Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học, Thiết Lập Chất Đối Chiếu Và Xây Dựng Quy Trình Kiểm Nghiệm Thành Phần Alcaloid Và Flavonoid Cho Cây Trinh Nữ Hoàng Cung – Crinum Latifolium L., Amaryllidacceae

Header Page 1 of 126.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*****

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014
Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)
Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC
Mã số: 62.73.15.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014
Footer Page 2 of 126.


Header Page 3 of 126.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Người cam đoan,

Nguyễn Hữu Lạc Thủy

Footer Page 3 of 126.


Header Page 4 of 126.

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC............................................................................................................... i
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH...................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................. vii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tổng quan thực vật học cây Trinh nữ hoàng cung ......................................... 3
1.2. Tổng quan hóa học của chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung .................. 5
1.3. Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung ........ 14
1.4. Chiết hoạt chất từ dược liệu bằng dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn ............. 21
1.5. Các phương pháp nghiên cứu hóa học của cây Trinh nữ hoàng cung........... 22
1.6. Phương pháp thiết lập chất đối chiếu........................................................... 24
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 27
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 27
2.2. Trang thiết bị .............................................................................................. 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 40
3.1. Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid từ cây
Trinh nữ hoàng cung.......................................................................................... 40
3.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ....................................................................... 46

3.3. Thiết lập chất đối chiếu ............................................................................... 69
3.4. Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính và định lượng
alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC ............................................................. 82
3.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột lá
Trinh nữ hoàng cung.......................................................................................... 99

Footer Page 4 of 126.


Header Page 5 of 126.

ii

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 102
4.1. Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung ........... 102
4.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ...................................................................... 107
4.3. Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết Trinh nữ hoàng cung ........................ 111
4.4. Quy trình định lượng alcaloid và flavonoid từ lá Trinh nữ hoàng cung...... 112
4.5. Các chỉ tiêu cần thiết của Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC ....................... 117
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN PHỤ LỤC

Footer Page 5 of 126.


Header Page 6 of 126.

iii

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASEAN

Association of Southeast Asian Nations
(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

AL-NK

Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt

AL-SA

Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm

AL-SFE

Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE

AR-96

Phân đoạn alcaloid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96%

As

Hệ số bất đối

CĐC

Chất đối chiếu

CE

Caplillary Electrophoresis (Điện di mao quản)

Corr Area

Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa)

CZE

Caplillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng)

d

doublet (đỉnh đôi)

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DSC

Differential Scanning Calorimetry (Nhiệt vi sai)

DMSO

Dimethylsulfoxyd

DVT

Dấu vân tay

ESI

Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun ion)

FL-NK

Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt

FL-SA

Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm

FL-SFE

Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE

FR-96

Phân đoạn flavonoid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96%

GC

Gas Chromatography (Sắc ký khí)

GC-MS

Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)

GLP

Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc)

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

IR

Infrared (Hồng ngoại)

Footer Page 6 of 126.


Header Page 7 of 126.

iv

J

Coupling constant (Hằng số ghép)

LC-MS

Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

L-SFE

Cao toàn phần chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE

MEKC

Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động)

MS

Mass Spectrometry (Khối phổ)

NMR

Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân)

PĐ

Phân đoạn

PDA

Photo Diode Array (Dãy diod quang)

PCRS

Primary Chemical Reference Standard
(Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)

PTN

Phòng thí nghiệm

RSD

Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

Rs

độ phân giải giữa pic có thời gian lưu nhỏ và lớn hơn kề bên

S

Diện tích pic (µV x giây)

s

singlet (Đỉnh đơn)

SKĐ

Sắc ký đồ

SCRS

Secondary Chemical Reference Standard
(Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SFE

Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TCKN

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm

TR

Thời gian lưu (phút)

TM

Thời gian di chuyển (phút)

TNHC

Trinh nữ hoàng cung

TGA

Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng)

TT

Thuốc thử

UV-Vis

Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)

VLC

Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không)

Footer Page 7 of 126.


Header Page 8 of 126.

