PCR và realtime PCR các vấn đề cơ bản và áp dụng thường gặp

Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

MẪU MÁU
Mục tiêu
·

Giúp được lâm sàng cho các chỉ đònh cấy máu thích hợp nhất vì biết được chỉ đònh cấy máu và thời
điểm tốt nhất để thực hiện cấy máu,

·

Thực hiện đúng cách xét nghiệm cấy máu vì biết được cách thực hiện cấy máu như thế nào, bao
gồm thể tích máu nên lấy để cấy bao nhiêu, nên cấy máu mấy lần?...

·

Lựa chọn được phương tiện thích hợp nhất cho cấy máu trong các bệnh viện hiện nay nhờ biết được
phương tiện (môi trường) phù hợp nhất để cấy máu.

·

Thực hiện tốt qui trình theo dõi cấy máu và cho các kết quả chính xác – kòp thời đến lâm sàng vì
biết được qui trình theo dõi cấy máu

·

Biện luận được một cách chính xác kết quả cấy máu vì biết được các vi khuẩn thường gặp trong cấy
máu là các vi khuẩn nào? Làm thế nào để có thể nhận biết được một cấy máu dương tính thật sự
với một cấy máu dương tính do ngoại nhiễm.

Chỉ đònh cấy máu
¦

Phải chỉ đònh cấy máu trước các trường hợp nhiễm trùng có thể có du khuẩn huyết tạm
thời (transient bacteremia) hay nhiễm trùng huyết (septicemia)..

¦

Do vậy, nên chỉ đònh cấy máu trước các bệnh nhân có một trong các triệu chứng như sốt,
ớn lạnh, lạnh run, tiếng thổi tim (cardiac murmur) nghi ngờ viêm nội tâm mạc, có xuất
huyết ở da hay niêm mạc, xuất huyết dạng sao (splinder) trên móng tay, choáng.

Thời điểm cấy máu
¦

Phải cấy máu trước khi bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống. Trong bệnh viện, Bác só
phải cho cấy máu trước khi bắt đầu cho bệnh nhân dùng kháng sinh.

¦

Tuy nhiên trong các trường hợp bệnh nhân đang điều trò kháng sinh nhưng các triệu chứng
của du khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết vẫn không thuyên giảm thì bác só cũng nên cho
chỉ đònh cấy máu để phát hiện tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng.

¦

Thời điểm tốt nhất để cấy máu là khi bệnh nhân bò ớn lạnh hay đang lạnh run trước khi
sốt, hay lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt..
14

Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

¦

Có thể cấy máu 2 lần trong vòng 1 giờ đầu, và thực hiện cấy máu tại 2 vò trí lấy máu khác
nhau trên cơ thể (vd: lần đầu lấy máu tay mặt thì lần sau lấy máu ở tay trái).

Cách lấy máu để cấy
¦

Lấy máu tónh mạch bằng phương pháp vô trùng (sát trùng da bằng cồn 70%, chờ khô rồi
mới chọc kim lấy máu).

¦

Thể tích máu được lấy để cấy nên chiếm 1/10 hay tối đa là 1/5 thể tích môi trường cấy
máu. Thông thường lấy 3-10ml máu để cấy vào môi trường cấy máu có thể tích 50ml. Đối
với trường hợp bệnh nhân là trẻ em, lấy khoảng 2-3ml máu để cấy là vừa.

Môi trường cấy máu
¦

BHI, TSB hay Columbia broth, cho vi khuẩn hiếu khí.

¦

Để cấy kỵ khí, thêm vào môi trường các chất khử như Thioglycollate, L-cysteine.

¦

Để kháng đông, tốt nhất là dùng Sodium Polyanethol Sulfonate (SPS), nếu không có thì
dùng citrate hay heparin.

Theo dõi cấy máu
¦

Chai cấy máu được ủ trong tủ ấm 35oC hay 37oC và theo dõi mỗi ngày trong 5-7 ngày xem
có dấu hiệu có vi khuẩn mọc hay không trong môi trường cấy máu lỏng, đó là: (1) có hạt
đóng trên mặt hồng cầu, (2) đục đều hay có màng, (3) tiêu huyết, (4) đông huyết tương, (5)
có gas, (6) có hạt trắng trong lớp hồng cầu hay mặt lớp hồng cầu.

¦

Nếu là chai cấy máu có 2 phase thì trước khi ủ và mỗi ngày sau khi quan sát mặt thạch
của phase đặc xem có khúm vi khuẩn mọc hay không? nếu không có khúm vi khuẩn mọc
trên phase đặc, tráng phase lỏng lên phase đặc. Có một số vi khuẩn rất dễ bò ly giải sau khi
mọc trong môi trường lỏng như S. pneumoniae, hay khó mọc thành khúm trên phase đặc
như Streptococci, do đó nên làm một cấy truyền mù lên mặt thạch (thạch máu hay thạch
nâu, sau đó ủ trong tủ ấm CO2 hay bình nến) sau khi ủ chai cấy máu qua đêm hoặc sau 24
giờ.

¦

Bất cứ lúc nào phát hiện có dấu hiệu vi khuẩn mọc (trên phase đặc thấy có khúm vi khuẩn
mọc, hay trên phase lỏng thấy có một trong các dấu hiệu vi khuẩn mọc như kể trên) hay
nghi ngờ vi khuẩn mọc, tiến hành cấy phân lập ngay, tốt nhất là trên thạch bổ dưỡng nhất
15

Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
là thạch nâu có bổ sung XV (CAXV = Chocolate Agar Isovitex), nếu không có thì cấy trên
thạch máu (BA) hay thạch nâu (CA), đồng thời làm một phết nhuộm Gram khảo sát trực
tiếp. Nếu kết quả nhuộm Gram thấy có vi khuẩn, có thể làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai
cấy máu. Nếu trên phase đặc có vi khuẩn mọc thì tiến hành đònh danh và làm kháng sinh
đồ ngay.
¦

Sau 5 ngày theo dõi chai cấy máu, phải cấy truyền mù một lần nữa để chắc chắn không có
vi khuẩn mọc trong chai cấy máu trước khi trả lời cấy máu âm tính.

Các vi khuẩn hay vi nấm thường là tác nhân nhiễm trùng huyết hay nhiễm
nấm huyết.
¦

¦

Gram (-)

Ư

Staphylococcus aureus

Ư

Escherichia Coli

Ư

S. epidermidis

Ư

Klebsiella spp.

Ư

S. pyogenes (nhóm A)

Ư

Enterobacter spp.

Ư

S. agalactiae (nhóm B)

Ư

Proteus spp.

Ư

Streptococci tiêu huyết a

Ư

Samonella typhi

Ư

Samonella (ngoài S. typhi)

Ư

Streptococcus pneumoniae

Ư

Pseudomonas aeruginosa

Ư

E. faecalis (nhóm D)

Ư

Neisseria meningitidis

Ư

Listeria monocytogenes

Ư

Haemophilus influenzae

Ư

Clostridium perfringens

Ư

Bacteroides fragilis

Ư

Peptococcus spp.

Ư

Brucella spp

Ư

Peptostreptococcus spp.

