Thực phẩm biến đổi gen cây trồng chịu hạn

CHÀO THẦY VÀ CÁC BẠN ĐẾN VỚI BUỔI THUYẾT TRÌNH
CỦA NHÓM 3

Đề Tài:
Thực Phẩm Biến Đổi Gene
Cây Trồng Chịu Hạn


GVHD: Hoàng Anh Hoàng
Nhóm 3


Đôi tương nghiên cưu

•

Cơ chê biêu hiêên

•

Phương phap nghiên cưu

•

Kêt qua

•

Kêt luâên

•

5

4

3

2

1

Nội dung chính


1. Đối tượng nghiên cứu
Basmati là giống lúa dạng hạt dài được trồng phổ biến ở Ấn
Độ.
Giống lúa này là có mùi thơm, hương vị đặc trưng và có chất
lượng tốt.

Giống lúa Pusa Basmati – 1 sinh trưởng và phát triển tốt ở điều
kiện khí hậu ở Việt Nam, có tiềm năng về năng suất và chất
lượng.


Các chủng vi khuẩn và các vector
Chuyển gene OsNAC6 nhờ tế bào khả biến của vi khuẩn A.
Tumefaciens

Vector chuyển gene pBCKH.

Vector nhân dòng pSK II, pUC19-Ubi.
Vi khuẩn nhân dòng E.Coli DH5.


Hóa chất
Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gene bao gồm:
MS, LB, YEM.


Thiết bi
Tủ cấy vô trùng.
Tủ sinh trưởng.
Máy PCR.
Máy giải trình tự.
Máy quang phổ kế.
Máy đo pH.
Máy ly tâm.
Bể ổn nhiệt.
Các thiết bị khác


2. Cơ chế biểu hiện
Thay đổi về hình thái, sinh lí, sinh hoá và phân tử

Về hình thái, sinh lí: đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô.
Mức độ phân tử: gia tăng mức độ biểu hiện và tích luỹ của các gene/protein chống chịu stress.


2. Cơ chế biểu hiện
Các protein tham gia vào quá trình chống hạn của thực vật được chia làm 2 loại:

Nhóm protein chức năng trực tiếp tham gia chống lại với điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mannitol,
sorbitol...)
Nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gene chức năng liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã,
kinase...)


2. Cơ chế biểu hiện
•

* Nhân tố phiên mã OsNAC6

Họ NAC chứa trình tự đồng nhất (được phát hiện từ petunia NAM và từ Arabidopsis ATAF1, ATAF2 và CUC)
- Có vai trò quan trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi
- Phản ứng với điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại tấn công
- Tăng cường tính chịu hạn


2. Cơ chế biểu hiện
•

* Nhân tố phiên mã OsNAC6

Không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với điều kiện hạn
Sự biểu hiện của chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất nhiều gene chức năng khác
Bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi động gene của các gene chức năng => hoạt hóa sự biểu hiện của các gene
này => tăng cường tính chịu hạn


2. Cơ chế biểu hiện

•

* Nhân tố phiên mã OsNAC6
Điều kiện hạn hán

Nhận, truyền tín hiệu
Các gene điều khiển
biểu hiện
Các nhân tố phiên mã
Các gene chức năng biểu hiện

Các gene chức năng

Thực vật tăng cường tính chịu hạn


SƠ ĐỒ THỰC HIỆN
Gene OsNAC6

Phản ứng PCR

Sản phẩm PCR gene OsNAC6 lần 1
E.Coli DH5α
Phản ứng PCR
Nuôi trong LB
Sản phẩm PCR gene OsNAC6 lần 2
Sinh khối E.Coli DH5α
Tinh sạch
Xử lý CaCl2

Vector nhân dòng pSK
Sản phẩm PCR tinh sạch

II

E.Coli khả nạp
Cắt RE + Tinh sạch
Cắt RE + Tinh sạch
Tái tổ hợp

T4 Ligase
Sốc nhiệt

Trải đĩa LB.amp.X-gal

Các dòng E.Coli chứa plasmid

Sàng lọc bẳng PCR
1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene
OsNAC6