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC ................................................................................. 5
Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học của alcaloid khung crinin ....................................... 6
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) ......... 6
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) và cấu trúc khung galanthamin (D) 7
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) và cấu trúc khung cheryllin (F) .... 7
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong chi Crinum ............................. 8
Hình 1.7: Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC .................... 10
Hình 3.1: Hình lá và cụm hoa của cây TNHC (Crinum latifolium L.) ................... 40
Hình 3.2: Hình hoa Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) .......................... 40
Hình 3.3: SKĐ các hợp chất phân lập từ các phân đoạn alcaloid. .......................... 48
Hình 3.4: SKĐ các hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid AR và flavonoid. ..... 48
Hình 3.5: Cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ NMR (500 MHz, CDCl3) của (2). ....... 58
Hình 3.6: Cấu trúc hóa học của 6-ethoxyundulatin................................................ 58
Hình 3.7: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC crinamidin bằng HPLC. .............. 71
Hình 3.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC. ............ 72
Hình 3.9: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC lycorin bằng HPLC..................... 72
Hình 3.10: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC hippadin bằng HPLC. ............... 73
Hình 3.11: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC astragalin bằng HPLC............... 73
Hình 3.12: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC isoquercitrin bằng HPLC. ......... 74
Hình 3.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. ................................................ 85
Hình 3.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. .................... 89
Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE............................................ 92

Footer Page 8 of 126.

Header Page 9 of 126.

vi

Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE................... 95
Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC. ........................................... 97
Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC.......................................... 98
Hình 4.1: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic. ............. 113
Hình 4.2: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient. .............. 113
Hình 4.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích bằng CZE và MEKC. . 114
Hình 4.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong methanol. ................................ 115
Hình 4.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong đệm dinatri tetraborat 25 mM. . 115
Hình 4.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong dung dịch acid H3PO4.............. 115
Hình 4.7: SKĐ so sánh khả năng rửa giải mẫu flavonoid TNHC bằng HPLC với pha
động methanol và acetonitril . .............................................................................. 116

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC........................... 29
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ lá TNHC kết hợp hai phương pháp SFE
và phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70%........................................................ 32
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid từ lá TNHC .............. 42
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ rễ TNHC. ...................................... 42
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid bột lá kết hợp hai phương pháp chiết. 45
Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) và (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE. .................. 50
Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA. .............................. 82

Footer Page 9 of 126.

Header Page 10 of 126.

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L. ............................................. 11
Bảng 3.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất bằng phương pháp ngấm kiệt. ................. 41
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết. ..................... 43
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất lên hiệu suất chiết. .................. 44
Bảng 3.4: Kết quả tách phân đoạn mẫu AL-SFE và FL-NK bằng VLC. ................ 46
Bảng 3.5: Các hợp chất tinh khiết phân lập được từ cao chiết TNHC. ................... 47
Bảng 3.6: Kết quả phân lập alcaloid từ phân đoạn ALS1. ..................................... 48
Bảng 3.7: Kết quả triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo. ........................ 49
Bảng 3.8: Kết quả phân lập (2) và (3) từ PĐ n–hexan. .......................................... 49
Bảng 3.9: Kết quả phân lập các (8), (9), (10) từ PĐ alcaloid AL-NK. ................... 51
Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) của hợp chất (2)............... 56
Bảng 3.11: Các tương tác proton trên phổ COSY, HMBC của hợp chất (2). ......... 57
Bảng 3.12: Kết quả độ tinh khiết; hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng. ........ 69
Bảng 3.13: Thành phần pha động và bước sóng phát hiện của quy trình xác định độ
tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC. ............................. 70
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC. .... 70
Bảng 3.15: Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các CĐC bằng HPLC. ........ 74
Bảng 3.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy của các CĐC. ........................ 75
Bảng 3.17: Dữ liệu phổ IR của các CĐC. .............................................................. 75
Bảng 3.18: Kết quả đánh giá đồng nhất lô của các CĐC sau khi đóng gói. ............ 77
Bảng 3.19: Kết quả phân tích robust A của CĐC crinamidin. ................................ 79
Bảng 3.20: Kết quả phân tích robust A của CĐC 6-hydroxycrinamidin................. 79
Bảng 3.21: Kết quả phân tích robust A của CĐC hippadin. ................................... 80
Bảng 3.22: Kết quả phân tích robust A của CĐC lycorin. ..................................... 80

Bảng 3.23: Kết quả phân tích robust A của CĐC astragalin. ................................. 81

Footer Page 10 of 126.