Ư

Pseudomonas pseudomallei

Ư

Candida albicans và các nấm men

(viridans)

khác

Gram (+) và nấm men

Vấn đề vi khuẩn ngoại nhiễm.
¦

Các vi khuẩn ngoại nhiễm có thể
Từ da:
Ư

Ư

Propionobacterium acnes,

Ư

Diphtheroides.

Từ môi trường xung quanh:

Staphylococcus epidermidis,
16


Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Ư

Clostridium spp.,

Ư

Acinetobacter spp.,

Ư

Bacillus spp.

-

phẩm khác cũng trên bệnh nhân đó.
-

-

cấy máu cho thấy vi khuẩn:
-

Vi khuẩn mọc nhanh (trong vòng 48
giờ).

Loại trừ được ngoại nhiễm khi kết quả

¦

Cùng phân lập được từ một bệnh

Các dòng vi khuẩn có cùng type sinh
học và đề kháng như nhau với kháng

Cùng phân lập được từ hai chai cấy

sinh được cấy từ hai chai cấy máu

máu cấy từ một bệnh nhân.

khác nhau trên cùng một bệnh nhân.

Trả lời kết quả cấy máu dương tính
Tất cả các vi khuẩn mọc được trong chai cấy máu đều phải trả lời cho Bác só điều trò. Tham
khảo với Bác só lâm sàng để rút kinh nghiệm trong các trường hợp ngoại nhiễm. Các vi
khuẩn nghi là ngoại nhiễm, không cần thiết phải làm kháng sinh đồ và thông báo cho Bác
só biết sự nghi ngờ này. Phải thường xuyên thông báo cho bác só lâm sàng biết các kết quả
tạm thời bất cứ khi nào thấy có dấu hiệu vi khuẩn mọc bằng các phiếu trả lời kết quả tạm
thời.

Câu hỏi ôn tập
1. Hãy cho biết khi nào một bệnh nhân cần phải được cấy máu?
2. Cấy máu cho bệnh nhân vào thời điểm nào là tốt nhất? Cần phải cấy bao nhiêu lần?
3. Thể tích máu được cấy là bao nhiêu và tỷ lệ máu được cấy so với môi trường cấy máu
nên là bao nhiêu thì tốt?
4. Môi trường cấy máu tốt nhất? Kháng đông bằng gì là tốt nhất và tại sao?
5. Chai môi trường cấy máu thích hợp nhất cho các bệnh viện hiện nay tại Việt Nam là
loại nào? Phân tích các ưu khuyết điểm của chai cấy máu này?
6. Hãy cho biết cách theo dõi một chai cấy máu 2 phase trong phòng thí nghiệm? Dấu
hiệu nào cho biết chai cấy máu dương tính (có vi khuẩn mọc)? Thời gian theo dõi chai
cấy máu cho đến khi trả lời được kết quả cuối cùng là bao lâu?
7. Hãy cho biết các vi khuẩn thường gặp trong cấy máu dương tính?
8. Làm thế nào có thể nhận biết được một cấy máu là dương tính thật sự hay do ngoại
nhiễm?
17

Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

CẤY MÁU – Các câu hỏi thường gặp
Trên thực tế, tỷ lệ cấy máu dương tính tại các bệnh viện rất thấp, có phải là do chỉ đònh
cấy máu quá rộng rãi không?
¦

Thật sự tỷ lệ cấy máu dương tính thấp tại các bệnh viện không phải do chỉ đònh cấy máu
quá rộng rãi mà lại là do lâm sàng ít bao giờ nghó đến việc cho chỉ đònh cấy máu sớm ngay
từ đầu. Lâm sàng chỉ cho cấy máu sau khi đã thất bại điều trò kháng sinh và chính chỉ đònh
cấy máu quá hẹp nầy đã làm cho tỷ lệ cấy máu dương tính tại các bệnh viện rất thấp.

¦

Cấy máu là một xét nghiệm vi sinh lâm sàng cần phải thực hiện trước các trường hợp bệnh
nhân có chẩn đoán lâm sàng nghi ngờ có du khuẩn huyết tạm thời (nhiễm trùng hô hấp
cấp...), nhiễm trùng huyết, hay có nguy cơ nhiễm trùng huyết (thương hàn, nhiễm trùng
tiểu, nhiễm trùng gan mật...). Cấy máu cũng cần phải thực hiện trên các bệnh nhân có các
dấu hiệu nhiễm trùng mạch máu hay tim mạch (viêm valve tim cấp tính hay bán cấp, viêm
nội mạc mạch máu...). Nói chung chỉ đònh cấy máu rất rộng rãi, có thể gần như một chỉ
đònh làm công thức bạch cầu trước các bệnh nhân có dấu chứng nhiễm trùng.

Thời điểm tốt nhất để cấy máu là khi nào, và nên cấy máu mấy lần?
¦

Tốt nhất là cấy máu trước khi cho bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống. Tuy nhiên vẫn
phải chỉ đònh cấy máu trong các trường hợp bệnh nhân đã dùng kháng sinh mà vẫn còn các
dấu hiệu nhiễm trùng tiến triển.

¦

Thời điểm cấy máu tốt nhất là lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt hay lúc bệnh nhân rét run.
Có thể thực hiện hai lần cấy máu cách nhau 1 giờ tại 2 vò trí lấy máu khác nhau (lần đầu
lấy máu tay mặt, lần sau lấy máu tay trái chẳng hạn...)

Nên lấy thể tích máu là bao nhiêu để cấy?
¦

Thể tích máu được cấy là 1/10 hay tối đa là 1/5 thể tích môi trường cấy máu.

¦

Người lớn, mỗi lần cấy, lấy 5-10ml máu cho vào chai 50ml môi trường. Trẻ con có thể từ
1ml đến 3ml cho chai 30 đến 50ml môi trường.

Phương tiện nào hiện nay là thích hợp nhất cho các bệnh viện để cấy máu?
¦

Phương tiện cấy máu thích hợp nhất cho điều kiện của các phòng thí nghiệm lâm sàng hiện
nay là chai cấy máu 2 phase do công ty Nam Khoa sản xuất. Chai cấy máu này có đủ các
ưu điểm của một môi trường cấy máu lý tưởng, của phương pháp cấy máu tại giường thuận
tiện, của phương pháp theo dõi để phát hiện vi khuẩn rất tiện lợi.
18


Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Qui trình theo dõi cấy máu được thực hiện như thế nào? Bao lâu sau thì lâm sàng sẽ có
kết quả cấy máu?
¦

Để theo dõi cấy máu, cần phải ủ chai cấy máu trong tủ ấm 35-37oC liên tục trong 5-7 ngày.
Sau ngày đầu, phải cấy mù lên hộp thạch CA để phát hiện được các vi khuẩn mọc nhanh
và khó thành khúm trên mặt thạch nghiêng của chai cấy máu 2 phase, các ngày sau tráng
phase lỏng lên phase đặc để cấy vi khuẩn mọc trong phase đặc lên mặt nghiêng. Bất cứ lúc
nào phát hiện được vi khuẩn mọc trong phase lỏng hay trên phase đặc thì phải tiến hành
đònh danh và kháng sinh đồ. Ngày theo dõi cuối cùng, phải cấy mù một lần nữa lên thạch
CA để đảm bảo không có vi khuẩn mọc trước khi trả lời kết quả cấy máu âm tính.

