Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế steviosid và rebaudiosid a từ cây cỏ ngọt stevia rebaudiana) làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm

Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN KIM ĐÔNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ
REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA)
LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM

NĂM 2016

i


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong đề tài là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì
công trình nào khác.

Tác giả đề tài
Ký tên

Nguyễn Kim Đông

ii


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là để sản xuất steviosid và rebaudiosid A có độ
tinh khiết cao, chiết xuất từ lá cây làm chất tạo ngọt cho thực phẩm và dược
phẩm. Lá Cỏ Ngọt được sấy khô và nghiền nhỏ thành bột, bột lá Cỏ Ngọt
được chiết xuất bằng nước, dịch chiết được kiềm hóa bởi canxi hydroxit và
sau đó bằng sắt (III) clorua, tiến hành khử muối, khử ion, khử màu và làm
bay hơi dịch lọc đến khô thu được hỗn hợp glycosid thô. Hỗn hợp glycosid
thô tiến hành phân lập và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A bằng cách sử
dụng metanol, etanol để kết tủa, thu được steviosid và rebaudiosid A có độ
tinh khiết cao. Tỷ lệ thích hợp của bột lá Cỏ Ngọt và nước trong quá trình
chiết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v. Nhiệt độ và thời gian chiết xuất
tốt nhất là 75oC trong 240 phút và 100oC trong 30 phút. Sự phân lập và tinh
sạch steviosid từ hỗn hợp glycosid thô đã được tiến hành bằng cách sử dụng
metanol để kết tủa. Tỷ lệ hỗn hợp glycosid thô và metanol là giữa 1:2 đến 1:7
w/v, tốt nhất là 1:5, hàm lượng steviosid thu được trong khoảng 91,1-91,5%.

Sự phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng
etanol để kết tủa. Tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5.
Rebaudiosid A với 90,7-90,9% độ tinh khiết thu được. Steviosid và
rebaudiosid A là hai chất tạo ngọt không sinh năng lượng, không đắng, áp
dụng trong thực phẩm và dược phẩm.
Từ khoá: cỏ ngọt, chiết xuất, steviosid, rebaudiosid A , tinh sạch, phân lập

iii


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

ABSTRACT
The purpose of the study is to produce highly purified stevioside and
rebaudioside A from the extract of Stevia rebaudiana Bertoni plant use in
food and drugs. Stevia rebaudiana Bertoni leaves were dried and powdered
leaves being subjected to water extraction and the resulted extract is purified
using treatment with a base such as calcium hydroxide and then iron
chloride,

desalting,

decolorizing,

and

evaporating

the

filtrate

to

drynessobtained glycoside. The mixture of glycosides, conducting isolation
and purification of stevioside and rebaudioside A were developed using
methanol, alcoholic precipitation.The highly purified stevioside and
rebaudioside A were obtained.The preferable ratio of leaves to water is
within the limits of about 1:20 to 1:25, wt/vol.The extraction temperature and
time preferably were at 75oC for 240 min and and 100oC for 30min. The
isolation and purification of Stevioside was developed using methanol
precipitation. The proportion of glycosides and methanol was between 1:21:7 w/v, preferably 1:5, the powder contents were around 91.1-91.5% of
stevioside. The isolation and purification of rebaudioside A was developed
using ethanol precipitation. The proportion of syrup and ethanol was between
1:2-1:7 w/v, preferably 1:5. Rebaudioside A with 90.7- 90.9% purity was
obtained. Steviosid and rebaudiosid A are two sweeteners non-calorie, noncariogenic, non-bitter, applied in foods and drugs.
Keywords: Stevia rebaudiana, extracts, stevioside, rebaudioside A,
purification, isolation.

iv


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................... ii
TÓM TẮT....................................................................................................iii
ABSTRACT.................................................................................................iii
MỤC LỤC .................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................... vi
DANH SÁCH BẢNG.................................................................................viii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT..................................................................... ix
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU .......................................................................... 1
1.1Đặt vấn đề.............................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................. 2
1.3 Nội dung nghiên cứu............................................................................. 2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................... 3
2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt......................................................................... 3
2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt.................................. 3
2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt ..................................................... 7
2.4 Hoạt tính sinh học. ................................................................................ 9
2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật................................................... 11
CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..15
3.1 Nguyên liệu nghiên cứu ...................................................................... 15
3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm ................................................................. 15
3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn .................................................................... 15
v