Header Page 11 of 126.

viii

Bảng 3.24: Kết quả phân tích robust A của CĐC isoquercitrin. ............................. 81
Bảng 3.25: Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC. .............. 81
Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng 6 alcaloid bằng HPLC.................. 83
Bảng 3.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 83
Bảng 3.28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 86
Bảng 3.29: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). .................................... 87
Bảng 3.30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). . 88
Bảng 3.31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng HPLC (n = 6)............................... 90
Bảng 3.32: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). ........................ 90
Bảng 3.33: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6). ......................................... 91
Bảng 3.34: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6). ............................... 93
Bảng 3.35: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9). ......................................... 93

Bảng 3.36: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6). ........................... 94
Bảng 3.37: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6). .................................. 96
Bảng 3.38: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9). ............................. 96

Footer Page 11 of 126.


Header Page 12 of 126.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. – Amaryllidaceae) là dược liệu đang
được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng hoặc dưới các dạng bào chế thuốc
cổ truyền và thuốc hiện đại.
Công dụng được quan tâm và đã được thử nghiệm lâm sàng như điều trị u xơ tử cung,
u phì đại lành tính tuyến tiền liệt được cho là do tác dụng của thành phần alcaloid
trong cây với các chế phẩm như Crila, Tadimax [16], [26].
Kế đến là công dụng kháng viêm, chống oxi hóa in vitro do nhóm flavonoid cũng đã
được nghiên cứu [16], [95].
Tuy nhiên, các nhà khoa học kỳ vọng vào tác dụng kháng khối u của loài này. Cho
đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kháng ung thư từ cao toàn
phần như: cao ethanol (có thành phần alcaloid) làm chậm sự phát triển khối u gây ra
bởi tế bào Sarcoma TG 180 [11]; cao methanol ức chế NF-κB [103]; cao chiết nước
kích thích sự sinh sản và hoạt hóa tế bào lympho T [139]; khả năng ức chế sự phát
triển của tế bào ung thư và hồi phục chức năng miễn dịch (in vitro) của cao chiết nước
là tác dụng đáng chú ý khi giải thích tính kháng ung thư của loài Crinum latifolium

[31], [95], [139]. Các hợp chất alcaloid tinh khiết được phân lập từ Trinh nữ hoàng
cung (TNHC) như lycorin, pratorimin, undulatin, crinafolin và crinafolidin đã được
thực nghiệm chứng minh là có khả năng ngăn chặn chọn lọc sự phát triển của các tế
bào ung thư thực nghiệm.
Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của TNHC được nhiều tác giả quan tâm và
rất nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố về hai lĩnh vực này – cho đến năm
2013, có khoảng 30 công trình công bố dưới dạng bài báo khoa học. Tuy nhiên các
nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn (khoảng 6 công trình): phương
pháp quang phổ định lượng alcaloid toàn phần [22]; phương pháp GC định danh thành
phần alcaloid [11], [106]; phương pháp HPLC định lượng alcaloid dựa trên 1 chất đối
chiếu [12], [24], [27]. Chưa có nghiên cứu ứng dụng phương pháp CE và cũng chưa

Footer Page 12 of 126.


Header Page 13 of 126.

2

có công trình công bố việc định lượng đồng thời một số alcaloid hay flavonoid trong
lá TNHC.
Dược điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận cây TNHC. Do đó, vấn đề quản lý và
đảm bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có thành phần TNHC vẫn chưa
được thực hiện một cách chặt chẽ.
Nguyên nhân chủ yếu là do thành phần hóa học của dược liệu vẫn chưa được nghiên
cứu toàn diện; chất đánh dấu trong nguyên liệu chưa được xác định và hoàn toàn chưa
có bất kỳ chất đối chiếu có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối trên thị trường.
Với mong muốn góp phần giải quyết các bất cập hiện tại và góp phần vào công tác
“Đảm bảo chất lượng” cho dược liệu Trinh nữ hoàng cung, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu

và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid
cho cây Trinh nữ hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”
với 4 mục tiêu chính như sau:
1. Chiết xuất cao cồn, các phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid và phân lập các
hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung.
2. Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây Trinh nữ hoàng cung.
3. Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh nữ
hoàng cung bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản.
4. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược
liệu Trinh nữ hoàng cung.

Footer Page 13 of 126.