¦

Một qui trình cấy máu và theo dõi cấy máu để trả lời kết quả cho lâm sàng tối đa là 7 ngày.
Nhiều trường hợp vi khuẩn mọc nhanh, ta có thể có kết quả trong vòng 48 giờ. Vì cấy máu
cần phải có thời gian như vậy nên bất cứ lúc nào chúng ta phát hiện có vi khuẩn mọc trên
chai cấy máu thì phải trả lời kết quả tạm thời cho lâm sàng trước khi cho kết quả chung
cuộc.

Làm thế nào nhận biết được một chai cấy máu dương tính là do ngoại nhiễm
¦

Một kết quả cấy máu dương tính do ngoai nhiễm có thể nhận biết được khi: (1) Các vi
khuẩn phân lập được là các vi khuẩn hoại sinh như Bacillus subtilis, Bacillus cereus...; (2)
Vi khuẩn cấy được trên hai chai cấy máu trên cùng một bệnh nhân trong cùng một thời
điểm hay trong hai thời điểm cách nhau 30’ đến 1giờ lại có kết quả khác nhau

¦

Một kết quả cấy máu chắc chắn là dương tính thật sự khi: (1) Vi khuẩn cấy được là vi
khuẩn chắc chắn gây bệnh, không thể hoại sinh như: S. typhi, S. pneumoniae, N.
meningitidis...; (2) Vi khuẩn mọc rất nhanh, chỉ 24 giờ sau khi cấy; (3) Vi khuẩn cấy được
trên hai chai cấy máu trên cùng một bệnh nhân cho kết quả giống nhau; (4) Vi khuẩn từ

cấy máu giống hệt vi khuẩn phân lập được từ một nhiễm trùng khác là nguồn gốc gây du
khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết.

19


Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Sản phẩm liên quan:

Chai cấy máu HAI PHASE

Mô tả
¦

Chai cấy máu HAI PHASE (BIPHASIC) là sản phẩm từ đề tài nghiên cứu cấp bộ của TS. BS.
Phạm Hùng Vân. Sản phẩm nầy chỉ dùng một lần (disposable), không dùng lại được. Cấu tạo (xem
hình dưới) gồm các thành phần sau:
1. Chai bằng nhựa polystyrene.
2. Nút cao su để chọc kim cấy máu qua, làm bằng cao su trung tính.
3. Nắp vặn bằng nhựa màu đỏ để mở nắp chai cấy máu cấy truyền khi đã có dấu hiệu vi khuẩn
mọc trong phase lỏng hay trên bề mặt phase đặc.
4. Nắp che bằng nhựa màu xanh lá để bảo vệ phần nút cao su.
5. Phase đặc là mặt môi trường BHI agar (Difco, Biorad hay Merck).
6. Phase lỏng là BHI lỏng (Difco, Biorad hay Merck) có SPS (Sigma).
7. Vách ngăn phase đặc và phase lỏng.

¦

Chai cấy máu được bọc trong màng co, có ghi lot và ngày sản xuất. Khi chưa dùng, bảo quản trong

tối, nhiệt độ phòng thí nghiệm, và có hạn dùng 2 nă m kể từ ngày sản xuất. Nếu bảo quản trong tủ
lạnh, SPS sẽ bò kết tủa lại, nhưng kết tủa nầy sẽ tan sau khi ủ trong tủ ấm vài giờ.

Cách cấy máu
¦

Xé rách màng co, rút nắp che ra khỏi nắp vặn (không vặn nắp).

¦

Sát trùng mặt nút cao su của nắp vặn bằng cồn 70% rồi chờ khô.

¦

Chọc kim cấy qua nút cao su, bơm 3-10ml máu vào phase lỏng.

¦

Đậy nắp che lại. Lắc đều để trộn, tráng qua mặt môi trường phase đặc. Ủ 35-37oC.

Các ưu điểm của chai cấy máu hai phase
¦

¦

Tránh ngoại nhiễm nhờ:
·

Không cần mở nút chai khi cấy máu.

·

Cấy truyền ngay trong chai cấy máu kín từ phase lỏng qua phase đặc.

Môi trường cấy máu lý tưởng vì:
·

Chế từ môi trường BHI của Difco, Biorad hay Merck.

·

Có SPS với các công dụng
20


Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

¦

-

Kháng đông, nhờ đó vi khuẩn không bò bẫy trong cục máu đông.

-

Ức chế thực bào.

-

Ức chế bổ thể.

-

Ức chế tác động của các kháng sinh Aminoglycosides

Tách rời phase đặc khỏi phase lỏng để:
·

Nếu trong máu có chất ức chế vi khuẩn (kháng sinh), chất ức chế từ máu hòa vào phase
lỏng sẽ sẽ không thấm qua phase đặc. Nhờ vậy vi khuẩn không mọc trong phase lỏng
vẫn có thể mọc trong phase đặc.

·
¦

Làm được kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu dương tính.

Tiết kiệm thời gian, có thể làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu dương tính bằng
cách dùng phase lỏng làm huyền dòch vi khuẩn trải lên mặt thạch Mueller Hinton để làm
kháng sinh đồ, đọc kết quả sau 6-8 giờ ủ. 95% các trường hợp này có kết quả phù hợp với
phương pháp chuẩn.
Nắp che
Nút cao su
Nút cao su
Phase đặc
Chai nhựa

Phase lỏng

Hình 1:

Cấu tạo chai cấy máu hai phase

21


Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Một số điểm cần cân nhắc để lựa chọn chai cấy máu 2 phase hiện đang có
mặt trên thò trường việt nam
Chai cấy máu 2 phase sản xuất trong nước
1. Công ty sản xuất đạt ISO 9001:2000, WHO-GMP/GLP (UKASS)
2. Kháng đông bằng SPS của Sigma (Mỹ).
3. Môi trường BHI của Merck (Đức), hay Biorad (Mỹ)
4. Thể tích môi trường 50ml tương thích để cấy máu cho cả người lớn (5ml máu) hay con nít
(1-3ml)
5. Chai bằng nhựa trong suốt, rất dễ phát hiện khúm vi khuẩn mọc
6. Tách rời phase đặc ra khỏi phase lỏng nên khúm vi khuẩn sẽ dễ mọc và dễ tách rời.
7. Dễ thao tác trong thí nghiệm vì nhẹ, miệng chai rộng dễ cho vòng cấy vào bên trong để lấy
dòch cấy cũng như khúm vi khuẩn.
8. Các vi khuẩn khó mọc như H. influenzae hay S. pneumoniae vẫn mọc được dễ dàng.