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ ....................................................................... 15
3.2 Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 16
3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................... 16
3.2.2 Thiết kế thí nghiệm........................................................................ 16
3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài ............................................................. 16
3.2.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 16
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 24
4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly
trích hỗn hợp glycosid thô......................................................................... 24
4.2 Kết quả khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp
glycosid thô............................................................................................... 26
4.3 Kết quả phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và
rebaudiosid A............................................................................................ 27
CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................. 35
5.1 Kết luận .............................................................................................. 35
5.2 Đề nghị ............................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 36
PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ............................ 39
PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ........................................................ 40
PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM.................................. 50
PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN LÂP, TINH SẠCH STEVIOSID VÀ
REBAUDIOSIDA..........................................................................................54

vi


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt ....................................Error! Bookmark not defined.
Hình 2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy
trong lá của cây Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan. ................. 8
Hình 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ lá nước thích hợp trong quá
trình chiết ..................................................................................................... 17
Hình 3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ và thời gian thích hợp trong
quá trình chiết .............................................................................................. 19
Hình 3.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, tinh sạch steviosid và
rebaudiosid A ............................................................................................... 22
Hình 4.1 Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu................................ 25
Hình 4.2 Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích ................... 26
Hình 4.3.1 Sắc ký đồ chuẩn steviosid ........................................................... 28
Hình 4.3.2 Sắc ký đồ mẫu steviosid.............................................................. 29
Hình 4.3.3 Sắc ký đồ chuẩn rebaudiosid A ................................................... 33
Hình 4.3.4 Sắc ký đồ mẫu rebaudiosid A...................................................... 31
Hình 1 Lá Cỏ Ngọt ....................................................................................... 50
Hình 2 Cột Amberlite................................................................................... 50
Hình 3 Dịch sau khi qua Amberlite .............................................................. 51
Hình 4 Bếp cách thủy ................................................................................... 51
Hình 5 Hỗn hợp glucosid.............................................................................. 52
Hình 6 Steviosid……………………………………………………………..52

vii

Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

Hình 7 Lá Cỏ Ngọt nghiền nhỏ……………………………………………...53
Hình 8 Dung dịch Cỏ Ngọt…………………………………………………..53
Hình 9 Quy trình phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosidA.............54

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan của
cây Cỏ Ngọtvà độ ngọt so với đường sucrose. ............................................... 9
Bảng 4.3.1 Kết quả phân lập và tinh sạch steviosid ...................................... 32
Bảng 4.3.2 Kết quả phân lập và tinh sạch rebaudiosid A .............................. 32

viii


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
HPLC

sắc ký lỏng hiệu năng cao

µm

micromet

mg/L

milligram trên lít

mL

millilit

nm

nanomet

% (v/v)

phần trăm thể tích trên thể tích

RT

thời gian lưu

UV – Vis

đầu dò tử ngoại khả kiến

RPF

lưu lượng huyết tương qua thận

GFR

tăng tốc độ lọc cầu thận

LC-MS

sắc ký lỏng khối phổ

ix


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay trên thế giới, con người tiêu thụ một lượng đường rất đáng kể.
Tuy nhiên ngoài mặt lợi đường cũng có những mặt trái của nó do cung cấp
nhiều năng lượng nên có thể gây béo phì, cho dù liều lượng sử dụng không
đáng kể. Vì vậy để tránh béo phì, tiểu đường thì người ta buộc phải dùng
đường ít lại hay dùng một chất tạo ngọt khác để thay thế. Hiện nay, trên thị
trường đã có rất nhiều sản phẩm hoá học tạo vị ngọt dùng để thay thế đường
như saccharin, sodium cyclamate, sucrolose, acefulfame potassium nhưng phổ
biến nhất là chất aspartame. Mặc dù các loại đường này rẻ tiền và tiện dụng