Header Page 14 of 126.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
1.1.1. Họ Amaryllidaceae và chi Crinum
Họ Amaryllidaceae có tên gọi theo đa số tài liệu của các nhà thực vật học Việt nam
là họ Thủy tiên [4], [5], [21], Loa kèn đỏ [1], Náng [7] hay Lan Huệ. Vị trí của chi
Crinum thuộc họ Thủy tiên theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín của A. L.
Takhtajan công bố năm 1987 và đã sửa đổi năm 2009 [4], [36] như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Phân lớp Hành (Liliidae)
Liên bộ hành (Lilianae)
Bộ Thủy tiên (Amaryllidales)

Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae)
Chi Crinum L.
Đặc điểm hình thái của họ Thủy tiên: thân cỏ, sống nhiều năm nhờ hành hay thân rễ.
Lá mọc từ gốc, mỏng hay mọng nước, gân lá song song. Đối với chi Crinum, các bẹ
lá hợp thành thân giả cao 10-15 cm. Cụm hoa dạng chùm, tán, ít hay nhiều hoa và có
một mo bao lại. Trục cụm hoa dài mọc từ mặt đất. Hoa đều, lưỡng tính, 5 vòng, mẫu
3. Bao hoa: 6 phiến cùng màu dạng cánh hoa, dính thành ống dài, ít khi rời. Vài loại
có tràng phụ. Bộ nhị: 6 nhị đính trên 2 vòng. Chỉ nhị rời hay dính nhau. Bao phấn
thẳng hay lắc lư. Bộ nhụy: 3 lá noãn tạo thành bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa nhiều noãn,
đính noãn trung trụ; 1 vòi nhụy, đầu nhụy chia 3 thùy. Quả: thông thường là nang nứt
lưng. Hạt có nội nhũ [5].
Chi Crinum có khoảng 130 loài ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nóng.
Ở Việt Nam, chi Crinum có 6 loài được trồng làm cảnh và làm thuốc: Crinum amabile
Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr.,
Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F. [4]

Footer Page 14 of 126.


Header Page 15 of 126.

4

1.1.2. Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (TNHC)
Tên khoa học: Crinum latifolium L.
Tên thông thường: Trinh Nữ Hoàng Cung [11], Hoàng Cung Trinh Nữ [17], Tỏi lơi
lá rộng [1], [4], Náng lá rộng [4], [7], [9].
Đặc điểm hình thái: được nhiều nhà thực vật học Việt nam mô tả rất chi tiết [1], [4],
[5], [7], [11], [14], [17], [21]. Tài liệu [7] phù hợp với hầu hết các tài liệu khác: cỏ
nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía ngoài có áo mỏng, phía trên có thân giả ngắn

do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành. Phiến lá dạng bản, kích thước 60-90  7-10 cm,
màu xanh nhạt, nạc, mặt trên hơi lõm xuống thành hình máng, mép lượn sóng, gân
giữa lồi lên ở mặt dưới, gân bên song song, chóp nhọn, gốc dạng bẹ. Cụm hoa tán, có
10-20 hoa; cuống cụm dài 60-90 cm, chiều ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, gốc tím nhạt.
Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, mỏng, kích thước 7,5-10,0  2,5-3,0 cm. Hoa đều, lưỡng
tính, màu tím hồng, đứng thẳng; cuống hoa ngắn. Bao hoa dài 15-20 cm, 6 mảnh,
dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống dài 9-10 cm, thẳng đứng hoặc cong lên,
phần trên 6 thùy, hình mũi giáo, giữa lưng có 1 dải màu tím hồng, đậm hơn, nhạt dần
ra phía mép, chóp nhọn ngắn, có mũi màu hồng. Nhị 6, rời nhau; chỉ nhị dài 6-7 cm,
dạng sợi, màu trắng, thẳng đứng hoặc choãi ra, đính ở họng ống bao hoa; bao phấn
màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, 2 ô, hình dải, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe dọc.
Bầu hạ, hình thoi, 3 ô, mỗi ô 5-6 noãn; vòi nhụy dài 15-18 cm, dạng sợi, dài, mảnh,
phía trên màu tím thẫm nhạt dần xuống phía dưới; đầu nhụy nhỏ, dạng cầu. Quả nang,
hình cầu, đường kính 4-5 cm.
Tài liệu [17] mô tả bộ nhị của TNHC có màu đỏ, trong khi các tài liệu khác [7], [11]
mô tả bộ phận này có màu trắng. Các tài liệu còn lại đều không đề cập chi tiết này.
Phân bố - Sinh thái: cây TNHC được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái lan, Trung Quốc,
Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào. Ở Việt Nam, cây được trồng chủ yếu ở các
tỉnh từ Quảng Nam-Đà Nẵng trở vào. Mùa hoa quả: tháng 8-9. Là loại cây ưa ẩm,
sáng hoặc một phần bóng mát. Sinh trưởng và phát triển ở khí hậu nóng và ẩm của
vùng nhiệt đới. Mỗi năm cây cho 6-8 lá mới và đẻ thêm 3-5 hành con. Cây ra hoa
hàng năm vào khoảng tháng 6-8. Bộ phận dùng chủ yếu là lá và thân hành [1].