Chai cấy máu 2 phase của Ấn Độ (Hi-Media)
1. Không chắc kháng đông bằng SPS của Sigma (Mỹ).
2. Môi trường BHI của HiMedia (Ấn Độ), kém xa về chất lượng so với BHI của Merck hay
Biorad
3. Thể tích môi trường <20ml chỉ tương thích để cấy máu cho con nít (1-2ml). Muốn dùng cấy
máu cho người lớn thì phải dùng chai có thể tích môi trường 50ml với giá thành cao hơn.
4. Chai bằng thuỷ tinh dày, khó phát hiện khúm vi khuẩn mọc trên phase đặc và phase lỏng.
5. Không tách rời phase đặc ra khỏi phase lỏng nên khúm vi khuẩn sẽ rất khó mọc trên phase

đặc và dễ bò bong khỏi phase đặc khi thao tác. Ngoài ra nếu bệnh nhân đã dùng kháng sinh
thì kháng sinh sẽ thấm vào phase đặc và ức chế vi khuẩn mọc trên phase đặc.
6. Rất khó thao tác trong thí nghiệm vì nặng, miệng chai hẹp khó cho vòng cấy vào bên trong
để lấy dòch cấy cũng như khúm vi khuẩn
7. Thử nghiệm cho thấy vi khuẩn H. influenzae và S. pneumoniae rất khó mọc trong chai cấy
máu này

22


Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Hình 2: Chai cấy máu 2 phase có vi khuẩn mọc (trái) và chai cấy máu 2 phase chưa cấy bệnh
phẩm (phải)

Hình 3: Chai cấy máu 2 phase nước ngoài dùng môi
trường Hi-media của Ấn Độ

23


Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

D0

Sơ đồ 1: QUI TRÌNH VI SINH LÂM SÀNG CẤY MÁU
VỚI CHAI CẤY MÁU HAI PHASE
D1
D1

Lắc trộn, tráng lên phase đặc

Ủ 37oC
Nếu có dấu hiệu VK mọc

Nếu không có dấu hiệu VK mọc

Qui trình A

Qui trình B

Thực hiện cấy mù

Trên phase đặc không VK mọc
Lấy vài giọt môi trường

Lấy vài giọt môi trường

o

Ủ tiếp 37 C, qua đêm

Nếu trên phase đặc
có khúm vi khuẩn

Đònh danh, kháng sinh đồ

CAXV hay BA.
Ủ 37oC/CO2
Nhuộm Gram

Tiếp tục đến ngày 7

Nếu không có VK
Chờ KQ cấy trên
CAXV hay BA

Có VK mọc

D2

Quan sát chai cấy máu mỗi ngày, cho đến N5.
Sau khi quan sát,, lắc trộn - tráng lên phase đặc.
Sau đó tiếp tụïc ủ

Nếu có vi khuẩn
Làm KSĐ trực tiếp
từ phase lỏng

Không có VK mọc

Đònh danh, kháng sinh đồ

Qui trình B

KQ sơ bộ:
KSĐ trực tiếp
Kết quả chung cuộc

Nếu có dấu hiệu VK mọc Nếu không có dấu hiệu VK mọc

D3-D5
Qui trình A

Trước khi trả kết quả
chung cuộc, thực hiện
cấy mù như qui trình B

Kết quả chung cuộc sau 5 ngày:
Cấy máu (-) nếu không có VK mọc
Cấy máu (+) với KQ đònh danh và KSĐ

Kết quả chung cuộc

24


PCR và dấu vân tay DNA
Lịch sử
Một người da đen (gọi là “X”) sinh tại Vương quốc Anh đã bỏ qua sống với cha của
mình tại Ghana. Sau đó anh ta xin qua trở lại Vương quốc Anh để sống với mẹ (gọi là
“M”) và ba người anh chị em ruột của mình thì bị từ chối cho nhập cảnh vì ngưới ta nghi
ngờ người xin qua Anh quốc lần này (gọi là “X?”) đã bị thay thế bởi một người cháu hay
là một người không thân thuộc gì với bà mẹ. Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh này xảy
ra vào năm 1985, và lúc này xét nghiệm dấu ấn protein (protein markers) đã được thực
hiện và đã xác định được bà mẹ là có liên hệ với “X?” tuy nhiên không thể loại trừ được
M là cô hay dì của “X?”. Thắc mắc này tưởng chừng bế tắc cách giải quyết, nhưng may
thay Jeffereys và các cộng sự đã được nhờ đến, và lần đầu tiên xét nghiệm dấu vân tay
DNA đã được áp dụng trong trường hợp này. Kết quả xét nghiệm đã xác định được đúng
“X?” chính là “X” vì “X?” có mang các dấu vân tay DNA từ M và đồng thời có chung

các dấu vân tay DNA với các đứa con của “M” thừa hưởng từ người cha. Vậy thì dấu vân
tay DNA là gì? Nguyên tắc hoạt động của các xét nghiệm dấu vân tay DNA như thế nào?
Các tiến bộ và các phạm vi ứng dụng hiện nay của xét nghiệm dấu vân tay DNA ra sao?
DNA bộ gen người của chúng ta có đến 30% chứa các trình tự base lặp lại và hầu như
không mang những mã có ý nghĩa chức năng. Cũng như các trình tự base có ý nghĩa chức
năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từ cha mẹ sang con cái theo
định luật phân ly độc lập của Mendel. Tuy nhiên khác với gen, rất khó tìm thấy sự khác
biệt về trình tự base của gen giữa các cá nhân, có khá nhiều trình tự base lặp lại giúp có
thể giúp phân biệt được cá nhân này với các nhân khác, và chẳng những thế, có thể giúp
tìm xem họ có quan hệ huyết thống với nhau hay không. Các trình tự base lặp lại này
được gọi là các dấu vân tay DNA.
Các loại xét nghiệm dấu vân tay DNA
Các loại xét nghiệm dấu vân tay DNA hiện đang được dùng là tùy thuộc vào loại trình
tự lặp lại được các nhà khoa học xem là dấu vân tay DNA.

70


1.

Các tiểu vệ tinh (minisatellite)
Đó là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs (Variable Number

of Tandem Repeats = Số lượng thay đổi các trình tự base lặp lại), có các kích thước
thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB). Các VNTRs này hiện diện rải
rác tại nhiều vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đa vị trí (multilocus minisatellite); hay chỉ
có tại một vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đơn vị trí (single-locus minisatelite). Xét
nghiệm dấu vân tay DNA mà Jeffereys thực hiện năm 1985 là xét nghiệm phát hiện
các tiểu vệ tinh đa vị trí bằng kỹ thuật phát hiện sự đa hình về chiều dài các đoạn DNA
của bộ gen bị cắt bởi enzyme cắt hạn chế (Restriction Fragments Lenght

Polymorphism = RFLP). Kỹ thuật này được tóm tắt như sau (hình 30): (1) Trước hết
mẫu máu được lấy từ các người cần thử nghiệm để tách được bạch cầu, sau đó tách
chiết toàn bộ bộ gen
nguyên vẹn của bạch cầu
trong

các

mẫu

Trình tự base lặp lại
trên bộ gen

thử

nghiệm; (2) Cắt đoạn
các bộ gen đã tách chiết

Bộ gene nguyên vẹn

này bằng enzyme cắt hạn

Cắt đoạn nhờ
men cắt hạn chế

Các đoạn ADN
kích thước khác nhau

chế Hinfl là một loại
enzyme cắt nhận diện

được 4 trình tự base đặc
hiệu, nhờ đó cắt đoạn
được

bộ

gen

Tách biệt các đoạn
DNA trên agarose

thành

những mảnh DNA dài

Biến tính, chuyển
sang màng nylon

ngắn khác nhau, trong đó
có những mảnh chứa các
trình tự base lặp lại; (3)
Điện di mẫu thử nghiệm

Dùng dò DNA đánh
dấu đồng vị phóng
xạ để lai cặp rồi phát
hiện bằng phóng xạ
tự ghi

để phân tách các đoạn

DNA này trên thạch
agarose, sau đó chuyển
các

đoạn

DNA

trên

Hình 30: Minh họa kỹ thuật RFLP để nhận diện dấu vân tay DNA qua
phân tích vị trí các tiểu vệ tinh đa vị trí sau bộ gene khi bị
enzyme cắt hạn chế cắt đọan và tách rời nhau trên gel điện di.