nhưng người ta rất e ngại khi sử dụng vì chúng có thể gây ảnh hưởng xấu đến
sức khoẻ con người về lâu về dài. Qua một số nghiên cứu cho thấy saccharin
gây ung thư bàng quang ở chuột. Vì vậy saccharin đã bị cấm sử dụng ở một
số quốc gia. Trước các nguy hại của đường hoá học, tâm lý chung của người
tiêu dùng là muốn tìm lại sản phẩm đường tự nhiên ly trích từ thực vật. Cây
Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) là loại thảo dược có nguồn gốc từ Nam
Mỹ, lá cây Cỏ Ngọt có chứa các chất ngọt tự nhiên như steviosid (4-13% trên
trọng lượng khô), rebaudiosid A (2-4%), rebaudiosid C, rebaudiosid B (1–
2%), rebaudiosid D, rebaudiosid E và dulcosid A (0,4–0,7%) (Kinghorn et al.,
1991).Trong đó độ ngọt của rebaudiosid A gấp 250 – 450 lần so với đường
mía và steviosid khoảng 300 lần so với đường mía (Cramer et al.,1986). Chất
tạo ngọt chứa trong cây Cỏ Ngọt là loại chất tạo ngọt không sinh năng lượng.
Ngoài ra, chất tạo ngọt trong cây Cỏ Ngọt còn điều trị được bệnh tiểu đường,
hạ đường huyết (Lailerd et al.,2004), béo phì, sâu răng, tăng huyết áp
(Dyrskog et al., 2005), kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm
(Ghosh et al., 2008). Đặc biệt trong cây Cỏ Ngọt có hai loại chất tạo ngọt
steviosid và rebaudiosid A với độ ngọt cao và chiếm hàm lượng lớn nhất.Từ

1


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

những lợi ích to lớn đó đã dẫn đến nhu cầu con người muốn sử dụng sản
phẩm chất tạo ngọt tự nhiên, đặc biệt là hai loại chất tạo ngọt steviosid và
rebaudiosid A. Do đó việc ly trích và tinh sạch để có hai loại chất tạo ngọt

steviosid và rebaudiosid A với độ sạch cao, an toàn cho thực phẩm và dược
phẩm là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế này, “Nghiên cứu chiết xuất và
tinh sạch steviosid và rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana)
làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm” được thực hiện nhằm
góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng quy trình chiết xuất, tinh sạch 02 hợp chất tự nhiên đặc trưng từ cây
Cỏ Ngọt là steviosid và rebaudiosid A làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và
dược phẩm.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành 3 nội dung chính sau đây:
- Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn
hợp glucosid thô.
- Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glucosid
thô.
- Phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A

2


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt
Vào năm 1887, MS Bertoni, một nhà thực vật học là người châu Âu đầu tiên
nghiên cứu về Cỏ Ngọt. Sau đó vào năm 1931, nhà hóa học Pháp đã ly trích

được steviosid. Steviosid là hợp chất tinh thể màu trắng có độ ngọt rất cao.Từ
đó Cỏ Ngọt được sử dụng như một chất làm ngọt ở Anh trong thế chiến II.
Nhật Bản đã sử dụng Cỏ Ngọt để thay thế cho saccharin sau khi nó bị cấm sử
dụng vào những năm của thập niên 70 và chất ngọt từ Cỏ Ngọt được tiêu thụ
tại Nhật Bản với số lượng rất lớn so với bất kỳ quốc gia nào khác. Tại Bắc
Mỹ và Châu Âu, Cỏ Ngọt bắt đầu được sử dụng như là sản phẩm thảo dược
và có sẵn trên thị trường vào những năm 1970 và 1980. Cỏ Ngọt đã được
chiết xuất và cho phép sử dụng ở Mỹ vào năm 1994.
2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt
2.2.1 Thực vật học (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.

Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt

3


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

Họ: Cúc (Asteraceae).
Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 - 0,6 m và có khi cao tới 1m. Thân
cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh.Lá mọc đối,
hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài 5 -7 cm, rộng 1 1 , 5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có
lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn. Hoa
lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn. Quả bế, không có mào lông,
hạt không có nội nhũ. Mùa hoa khoảng tháng 5-9

2.2.2 Phân bố, sinh thái (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Chi Stevia Cav không có một đại diện nào ở vùng châu Á. Cỏ Ngọt đang
được trồng phố biến ở Việt Nam hiện nay, được nhập nội từ một nước Nam
Mỹ (nguồn gốc ở Paraguay) năm 1988. Cỏ Ngọt là cây ưa ấm và ưa sáng, có
thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kỳ cây con. Vốn là cây ở vùng nhiệt đới,
Cỏ Ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng và phát triển tốt vào vụ xuân - hè. Về
mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá và hơi tàn lụi. Cây ra hoa, quả nhiều
hàng năm. Tuy nhiên, người ta thường áp dụng cách nhân giống bằng cắm
cành.
2.2.3 Bộ phận dùng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Phần trên mặt đất của cây Cỏ Ngọt. Thu hái lúc cây xum xuê.
2.2.4 Tác dụng dược lý (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
2.2.4.1 Tác dụng hạ đường huyết: thành phần steviosid trong lá cây Cỏ Ngọt
có tác dụng làm đường huyết giảm rõ rệt ở thỏ, chuột cống trắng và bệnh
nhân mắc bệnh đái tháo đường.
2.2.4.2 Tác dụng giãn mạch: steviosid có tác dụng làm giãn tĩnh mạch toàn
thân rõ rệt.

4


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

2.2.4.3 Tác dụng trên thận và huyết áp: thành phần steviosid trong lá cây Cỏ
Ngọt có tác dụng làm tăng lưu lượng huyết tương qua thận (RPF), tăng tốc độ
lọc cầu thận (GFR), hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừ natri.

2.2.4.4 Tác dụng kháng khuẩn
Cao lá Cỏ Ngọt có tác dụng đối với Pseudomonas aeruginosa và Proteus
vulgaris. Chưa thấy tài liệu công bố về tác dụng trên các vi khuẩn
Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus casei là
những vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở trẻ em, vì hiện nay có
dùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo.
2.2.4.5 Liều dùng an toàn ở người
Nồng độ steviosid trong một số nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 - 0,007%.
Nếu một ngày uống 1 lít thì lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 - 0,07g
tương ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt. Điều đó có thể được chấp nhận vì là liều
an toàn, đã được Nhà nước Nhật cho phép.
2.2.4.6 Độc tính cấp: Cho chuột uống steviosid với liều 2g/kg không thấy có
chuột chết và cũng không thấy có biểu hiện độc sau 2 tuần theo dõi.
2.2.4.7 Độc tính bán cấp: Cho chuột cống trắng ăn với liều dùng hàng ngày
0,5g/kg trong 56 ngày, các thông số theo dõi gồm cân nặng, các chỉ tiêu huyết
học, các chỉ tiêu hoá sinh và xét nghiệm tổ chức học gan đều bình thường.
2.2.4.8 Độc tính trên thận:
Thí nghiệm trên chuột cống trắng, liều cao steviosid có thể gây độc với thận,
làm tăng urê và creatinin huyết thanh.Tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng,
liều 0,4; 0,8; 1,2; l,6g/kg rồi theo dõi độ thanh thải của một số chất có so sánh
với lô đối chứng, thấy từ liều 0,8g/kg trở lên độ thanh thải inulin không thay
đổi, chứng tỏ chức năng lọc cầu thận không bị ảnh hưởng. Độ thanh thải của
glucose tăng, chứng tỏ chức năng tái hấp thu của ống lượn gần bị suy giảm,
5