SƠ ĐỒ THỰC HIỆN
1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene OsNAC6

Tế bào khả biến Agrobacterium
Hạt lúa

Tế bào mô sẹo

Thiết kế vector chuyển gene mang OsNAC6

Biến nạp

Xâm nhiễm

Chọn lọc

Tái sinh

Kiểm tra cây chuyển
gene

Trồng ngoài thực địa


NHÂN GENE OsNAC6 TỪ THƯ VIỆN BẰNG KỸ THUẬT PCR

Gene OsNAC6

Phản ứng PCR

Sản phẩm PCR gene
OsNAC6 lần 1

Phản ứng PCR

Sản phẩm PCR gene

Chu trình

H2O

: 34.5 μl

Đệm 10X

: 5 μl

Mồi F (10 pmol)

: 2 μl

Mồi R (10 pmol)

: 2 μl

dNTPs 10 mM

: 5 μl

Taq DNA polymerase

: 0,5 μl

Thư viện cDNA

: 1 μl

Tổng thể tích

: 50 μl

Nhiệt độ

Thời gian

o
( C)

( phút )

Khởi đầu

94

5

Biến tính

94

45

Gắn mồi

55

45

Kéo dài

72

60

Ổn đinh

72

7

OsNAC6 lần 2

Chu kỳ

1

Tinh sạch

Sản phẩm PCR tinh sạch

30

1


Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng
cột Genelute

•

TM

Minus Etbr (Sigma Cat # G-2166)

Băng DNA sau khi điện di xác định đúng kích thước sẽ được cắt và chạy qua kim tiêm 1ml để làm nhỏ
trước khi chuyển qua cột.

•
•

Ly tâm cột chứa agarose và DNA ở 12.000 rpm, 10 phút.
Sản phẩm thu được chính là DNA đã được tinh sạch có thể sử dụng cho các phản ứng tiếp theo.


KẾT QUẢ

1

2

M

4

5

900 - 1000 bp

926 bp

Hình : Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gene OsNAC6 từ thư viện.
M- Thang ADN chuẩn 1kb (invitrogene);
Giếng 1, 2 - Sản phẩm ADN khuếch đại lần 1;
Giếng 4, 5 - Sản phẩm PCR lần 2.


GẮN SẢN PHẨM PCR VÀO VECTOR NHÂN DÒNG pSK II
Vector nhân dòng pSK
Sản phẩm PCR tinh sạch

II

Cắt RE + Tinh sạch

Tái tổ hợp

T4 Ligase

Cắt RE + Tinh sạch
Đệm của enzym (10X)

: 5μl

Sản phẩm PCR/vector pSK II (1 μg/μl)

: 20 μl

BamH I (10 unit/μl)

: 2 μl

dH2O

: 23 μl

Tổng thể tích

: 50 μl

o
Phản ứng cắt được tiến hành ở 37 C trong 1 giờ


TINH SẠCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHENOL LẠNH

•

B1: Cắt lấy mẩu gel chứa đoạn DNA có kích thước cần kiểm tra cho vào ống tiêm 1 ml, dùng áp lực đẩy gel agarose chứa DNA qua ống
tiêm 1 ml, sản phẩm được thu trong ống eppendorf 1,5 ml.

•

o
B2: Thêm 800 µl phenol (pH = 8,0), trộn đều bằng vortex, ủ ở -80 C,1h

•

B3: Làm tan hỗn ở nhiệt độ phòng, ly tâm 12.000 rpm, 5 phút.

•

B4: Hút dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung một lượng tương đương dung dịch chloroform : isoamyl alcohol với tỷ lệ
24 : 1. Lắc đều và tiếp tục hút dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới.

•

o
B5: Thêm 1/10 thể tích CH3COOK, pH = 5,2 và 2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối, giữ lạnh. Ủ hỗn hợp ở -20 C, 1 giờ.

•

B6: Ly tâm 12000 rpm trong khoảng 30 phút, thu kết tủa và làm sạch DNA bằng cồn 70%. Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút, thu kết tủa,
làm khô và hoà tan DNA trong thể tích nước hợp lý.