71


thạch này qua một màng nylon bằng một kỹ thuật gọi là kỹ thuật thấm Southern
(Southern blotting); (4) phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nylon bằng
cách lai với một trong những dò DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ và đặc hiệu cho các
trình tự base lặp lại này. Trong thử nghiệm, Jefferey đã thiết kế 2 dò DNA có mã số là
33.6 và 33.15. Kết quả xét nghiệm ở trường hợp trên đã cho thấy “X?” có 61 vị trí của
trình tự lặp lại đặc hiệu với hai loại dò 33.6 và 33.15, và tất cả 61 vị trí này đều thấy
hiện diện được trên M (do “X?” đã di truyền được từ “M”) hoặc trên 3 người con của
“M” (do “X?” và các người nầy đã di truyền được từ cha của họ tức là chồng của “M”
dù không có mẫu thử nghiệm lấy từ ông này). Có thể nói kỹ thuật RFLP được Jeffereys
áp dụng trong phân tích các tiểu vệ tinh đa vị trí đã mở đầu cho một kỷ nguyên mới
trong pháp y học: dấu vân tay DNA.
Xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí,
vì dùng kỹ thuật RFLP, nên được gọi ngắn gọn là

xét nghiệm RFLP. Xét nghiệm này được dùng khá
nhiều trong xác định quan hệ huyết thống. Xin đưa
thêm ra đây một trường hợp bị chứng minh loạn
luân tại Anh quốc (hình 31). Kết quả xét nghiệm
RFLP cho thấy mẹ đứa bé, là “D” và cha của cô ấy,
là “F” có đến 62% các vạch vị trí của tiểu vệ tinh
đa vị trí trùng nhau; đồng thời “F” và “B” lại có
đến 78% các vạch trùng nhau. Chính nhờ như vậy
mà đã xác định được chẳng những “F” là cha của
“D” đồng thời cũng là cha của “B”, có nghĩa là “F”
vừa là ông ngoại, vừa là cha của “D”.

Thang
DNA

F

B

D

Thang
DNA

Hình 31: Một kết quả xét nghiệm RFLP
(Từ Cellmark Diagnostics,
Abingdon, UK)

Xét nghiệm RFLP có một hạn chế là phải có mẫu thử nhiều tế bào để có thể trích
được bộ gen nguyên vẹn (phải lấy không dưới 10ml máu để tách đủ bạch cầu dùng

trong tách chiết bộ gen). Do vậy xét nghiệm này không thể áp dụng được khi mẫu phân
tích quá ít, thậm chí chỉ là các dấu vết sinh học không thể cân đo được vì quá nhỏ.
Ngoài ra, như đã nói ở trên là còn có những tiểu vệ tinh đơn vị trí cũng có giá trị là
dấu vân tay DNA đã được phát hiện, ví dụ tiểu vệ tinh kết hợp với vị trí của gen a
globulin nằm trên nhiễm sắc thể 16 (gọi là 3’ a HVR) hay kết hợp với vị trí của gen
72


Globulin miễn dịch chuỗi nặng nằm trên nhiễm sắc thể 14... Tuy nhiên vì chỉ có một vị
trí trên bộ gen nên sau khi bộ gen bị cắt bởi men cắt hạn chế, điện di, thấm Southern và
phát hiện bằng dò DNA đặc hiệu cho
trình tự base lặp lại, trên màng nylon
chỉ có thể xuất hiện 3 loại kiểu hình
vị trí phản ảnh kích thước đoạn DNA
chứa trình tự base lặp lại: ngắn-ngắn,
dài-dài, ngắn dài (hình 32). Hiện nay
có nhiều phòng thí nghiệm tư nhân
và chính phủ thực hiện xét nghiệm

Hình 32: Kết quả phát hiện một tiểu vệ tinh đơn vị trí cho
thấy trên một cá nhân chỉ có thể có một trong 3 loại
loại kiểu hình: ngắn-ngắn, ngắn-dài, và dài dài.
Ngoài ra sự khác biệt của các cá nhân cũng rất lớn
vì chiều dài của các VNTR trên từng cá nhân cũng
khác nhau

dấu vân tay DNA này. Các phòng xét nghiệm này dùng một bộ xét nghiệm phát hiện
không chỉ một loại tiểu vệ tinh đơn vị trí mà phát hiện 4 đến 6 loại tiểu vệ tinh đơn vị
trí cùng một lúc, và chính nhờ vậy mà kết hợp kết quả các vị trí vạch trên màng nylon
dư sức đa hình để phân biệt được sự khác nhau của các mẫu thử nghiệm với xác suất

giống nhau giữa hai cá nhân rất thấp đến mức hầu như khó có thể xảy ra. Xét nghiệm
này có ưu thế hơn xét nghiệm RFLP vì kết quả đa hình cao nhờ sự kết hợp phát hiện
nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí cùng một lúc. Ngoài ra, xét nghiệm còn có thể thực hiện
trên các mẫu không cần có sự nguyên vẹn của bộ gen. Trong nhiều trường hợp, vẫn có
thể làm được xét nghiệm trên các mẫu thử chứa ít DNA nhờ phương pháp khuếch đại
tín hiệu phát hiện các vạch đặc hiệu trên màng nylon bằng cách dùng các dò DNA đặc
hiệu VNTRs để lai cặp rồi sau đó tái lai cặp bằng các dò DNA phụ trợ. Nhờ những ưu
thế này mà xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đơn vị trí ngoài việc dùng xác định
quan hệ huyết thống, còn có thể dùng trong các mục đích pháp y khác mà chúng tôi sẽ
đề cập ở phần sau. Tuy nhiên, xét nghiệm này cũng có nhược điểm là không thể thực
hiện trên các mẫu có quá ít DNA, hay khi mẫu bị lẫn nhiều mảnh DNA nhỏ do mẫu thử
bị phân hủy vì các mảnh DNA này có thể làm đứt đoạn các VTNR trong các tiểu vệ
tinh.
2.

Các vi vệ tinh (microsatellite)
Là các trình tự có kích thước nhỏ dưới 1000 base tạo nên bởi các trình tự lõi

khoảng 2 đến 4 base lặp lại nhiều lần (từ 10 đến 60 lần). Do kích thước nhỏ nên các
trình tự này còn được gọi là các STRs (Short Tandem Repeats, các trình tự lặp lại
73


ngắn). Hiện nay có rất nhiều STRs đã được phát hiện và dùng làm dấu vân tay DNA; ví
dụ HUMTHO1 nằm trên intron 1 của gen tyrosine hydroxylase, FGA nằm trên intron 3
của gen a fibrinogen, FES, VWA, D18S51...