Footer Page 15 of 126.


Header Page 16 of 126.

5

Cây TNHC đã được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp cấy mô [20].

Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC: 1. Cây với thân hành và lá 2. Cụm hoa;
3. Một phần bao hoa và bộ nhị; 4. Bộ nhụy “Nguồn: Nguyễn Thị Đỏ, 2007” [7]
Năm 2012, một thứ mới của loài TNHC do nhóm tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm,
Trần Công Khánh xác định trong quần thể Crinum Việt nam là “Trinh nữ Crila” có
tên khoa học Crinum latifolium L. var. Crilae Tram & Khanh, var. n [32].

1.2. TỔNG QUAN HÓA HỌC CỦA CHI CRINUM VÀ CÂY TNHC
Thành phần hóa học của các loài trong chi Crinum được nghiên cứu từ năm 1950.
Nhóm hợp chất chính là alcaloid, kế đến là nhóm non-alcaloid, trong đó đặc biệt là
các hợp chất phenolic [116].
Chi Crinum được xem là đại diện cho họ Amaryllidaceae do thành phần hóa học có
hầu hết các hợp chất của các chi khác trong họ. Khoảng 180 alcaloid thuộc nhiều
nhóm cấu trúc khác nhau được phân lập và định danh. Phần lớn chúng thuộc các
khung alcaloid crinin (5,10 b-enthanophenanthridin), lycorin (benzopyrano-(3,4 g)indol) và tazettin (2-benzopyrano-(3,4 c)-indol) [116].
Khoảng 100 các hợp chất non-alcaloid được phân lập và định danh, chúng thuộc các
nhóm flavonoid, chromon, coumarin, terpenoid, steroid, ionon, alcohol, aldehyd,
ceton, acid, ester và hydrocarbon mạch dài. Phenolic là nhóm chiếm ưu thế trong
nhóm hợp chất non-alcaloid [107], [116].
Thân hành là bộ phận được nghiên cứu nhiều nhất, các hợp chất alcaloid và flavonoid
được tìm thấy chủ yếu từ bộ phận này.

Footer Page 16 of 126.


Header Page 17 of 126.

6

1.2.1. Thành phần hóa học của các loài trong chi Crinum
1.2.1.1. Alcaloid của chi Crinum
Alcaloid khung crinin: đây là nhóm đại diện cho alcaloid Crinum do phần lớn các
alcaloid đều thuộc khung này với hơn 80 alcaloid đã được phân lập. Cấu trúc các
alcaloid khung này thay đổi theo 3 cấu trúc sau [107], [116]:

Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học của alcaloid khung crinin
Alcaloid khung lycorin: lycorin là nhóm được xếp thứ hai sau nhóm crinin về số
lượng alcaloid với khoảng 40 alcaloid đã được phân lập. Đại diện lycorin, được tìm
thấy trong 30 loài Crinum. Kế đến là hippadin, pratorimin và pratorinin [107], [116].
Alcaloid khung tazettin: khoảng 13 alcaloid thuộc khung này, đại diện là tazettin và
criwellin được tìm thấy trong 6-7 loài Crinum. Cấu trúc các alcaloid khung tazettin
thay đổi ở vị trí R1, R2, R3, R4, một số ít (3 alcaloid) có cấu trúc vòng methylendioxy
mở và được thay bằng 2 nhóm CH3O- (ornamin - C18H21NO3); 2 nhóm -OH
(ornazidin-C16H20NO3); 1 nhóm -OH và 1 nhóm acetyl (ornazamin - C18H22NO4).
R1

N

R2

O
R3
O

O

R4

(A)

(B)

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B)
Alcaloid kiểu khung belladin: 7 alcaloid đã được tìm thấy, đại diện là belladin [57],
latisodin và latisolin [55] được phân lập từ C. asiaticum và C. latifolium.

Footer Page 17 of 126.


Header Page 18 of 126.

7

Alcaloid khung galanthamin: galanthamin là alcaloid đại diện cho khung này, được
tìm thấy trong thân hành của 8 loài Crinum. Các alcaloid còn lại (khoảng 7 alcaloid)
có cấu trúc thay đổi theo khung Galanthamin.