GẮN SẢN PHẨM PCR VÀO VECTOR NHÂN DÒNG pSK II
Vector nhân dòng pSK
Sản phẩm PCR tinh sạch

II

Cắt RE + Tinh sạch

Tái tổ hợp
Cắt RE + Tinh sạch
Đệm của enzym (10X)

: 1 μl

Sản phẩm PCR (50 ng/μl)

: 1 μl

Vector pSK II II (200 ng/μl)

: 1 μl

T4 ligase (10 unit/μl)

: 1 μl

dH2O

: 6 μl

Tổng thể tích

: 10 μl

0
Phản ứng gắn được tiến hành ở 25 C trong thời

T4 Ligase


BIẾN NẠP GENE OsNAC6 VÀO TẾ BÀO E. coli
E.Coli DH5α

Nuôi trong LB

Sinh khối E.Coli DH5α

Xử lý CaCl2

E.Coli khả nạp

Tái tổ hợp
Sốc nhiệt
Trải đĩa LB.amp.X-gal

Các dòng E.Coli chứa plasmid

Sàng lọc bằng PCR

1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene OsNAC6


CHUẨN BỊ TẾ BÀO KHẢ BIẾN E. coli DH5α

•

0
0
Dịch tế bào DH5α giữ ở -80 C được cấy trải trên môi trường LB đặc, nuôi qua đêm ở 37 C, sau đó chọn một khuẩn lạc
o
đơn để nuôi lắc 200 rpm qua đêm ở 37 C trong 5 ml môi trường LB lỏng.

•

0
500 ml môi trường LB lỏng được bổ sung vào 5 ml dung dịch nuôi qua đêm và tiếp tục nuôi lắc 200 rpm ở 37 C khoảng
2 giờ (OD600=0,4 - 0,6).

•

Dịch khuẩn được đem ly tâm ở 3.000 rpm trong thời gian 10 phút, thu cặn tế bào và hoà tan trong 20 ml CaCl 2 0,1M
lạnh.

•

Tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 0,1M; giữ hỗn hợp trên đá trong khoảng 2 giờ, tiếp tục ly tâm ở tốc độ 3.000 rpm
o
trong 10 phút ở 4 C.

•

Cặn tế bào được hòa tan trong 20 ml dung dịch CaCl2 0,1M và 10% glycerol. Tế bào khả biến DH5α vừa chuẩn bị được
o
chia thành từng lượng nhỏ 80 - 100 µl vào các ống eppendorf và bảo quản ở -80 C.


Biến nạp gene OsNAC6 vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

•

10 μl vector nhân dòng pSK II mang gene OsNAC6 đã chuẩn bị ở trên (mục 2.2.1.3) được bổ sung
vào tế bào khả biến DH5α.

•

Hỗn hợp được trộn nhẹ và ủ trong đá 20 phút tạo điều kiện cho các vector bám lên thành tế bào.

•

Sau đó, được thực hiện phản ứng sốc nhiệt bằng việc chuyển hỗn hợp phản ứng trên vào bể ổn nhiệt
0
ở 42 C trong 60 giây, ngay lập tức ủ hỗn hợp vào đá trong 5 phút.

•

Hỗn hợp phản ứng sau đó được trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 100 μg/ml ampicilin,
0
nuôi trong tủ ấm 37 C qua đêm.


Kiểm tra gene OsNAC6 trong khuẩn lạc bằng phản ứng PCR.

•

Sản phẩm PCR và vector pSK II chỉ được gắn với nhau bởi một vị trí enzym giới hạn BamH I nên sản phẩm PCR có
thể gắn vào vector theo chiều xuôi (forward) hoặc ngược (reverse).

•

Vì vậy, phản ứng PCR đặc hiệu với mồi xuôi là mồi của promoter T3 (T3-F) và mồi ngược là mồi đặc hiệu của gene
OsNAC6 (OsNAC6-R) được tiến hành để xác định sự có mặt xuôi chiều của gene OsDREB2A tái tổ hợp với vector
pUC19-Ubi trong khuẩn lạc.

•

Các khuẩn lạc cho sản phẩm PCR là các băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước của gene OsNAC6 được
tiếp tục nuôi để tách plasmid.


1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene
OsNAC6

Tách DNA plasmid từ E.Coli DH5α

Giải trình tự gene OsNAC6

Thiết kế vector chuyển gene mang
OsNAC6