Thang
DNA

Bố

Con

Mẹ

Thang
DNA

Thang
DNA

Mẹ

Con 1

Con 2

Bố

Hình 33: Kết quả phát hiện một loại STR trên hai gia đình bao gồm bố, mẹ và các con; Cho thấy con luôn được
di truyền STR một từ bố và một từ mẹ. Lưu ý là kích thước của STR có nhiều khi chỉ cách biệt nhau
dưới 10 base nên không thể dùng kỹ thuật điện di thông thường trên thạch mà phải thực hiện trên hệ
thống điện di có độ phân giải cao như điện di với gel giải trình tự hay trên hệ thống điện di mao quản.

Khác biệt với xét nghiệm dựa trên VNTR, xét nghiệm dấu vân tay DNA dựa trên
STRs được thực hiện bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction, phản ứng chuỗi
polymerase). Đây là một kỹ

Lad. PF1 MO CH

Lad. PF2 MO CH

thuật nhân bản DNA trong ống
nghiệm dựa vào những chu kỳ
nhiệt, nhờ đó mà các mẫu thử
dù chứa DNA với số lượng rất
ít vẫn có thể nhân bản thành
nhiều bản sao đặc hiệu giống

A
Hình 34:

hệt nhau về kích thước và trình

PF1 PF2 MO CH

B

Xét nghiệm STR cho thấy (A) PF1 không thể là cha ruột
của bé CH; (B) PF2 có thể nhưng không chắc 100% là
cha ruột của bé CH. MO: mẹ, CH: con, PF1 cha có thể 1,
PF2: cha có thể 2

tự. Khi một STR được nhân bản
bằng kỹ thuật PCR, trong ống nghiệm sẽ có một trong 3 loại kiểu hình về kích thước
STR tuỳ thuộc vào STR trong mẫu DNA thử nghiệm là đồng hợp tử vì nhận từ bố và
mẹ STR kích thước giống nhau, hay dị hợp tử vì nhận được STR từ bố có kích thước
khác STR nhận từ mẹ (hình 33). Chính nhờ vậy mà có thể dùng thử nghiệm STR để
xác định một người không phải là cha một đứa bé như trong ví dụ minh họa ở hình 34A trình bày ở đây: Người đàn ông “PF1” không thể là cha của đứa bé “CH” vì kết quả

xét nghiệm một loại STR đã cho thấy “CH” chỉ có một vạch trùng với mẹ “MO” và
không có vạch trùng với “PF1”. Sự phân phối của các kích thước một loại STR trong
74


các cá nhân của một quần thể có thể rất rộng, ví dụ kích thước của HUMTHO1 phân
phối trong quần thể có thể thay đổi từ 146 đến 273 base với sự khác biệt của hai kích
thước gần nhau là không quá 6 base. Như vậy, sự khác biệt kích thước một loại STR
trong loài người rất đa hình, đủ để có thể phân biệt được dấu vân tay DNA của cá nhân
này với cá nhân khác và mối quan hệ huyết thống nếu có của họ nếu làm xét nghiệm
STRs dựa trên nhiều loại STR cùng một lúc. Trong hình 34-B, kết quả cho thấy “CH”
có một vạch trùng với mẹ “MO” và lại có một vạch trùng với người đàn ông “PF2”.
Tuy nhiên điều này này chưa thể giúp khẳng định được PF2 đúng 100% là cha của đứa
bé “CH” vì kích thước này của STR có thể tìm thấy được trên những người đàn ông
khác. Chính vì vậy mà để xác định một quan hệ huyết thống, hay xác định được một
thủ phạm thông qua dấu vết DNA để lại tại hiện trường, phải làm xét nghiệm nhiều
STR cùng một lúc. Người ta cho rằng nếu xét nghiệm STRs dùng một bộ xét nghiệm
phát hiện được cùng một lúc 12 đến 16 loại STRs khác nhau thì xác xuất để có kết quả
STR hoàn toàn giống nhau trên hai cá nhân là cực thấp, dưới 10-10, và xác suất này là
một xác suất của một sự kiện không thể xảy ra được. Hiện nay với phương pháp điện
di mao quản và sử dụng đa mồi, chúng ta có thể phân tích cùng lúc 12 đến 16 loci STR
của một mẫu rất dễ dàng (minh họa một kết quả ở hình 3). Chúng tôi xin minh hoạ một
kết quả xét nghiệm quan hệ huyết thống mà chúng tôi đã thực hiện tại phòng thí
nghiệm của mình để xác định mối quan hệ của con trai (N. U. A) với cha (I. A) mẹ (H.
D) và hai cô bé gái (H. SOP và H. SOD) được bà mẹ khai là cháu gái gọi mình bằng dì.
Trong thí nghiệm này các mẫu thử mà chúng tôi lấy là các mẫu quệt niêm mạc má của
các cá nhân thử nghiệm. Các mẫu niêm mạc này được tách chiết DNA nhờ bộ thuốc
thử tách chiết DNA niêm mạc má do công ty Nam Khoa chế tạo.
Các mẫu DNA tách chiết này được định lượng và sau đó cho vào chạy PCR với 12
mồi đặc hiệu cho 12 loci STR dùng làm dấu vân tay DNA. Các mồi này được đánh dấu

huỳnh quang với 3 màu huỳnh quang khác nhau để máy điện di mao quản nhận diện
được khi vạch khuếch đại đi qua cửa sổ nhận diện của máy. Bảng 10 trình bày các
thông tin cần thiết về 12 loci STR này bao gồm tên, màu huỳnh quang đánh dấu, và
kích thước sản phẩm khuếch đại. Lưu ý trên bảng 10 là màu huỳnh quang được đánh
dấu sao cho trong cùng một màu, có thể biết được sản phẩm khuếch đại đó thuộc về
locus STR nào, nghĩa là các sản phẩm khuếch đại có chiều dài trùng nhau phải được
75


đánh dấu khác màu nhau. Sản phẩm PCR sau đó được trộn thêm thang DNA rồi đưa
vào chạy điện di mao quản trên máy CEQ 8000 của Becman Coulter với chương trình
phân

tích

đoạn

(fragment

analysis) là chương trình phân
tích xác định kích thước các sản

Bảng 10: Các mồi cho 12 loci STR được dùng cho phân tích dấu
vân tay DNA
Tên mồi

Kích thước
sản phẩm PCR

Màu HQ

D18S51

286 - 366

D2

phẩm khuếch đại có trong ống

TH01

159-199

D2

PCR. Kết quả được máy hiển thị

Amelogenin

104-111

D3

là các đỉnh cùng kích thước

D7S820

214 - 250

D3

D13S137

173 - 213

D3

D16S539

264 - 309

D3

khuếch đại của các STR có trong

PentaE

377 - 481

D3

mẫu DNA tách chiết từ mẫu niêm

D3S1358

112-152

D4

D8S1179

206 - 266

D4

CSF1PO

316 - 356

D4

Hình 35 là một minh họa kết quả

TPOX

260 - 292

D4

phát hiện và phân tích kích thước

PentaD

369 - 449

D4

tương ứng với các sản phẩm

mạc má của người thử nghiệm.