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

một phần glucose không được tái hấp thu và đã bị thải trừ qua nước tiểu. Độ
thanh thải steviosid cao hơn độ thanh thải inulin, chứng tỏ steviosid còn bị
thải trừ qua niêm mạc của ống thận. Ngoài ra, steviosid cũng gây bài niệu
tăng thải natri niệu và làm tăng độ thanh thải của para-aminohippuric.
Tiêm dưới da cho chuột cống trắng với liều 1,5g/kg, kết quả thấy những thay
đổi giống thí nghiệm trên là tăng nồng độ urê và creatinin trong huyết thanh,
thấy glucose trong nước tiểu. Ngoài ra về tổ chức bệnh học, thấy có biến đổi
hình thái ở tế bào niêm mạc ống lượn gần. Những tổn thương này là do hoạt
động của 2 enzym phosphatase kiềm và gama-glutamyl-transpeptidase tăng
lên. Những enzym này khu trú chủ yếu ở điểm bàn chải của tế bào ống lượn
gần.
2.2.4.9 Khả năng gây đột biến
Nhiều thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây đột biến trên các chủng
Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677,
hoặc trên chủng Escherichia coli WP2 đều xác định cao Cỏ Ngọt không gây
đột biến. Có nghiên cứu cho biết một số chất chuyển hoá của steviosid lại có
thể gây đột biến. Mặc dù steviosid không bị chuyển hoá trong cơ thể và thải
trừ nguyên vẹn qua nước tiểu. Song người ta lo ngại một số tạp khuẩn vùng
màng tràng có thể phân giải được steviosid.
2.2.5 Tính vị, công năng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Cỏ Ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích cho người đái tháo đường và người béo
phì, thuốc ít độc.
2.2.6 Công dụng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
Chữa đái tháo đường: Cỏ Ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu
chất đường và chất bột của người bệnh, vì thế sẽ làm giảm đường huyết. Liều
dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25g steviosid (hoặc 2,5g lá Cỏ
6

Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

Ngọt), ngày 4 lần, uống nhiều ngày. Ngoài ra Cỏ Ngọt và steviosid còn chữa
béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của cơ thể,
nên cũng có tác dụng chữa béo phì. Liều dùng 0,5 - lg steviosid chia ra 3 - 4
lần trong ngày, uống nhiều ngày. Lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid thường dùng làm
chất điều vị cho các loại trà thuốc, trà túi lọc tỷ lệ lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid
trong đó thường thấp. Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có
Cỏ Ngọt như trà actisô - stevia. Trà sâm quy - stevia có sâm khu 5, tam thất,
đương quy, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và Cỏ Ngọt.Trà nhân trần,
thảo quyết minh, Cỏ Ngọt.Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và
Cỏ Ngọt. Chữa cao huyết áp hàng ngày uống trà sotevin. Dùng thay thế
đường sacharose trong công nghiệp thực phẩm để làm chất điều vị cho bánh
mứt kẹo, nước giải khát.
2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt
Trong các loại đường thay thế, chất ngọt tự nhiên đã được xem xét rất nhiều
bởi các nhà nghiên cứu và đường trong cây Cỏ Ngọt được giả định là nguồn
chất tạo ngọt tự nhiên chính. Một loạt các loài cây Cỏ Ngọt đã được nghiên
cứu bởi các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học về các thành phần hóa học
của cây Cỏ Ngọt và chỉ ra có khoảng 110 loài, trong đó có 18 loài có tính
năng tốt (Soejarto et al.,1982). Steviosid là một thành phần chính trong cây
Cỏ Ngọt và steviosid chứa nhiều nhất trong lá của cây Cỏ Ngọt (Geuns,
2003). Cùng với steviosid, một số hợp chất ngọt khác như steviobiosid,
rebaudiosid A, B, C, D, E và dulcosid A cũng đã được tìm thấy trong lá của
Cỏ Ngọt (Savita et al.,2004). Việc xây dựng cấu trúc của các dẫn xuất

steviosid và vị ngọt của nó so với sucrose được nghiên cứu đầy đủ (Cramer et
al.,1986 ), (Geuns, 2003). Kết quả được ghi nhận ở Bảng 2.3 cùng với vị
ngọt, cây Cỏ Ngọt cũng có một số dư vị đắng do sự hiện diện của một số loại
tinh dầu, tannin và flavonoids và đã nhận thấy rằng steviosid và rebaudiosid A

7


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

có trách nhiệm ở một mức độ cho dư vị đắng này, mặc dù vai trò của
rebaudiosid A là ít hơn đáng kể so với các steviosid (Phillips, 1987).

Hình2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy trong lá
của cây Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan.

