], cây
khoai lang Ďược trồng vào môi trường nhân tạo có bổ sung 40g sucrose /lít

môi trường [11] hay cây Doritaenopsis khi Ďược Ďặt ở Ďiều kiện Ďộ ẩm không
khí dưới 70% hoặc nhiệt Ďộ môi trường bằng 15°C, 20°C hoặc 35°C [24].
Hoạt Ďộ catalase của cây Đầu Ďài Ấn Độ tăng lên trong thời kì Ďầu ra
ngôi ex vitro, sau Ďó hoạt Ďộ enzyme này giảm vào cuối thời kì ra ngôi [20]
hoặc cây Tam phỏng [23].

Footer Page 23 of 149.


Header Page 24 of 149.

15
Chakrabarty D. nghiên cứu trên cây Cúc Ďồng tiền, hoạt Ďộ catalase giảm
mạnh khi Ďưa cây ra môi trường ex vitro Ďược 5 ngày và hoạt Ďộenzyme này
tiếp tục giảm vào các thời Ďiểm ngày thứ 10, 15, 20 và 25 ra ngôi [12].
Silva Junior và cộng sự nghiên cứu về giải phẫu rễ của cây L.
purpurata, cây Ďược Ďưa ra ngoài trồng trong môi trường có chứa 75% urê
cho thấy sự thay Ďổi trong cấu trúc giải phẫu rễ, Ďặc biệt có sự gia tăng diệp
lục a và b với cây Ďược xử lý 50, 75 và 100% urê so với cây trong ống
nghiệm [50] và nghiên cứu giải phẫu lá cây Yến Mạch của Aracama và cộng
sự [10] trong giai Ďoạn ra ngôi.

Footer Page 24 of 149.


Header Page 25 of 149.

16

CHƢƠNG 2

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, phạm vi và thời gian nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Phong lan Phi Ďiệp tím (Dendrobium anosmum)
thuộc giống Hoàng thảo (Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae), bộ Lan
(Orchidales), lớp một lá mầm (Monocotyledone), ngành Ngọc Lan, thực vật
hạt kín (Mangoliophyta).
- Địa Ďiểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu CNSH, khoa Khoa học Tự
nhiên- Trường Đại học Hùng Vương và Khoa Sinh học - KTNN, Trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2015 Ďến tháng 7/2016.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Cây phong lan Phi Ďiệp tím in vitro có nguồn gốc từ hạt Ďược nuôi cấy 8
tuần trên môi trường Murashige và Skoog (MS) có bổ sung 30 g/l Ďường
sucrose, 2 g/l than hoạt tính, 6 g/l agar (Qualigens, Mumbai, India). Các bình
cây Ďược Ďặt trong phòng nuôi cây với Ďiều kiện nhiệt Ďộ 25°C/22°C
(ngày/Ďêm), chu kì 12h sáng/12h tối, Ďiều kiện Ďộ ẩm tương Ďối 100%, chiếu
sáng với Ďèn Neon (hãng Rạng Đông, Việt Nam), cường Ďộ ánh sáng khoảng
1920-1990 lux.
Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo rễ, cây có tối thiểu 2-3 lá Ďược
sử dụng cho quá trình ra ngôi ex vitro trong Ďiều kiệntự nhiên (nhiệt Ďộ 20 –
300C, Ďộ ẩm 70 -83% ; cường Ďộ ánh sáng 1236 – 1541 lux).
Các mẫu Ďược thu vào các thời Ďiểm:
- Ngày Ďầu tiên chuyển bình cây ra ngoài môi trường tự nhiên (D0).
- Bình chứa cây Ďược Ďặt ra ngoài cửa sổ cho tiếp xúc với ánh sáng tự
nhiên 7 ngày (D7).
- Cây ở thời Ďiểm (D7) Ďược loại bỏ agar nhẹ nhàng và ngâm cây 5 phút

Footer Page 25 of 149.