của sản phẩm khuếch đại của các STR, trong trường hợp này là của I.A. Mỗi cá nhân
có mẫu thử nghiệm sẽ có một kết quả hiển thị như vậy. Cuối cùng máy sẽ xuất ra một
bảng tổng kết các alelle (là kích thước sản phẩm khuếch đại) của các STR có trong các
mẫu thử nghiệm. Bảng 11 là bảng trình bày tổng kết các alelle của 5 người có mẫu thử
nghiệm ở trên. Phân tích kết quả trên bảng 11 chúng ta sẽ thấy là 12 loci STR của
N.U.A có allele chia sẻ với cả I.A và H.D, điều này cho phép nhận định I.A có khả
năng rất cao là cha ruột của N.U.A (Gọi là có khả năng rất cao là cha ruột là bởi vì phải
tính cho được xác suất chính xác dựa trên tần số xuất hiện các allele trong quần thể).
Còn hai cháu H.SP và H.SD cũng có các allele của 12 loci chia xẽ với H.D nhưng giữa
H.SP và H.SD có 6 loci STR có alelle còn lại không chia sẻ với H.D và đồng thời với
nhau. Điều này cho phép kết luận H.SP va H.SD không cùng cha, và H.D có thể là mẹ
mà cũng có thể là dì của hai cháu này. Muốn xác định chính xác thì cần phải có mẫu
của người được khai là mẹ ruột của hai cháu này.
Chính nhờ ưu điểm có thể thực hiện thử nghiệm trên mẫu nhỏ, kết quả có độ chính
xác cao mà xét nghiệm STRs hiện nay được áp dụng trong nhiều lãnh vực của pháp y
như xác định quan hệ huyết thống, truy tầm thủ phạm qua các dấu vết sinh học chứa
DNA để lại tại hiện trường, hay truy tầm tung tích nạn nhân qua các mẫu di thể còn lại.
76


Có thể tóm tắt một qui trình phát
hiện dấu vân tay DNA dựa trên

Bảng 11: Kết quả phân tích STR của con trai (N. U. A), cha
(I. A), mẹ (H. D) và hai cô bé gái (H. SP và H. SD)
được bà mẹ khai là cháu gọi bằng dì

STRs thành các bước sau: (1)
Tách chiết DNA từ các mẫu thử

LOCUS

D2

nghiệm; (2) Khuếch đại các STRs
trong mẫu DNA bằng kỹ thuật
PCR với mồi đặc hiệu cho STR

D3

muốn khuếch đại; (3) Điện di
phát hiện kích thước của STR
được khuếch đại; (4) Phân tích
thống kê dựa trên tần số xuất hiện
các allele của các loci STR trong
quần thể để tính ra được nguy cơ

D4

D18S51
286-336
TH001
159-199
Amelogemin
104-111
D7S820
214-250
D13S137
173-213

D16S539
264-309
Penta E
337-481
D3S1358
112-152
D8S1179
206-266
CSF1PO
316-356
TPOX
260-292
Penta D
369-449

I.A

N.U.A

H. D

H. SP

H. SD

318.60;
329.94
178.89;
182.93
105.10;

110.88
225.88;
237.77
185.35;
193.35
288.45;
292.50
413.42;
429.03
128.51;
132.64
229.97;
245.98
344.31

348.94;
330.07
178.86

314.83;
348.94
178.83

104.98;
110.78
237.61;
241.67
181.21;
193.26
292.25

105.06

318.65;
349.03
170.5;
178.83
105.01

314.83;
318.62
174.77;
178.80
105.10

225.78;
241.75
181.27;
185.31
292.37

241.59

225.9;
237.74
181.29

413.09
132.47;
144.95

229.71;
237.71
344.22

271.89;
283.98
404.62;
423.82

271.74;
283.82
409.38;
423.79

413.35;
418.53
132.57;
145.08
229.86;
237.87
344.35;
348.36
271.83

284.21;
292.25
418.50;
455.08
132.57;
145.05

229.84;
233.85
344.34

271.66

271.82

404.65;
409.44

394.90;
409.28

404.74;
414.34

413.18
128.32;
132.46
237.79;
245.79
344.23

181.17
292.16

sai lầm hay xác suất chính xác.

Hình 35: Kết quả một phân tích PCR đa mồi (12 mồi) khuếch đại 12 loci STR. Kết quả này được đọc qua

diện di mao quản nhận diện được 4 màu huỳnh quang để có thể ghi nhận tín hiệu của các sản
phẩm PCR khi chạy qua cửa sổ đọc màu. Sản phẩm PCR được cửa sổ đọc huỳnh quang của
máy nhận diện khi chúng chạy qua cửa sổ này là nhờ chúng được đánh dấu huỳnh quang bằng
mồi gắn huỳnh quang. Các peak màu đỏ là thang kích thước DNA được đánh dấu màu huỳnh
quang thứ 4.

77


Chúng tôi cũng xin đưa ra ở đây thêm một ví dụ khá đặc biệt về xác định quan hệ
huyết thống. Đó là trường hợp một gia đình người Hoa với ông nội (T.N.Y., 67t) đang
hấp hối và trước khi chết muốn xác định gấp đứa cháu nội của mình (T.K.T., 8t), con
của một người con trai đã mất trước đó 2 năm của ông, có thật sự là cháu nội ruột của
Bảng 12: Bảng kết quả STR của 4 mẫu ông-bà-cô-cháu được làm
xét nghiệm quan hệ huyết thống
LOCUS

D2

D3

D4

D18S51
286-336
TH001
159-199
Amelogemin
104-111
D7S820

214-250
D13S137
173-213
D16S539
264-309
Penta E
337-481
D3S1358
112-152
D8S1179
206-266
CSF1PO
316-356
TPOX
260-292
Penta D
369-449

ông hay không. Nhận được
yêu cầu này chúng tôi cũng

T.N.Y
(67t)
304 ; 319

T.K.T.
(8t)
311 ; 319

T.N.

(63t)
308 ; 319

T.H.T.
(37t)
304 ; 319

171 ; 179

171

171 ; 182

171 ; 182

105 ; 111

105 ; 111

105

105

cũng không thể lấy mẫu từ mẹ

226 ; 235

238 ; 242

238

226 ; 238

ruột của cháu vì gia đình

202

186 ; 202

198

198 ; 202

không muốn con dâu biết về

285 ; 297

285 ; 289

285 ; 301

285 ; 301

xét nghiệm này. May thay khi

414 ; 424

383 ; 435

424 ; 435

424 ; 435

137

129

125 ; 129

125 ; 137

234

234 ; 243

222 ; 238

222 ; 234

(T.N.,63t), và ngoài ra còn có

333 ; 344

340 ; 352

336 ; 352

336 ; 344

một người cô (T.H.T.,37t) của

272

272

272 ; 283

272

cháu nữa. Chúng tôi đã phải

420 ; 424

410 ; 420

405 ; 410

410 ; 424

lấy gấp mẫu và làm gấp xét

khá bối rối vì không thể có
được mẫu từ cha ruột của cháu,

hỏi kỹ thì biết bà nội còn sống

nghiệm chỉ trong vòng không
quá 24 giờ vì người hấp hối cần biết kết quả khi còn tỉnh táo. Kết quả trình bày trong
bảng 12 đã chứng minh là 12 loci STR khuếch đại từ DNA tách chiết từ mẫu của cháu
nội (T.K.T) là chia xẻ các alleles (màu vàng) hoặc với ông nội (T.N.Y.) hoặc với bà nội