8


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan của cây Cỏ

Ngọt và độ ngọt so với đường sucrose (Cramer et al., 1986 ), (Geuns, 2003)
Hợp chất

Chuỗi R1

Độ ngọt so với
sucrose

Chuỗi R2

Stevioside

β - Glc

β-Glc-β-Glc (2

Steviolbioside

H

β - Glc - β - Glc (2

1)

β - Glc - β - Glc (2

1)

Rebaudioside A

β - Glc

Rebaudioside B

H

β - Glc – (3

1)

1)
300-350

β - Glc – (3

1)

β - Glc - α - Rha (2

1)

β - Glc

50-120
β - Glc – (3

1)

β - Glc - β - Glc (2
Rebaudioside D

β - Glc - β - Glc (2

β - Glc - β - Glc (2

Dulcoside A

β - Glc

1)

1)

250-450
β - Glc – (3

Rebaudioside E

100-125

250-50

1)

β - Glc - β - Glc (2

Rebaudioside C

300

1)

1)

β - Glc - β - Glc (2

1)

150-300

β - Glc - α - Rha (2

1)

50-120

2.4 Hoạt tính sinh học
Quá trình sử dụng hai thành phần chính của cây Cỏ Ngọt là steviosid và
rebaudiosid A uống bằng đường miệng để kiểm tra độc tính thì được chấp
nhận không độc trong quá trình sử dụng (Medon et al., 1982), (Toyoda et al.,
1997). Sử dụng steviol glycosid với liều cao cho vào miệng của chuột và nuốt
vào bụng cho thấy trọng lượng cơ thể của chuột giảm (Curry et al., 2008),
nhưng không có bằng chứng mạnh mẽ về độc tính (Carakostas et al., 2008),

9


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

(Hagiwara et al.,1984), nghiên cứu tác dụng gây ung thư của steviosid trên
bàng quang thấy rằng không có tiền ung thư hoặc ung thư.
Dịch chiết cũng như các chất tách được từ Cỏ Ngọt có tác dụng mạnh
trong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucose và insulin trong cơ thế.
Theo Chen et al., 2005, khi sử dụng steviosid với liều 0,5 mg/kg sẽ làm giảm
lượng đường glucose trong máu đồng thời hạn chế sự kháng insulin ở chuột
bị tiểu đường. Tác giả Ferreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước Cỏ Ngọt (20
mg/kg/ngày) cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyến hoá glucose trong
gan trên chuột thí nghiệm (Arayjo et al.,2006). Trước đó vào năm 1986, Curi
đã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết nước Cỏ Ngọt trên một nhóm người
tình nguyện. Kết quả cho thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày,
hàm lượng đường glucose trong huyết tương giảm rõ rệt (Curi et al.,1986).
Các nghiên cứu này mở ra khả năng ứng dụng Cỏ Ngọt trong việc chữa trị
bệnh tiểu đường và các bệnh liên quan đến sự chuyển hoá glucose. Ngoài ra,
cùng với tác dụng giảm đường huyết, steviosid còn có tác dụng hạ huyết áp
trên lô chuột bị tiểu đường (Xiao et al., 2003).
Tác dụng chống ung thư và chống viêm của Cỏ Ngọt cũng được nghiên
cứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-0tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Các hợp chất tách được từ cây này
gồm steviosid, rebaudiosid A và C, và dulcosid A ức chế mạnh quá trình gây
viêm đồng thời hỗn hợp các hợp chất này ngăn ngừa tốt sự hình thành ung
thư da trên chuột với liều 1,0 và 0,1 mg/con (Yasukawa et al.,2002).
Hợp chất steviosid còn được sử dụng trong trị liệu chữa tiêu chảy hiệu
quả. Khởi nguồn từ kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng virút
của dịch chiết nóng cây Cỏ Ngọt cho thấy tác dụng diệt mạnh chủng E. coli là
nguyên nhân gây ra bệnh ỉa chảy (Tomita et al.,2002). Các nghiên cứu tiếp
sau đó khẳng định tác dụng và khả năng ứng dụng rất cao của Cỏ Ngọt cũng
10

Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

như nhóm chất steviosid trong việc chữa trị ỉa chảy (Pariwat et
al.,2008),(Shiozaki et al.,2006),(Takahashi et al.,2001).
Ngoài các hợp chất đitecpen, trong cây Cỏ Ngọt còn chứa nhóm chất
phenol và flavonoit. Tác giả Ghanta đã định lượng được hàm lượng nhóm
chất này trong dịch chiết etyl axetat là tương đương 0,86 mg axit galic và
0,83 mg quercetin trên 1 mg. Bằng phân tích LC-MS và phổ NMR, nhóm tác
giả đó nhận dạng được sự có mặt của quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin,
apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside.
Dịch chiết metanol và etyl axetat cho thấy có khả năng diệt các gốc tự do
bằng phương pháp thử DPPH và lipid peroxidation. Nghiên cứu này chứng tỏ
cây Cỏ Ngọt còn là một dược liệu thiên nhiên chống oxy hoá hiệu quả
(Ghanta et al., 2007).
2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ
phân cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
2.5.1 Chọn dung môi chiết
Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm.
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp
đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất

nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong

11


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Metanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen
clorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chloroform như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có
thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được
thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform.

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào.Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các etanol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng etanol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi etanol trong nước có những đặc
tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
metanol trong suốt quá trình chiết (Goad et al.,1997). Thí dụ trechlonolid A
12


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

thu được từ Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolid B bằng quá
trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum
novogranatense được chiết trong metanol nóng. Người ta thường ít sử dụng
nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch
nước của metanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những họp chất
không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton
cũng có thế tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.

Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình
phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của
những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ
đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ
chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết dung
môi được cất ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 30-40ỏC, với một
hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
2.5.2 Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết soxhlet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời
13


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi
có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng

bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

14


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nguyên liệu nghiên cứu
3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm
Nguyên liệu dùng để chiết xuất các đối tượng nghiên cứu của đề tài: lá cây
Cỏ Ngọt dùng để chiết xuất steviosid và rebaudiosid A. Cỏ Ngọt thuộc họ cúc
được mua tại nhà thuốc Minh Phát, 73B Hải Thượng Lãng Ông, phường 10,
quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn
- Metanol (99,99%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)

- Acetonitrile (99,9 %), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- Etanol (99,9%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- Steviosid hydrate (98%), (Sigma – Aldrich)
- Rebaudiosid A (96%),(Sigma – Aldrich)
- Amberlite FPC23 H (Sigma – Aldrich)
- Amberlite FPA51 (Sigma – Aldrich)
- Amberlite FPA98Cl (Sigma – Aldrich)
- Ca(OH)2(96%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- FeCl3 (98%)(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)
- Nước khử ion
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
- Sắc ký lỏng cao áp (HPLC, 20A, Shimadzu, Nhật)
- Thiết bị lọc nước khử ion (TKA, Thermo Fisher scientific, Mỹ)
- Thiết bị đun cách thuỷ (Thermo Haake V15, Mỹ)
- Cân phân tích (Sartorius, MC 210S, Đức)

15


Đề

tài cấp trường 2014 – 2015

Trường Đại học Tây Đô

- Tủ sấy (Memmert, Đức)
-

Lọc polysulfone (Liumar Technologies, Ottawa, Canađa)

- Các thiết bị thông thường khác hỗ trợ cho quá trình phân tích.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ nghiên cứu.

Xây dựng qui trình chiết xuất,
phân lập, tinh chế steviosid &
rebaudiosid A

2 hợp chất đặc trưng từ dược
liệu đạt độ tinh khiết cao.

3.2.2 Thiết kế thí nghiệm
- Cỡ mẫu: tùy theo hàm lượng hợp chất đặc trưng trong dược liệu, khối lượng
dược liệu (cỡ mẫu) sử dụng đủ để chiết xuất nhiều mẻ nhằm thu được 20 g
hợp chất.
- Chiết xuất, phân lập, tinh chế: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí
nghiệm Khoa Sinh học Ứng dụng và phòng thí nghiệm Công nghệ Thực
phẩm Trường Đại học Tây Đô.
- Phân tích và kiểm nghiệm: phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Dược và Điều
Dưỡng Trường Đại học Tây Đô.
3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ 10/2014 đến 10/2015.
3.2.4 Bố trí thí nghiệm
3.2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá
trình ly trích hỗn hợp glycosid thô.
* Mục đích: tìm ra tỷ lệ chiết xuất thích hợp giữa nguyên liệu và nước mà ở
đó hàm lượng glycosid thô cao nhất.
16