(T.N.). Kết quả này chứng minh T.K.T. chính là cháu nội ruột của ông nội T.N.Y và bà
nội T.N. Kết quả cũng xác định cô T.H.T. chính là con ruột của hai ông bà T.N.Y và
T.N. vì các allele của 12 loci STR phát hiện trên cô T.H.T. là nhận các allele của STR
của ông T.N.Y và của bà T.N., có nghĩa cô chính là cô ruột của T.K.T. Trong xét
nghiệm này, chúng tối muốn nói lên là kết quả xét nghiệm có thể đến tay người làm xét
nghiệm trong thời gian rất nhanh, chỉ trong vòng 24 giờ sau khi phòng thí nghiệm nhận
mẫu. Đây chính là một đặc trưng nữa làm cho xét nghiệm phân tích STR rất hữu dụng
không chỉ trong phát hiện quan hệ huyết thống mà cả trong các áp dụng khác. Hiện
nay xét nghiệm quan hệ huyết thống là một yêu cầu có thực đến từ thực tế của cuộc
sống và của xã hội. Do vậy người làm xét nghiệm hay người muốn thử rất cần phải có
các hiểu biết nhất định về xét nghiệm này.
78


Như đã nói ở trên, ngoài áp dụng phát hiện quan hệ huyết thống, phát hiện các dấu
vân tay DNA bằng các xét nghiệm phát hiện STR và xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ
tinh đơn vi trí còn được dùng rộng rãi trong các lĩnh vực khác của pháp y như truy tầm
thủ phạm và truy tầm tung tích nạn nhân. Chúng tôi xin đưa ra đây một ví dụ hoàn toàn
có thật được Sweet và Sweet thông báo vào năm 1995 để thấy được các áp dụng này:
Vào tháng 7 năm 1991, tại Vancouver, British Columbia, Canada; một người đàn bà 29
tuổi được tìm thấy bị giết chết và xác bị đốt cháy đen gần như thành than vì vậy mà
không thể nhận diện được. DNA của thi thể không thể thu thập được từ tro của xác
chết. Tuy nhiên nhờ một chút ít dữ kiện may mắn có được và nhờ sự làm việc rất tốt
của cảnh sát, người ta đã tìm được một người đàn ông bị nghi ngờ là thủ phạm. Khám
nhà người nay, phát hiện thấy có các dấu máu khô còn dính trên xe hơi và quần áo của
hắn ta cùng một can xăng trống rỗng. Xét nghiệm dấu vân tay DNA từ các vệt máu,
người ta đã xác định không phải từ máu của hắn ta. Vấn đề là làm sao để có DNA trích
được từ di thể của nạn nhân. Sau khi xem xét phần hàm dưới của di thể, người ta đã
tìm thấy được một vài cái răng khôn không bị cháy nhờ được hàm răng bảo vệ. Chính
từ các mẫu răng khôn này, các nhà khoa học hình sự đã trích được DNA, và nhờ đó đã

làm được xét nghiệm phát hiện dấu vân tay DNA của nạn nhân. Kết quả cho thấy các
dấu vân tay DNA này hoàn toàn trùng khớp với dấu vân tay DNA từ các mẫu máu tìm
được trên xe hơi của hung thủ. Cuối cùng hung thủ phải nhận tội giết người.
3.

Trình tự vòng D của ty thể
Trong trường hợp xác định xương hài cốt của lính Mỹ chết trận tại Việt Nam, các

DNA hầu như bị phân huỷ gần hết do hài cốt bị nằm trong đất quá lâu. Đa số các
trường hợp này người ta không thể phát hiện dấu vân tay DNA bằng các xét nghiệm
phát hiện STR và xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đơn vi trí như đã nêu ở trên.
Lúc này một loại xét nghiệm khác được thực hiện, đó là dùng PCR để vừa khuếch đại,
vừa giải trình tự các vòng D nằm trên DNA ty thể. Các DNA ty thể hãy còn hiện diện
khá nhiều trong tủy răng của hài cốt vì một phần là chúng được răng bảo vệ, một phần
nữa là do trong một tế bào có rất nhiều ty thể, số lượng DNA ty thể trong một tế bào có
khá nhiều nên khó thể bị phân hủy hết. Vòng D là một đoạn DNA của ty thể hầu như
rất bảo tồn qua nhiều thế hệ và chỉ di truyền qua mẹ (vì ty thể chỉ có trên tế bào chất).
Thông qua kết quả khuếch đại và giải trình tự này, người ta có thể xác định mẫu hài cốt
79


có quan hệ huyết thống hay không với các gia đình lính Mỹ mất tích. Hình 36 dưới
đây minh họa một cây phả hệ dựa trên sự giống nhau của trình tự vòng D của DNA ty
thể.
Phát hiện dấu vân tay DNA bằng
xét nghiệm giải trình tự vòng D của
DNA ty thể là một xét nghiệm rất hữu
dụng để truy tầm hài cốt bị phân huỷ

Hình 36: Một cây phả hệ cho thấy sự di truyền trình tự

vòng D của DNA ty thể qua người mẹ

khá lâu trong lòng đất. Chính nhờ xét
nghiệm này mà người ta đã tìm được hài cốt của Nga Hoàng Nicolas đệ nhị bị giết chết
sau cách mạng tháng 10 Nga nhờ phát hiện được trình tự vòng D ty thể trên một hài cốt
chôn tại bìa rừng nơi được cho là đã hành quyết gia đình nhà vua, trình tự này trùng
với trình tự vòng D của ty thể một người thân thuộc, và cả hài cốt của hoàng hậu do có
thân thuộc với nữ hoàng Victoria bên Anh quốc.
Kết luận
Phát hiện dấu vân tay DNA để xác định quan hệ huyết thống, truy tầm thủ phạm thông
qua dấu vết sinh học chứa DNA để lại tại hiện trường, truy tầm tông tích nạn nhân qua
các di thể còn sót lại dù rằng chỉ là các mảnh xương và răng là một tiến bộ rất tuyệt vời
của ngành pháp y học. Để không bị lạc hậu với các tiến bộ này, hiện nay phòng thí
nghiệm khoa học hình sự của Bộ Công An chúng ta đã trang bị được các phương tiện để
làm các xét nghiệm phát hiện dấu vân tay DNA và đã hoạt động thường xuyên. Phòng thí
nghiệm nghiên cứu và phát triển của công ty Nam Khoa cũng đã có những phương tiện
tương tự và đã hoạt động có những kết quả bước đầu rất đáng khích lệ. Ngoài ra, chúng ta
cũng rất vui mừng khi biết được Viện Công Nghệ Sinh Học Việt Nam đã triển khai thành
công xét nghiệm truy tầm hài cốt liệt sĩ và đã chuyển giao được kỹ thuật này cho phòng
thí nghiệm có chức năng. Chúng tôi nghĩ rằng đây là các kết quả rất có giá trị minh chứng
được rằng các nhà khoa học Việt Nam không hề muốn bị tụt hậu trong các lĩnh vực khoa
học kỹ thuật đỉnh cao.

80


PHẠM HÙNG VÂN

PCR và real-time PCR
Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp

NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC
Chi Nhánh Thành Phố Hồ Chí Minh
2009


2