(C)
(D)
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) và cấu trúc khung galanthamin (D)
Alcaloid khung lycorenin: các alcaloid có cấu trúc thay đổi ở các vị trí R1, R2, R3, R4.
Riêng hippeastrin có cấu trúc vòng methylendioxy ở vị trí R1 và R2.

(E)
(F)
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) và cấu trúc khung cheryllin (F)
Các kiểu khung còn lại có ít số lượng alcaloid hơn:
Alcaloid khung narciclasin: crinasiadin - C14H9NO3, crinasiatin - C22H17NO4 và
narcicrinin - C14H17NO5.

Alcaloid khung cheryllin: cheryllin - C17H19NO3 và latifin - C17H19NO3.
Alcaloid khung phenanthridin: trisphaeridin - C14H9NO2 và 3-hydroxy-8,9methylendioxyphenanthridin.
Alcaloid khung augustamin: augustamin - C17H19NO4.
Alcaloid khung latindin: latindin - C41H31N3O10.

Footer Page 18 of 126.


Header Page 19 of 126.

8

1.2.1.2. Các nhóm hợp chất non-alcaloid trong chi Crinum
Khoảng 100 hợp chất đã được định danh, flavonoid là nhóm được công bố với số hợp
chất được phân lập nhiều nhất [107], [116].
Nhóm flavonoid: 24 flavonoid đã được phân lập từ thân hành và hoa. Hai flavonoid
3’4’-dihydroxyflavan và 7-hydroxy-8-methoxyflavanon được phân lập từ Crinum
latifolium, lần đầu tiên tìm thấy trong họ Amaryllidaceae [104]. Isoliquiritigenin
(2’,4,4’-trihydroxychalcon) từ C. bulbispermum là cấu trúc chalcon đầu tiên được tìm
thấy trong chi Crinum [112].
Flavonoid trong chi Crinum có cấu trúc thuộc các nhóm sau:
R4

R2

R1

OH
R3

O

OH
O

R2O

R1

O

(A)

(B)

Cấu trúc flavonoid nhóm flavan (A)

Cấu trúc flavonoid nhóm flavanon (B)

R6
R5

R3

R1
R2

O

(C)

OH

R3
R2

OR4

O

R4O

R1

R1

OR7

OR3

OH

O

O

(D)

Cấu trúc flavonoid nhóm flavon (C) (D)

R2

(E)

Cấu trúc flavonoid nhóm chalcon (E)

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong chi Crinum
Nhóm coumarin: chỉ mới được tìm thấy trong loài C. latifolium [104], hai hợp chất
coumarin gồm 4-[(senecioyloxy)methyl]-3-4-dimethoxycoumarin - C17H20O6 và 4[(senecioyloxy)methyl]-6-7-dimethoxycoumarin - C17H20O6.
Nhóm terpenoid và sterol: các steroid thực vật như stigmasterol, sitosterol,
dihydrositosterol đã được tìm thấy trong vài loài của chi Crinum.
Nhóm acid béo: hơn 20 acid béo như linoleic, palmitic, arachidic, myristic, oleic,
palmitic, stearic… được định danh từ dịch chiết nước.

Footer Page 19 of 126.


Header Page 20 of 126.

9

Nhóm carbohydrat: gồm resin, pectin, hemicellulose, glucan và polysaccharid. Thân
hành loài C. amabile chứa 5,4% saccharid; 8,7% pectin, 8,2% hemicellulose. Glucan
A và B từ loài C. latifolium, glucan A chứa 12 đơn vị glucose và 110 gốc của glucose.
Glucose, arabinose, xylose, galacturonic và glucuronic acid được phân lập từ dịch
chiết nước của thân hành loài C. bulbispermum.

1.2.2. Thành phần hóa học của TNHC - Crinum latifolium L.
- Thành phần hóa học loài C. latifolium khảo sát từ năm 1982 do nhóm tác giả nước
ngoài như Ghosal S. [53], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61], [62], Kobayashi S.

[83], [84] thực hiện.
- Những nghiên cứu ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài này phải kể đến các
công trình của các tác giả Phan Tống Sơn [9], Nguyễn Công Hào [8], [33], [102],
Nguyễn Hải Nam [103], [104], Võ Thị Bạch Huệ [11], [12], [13], [14].
- Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm với các công trình nghiên cứu chủ yếu về tác dụng
sinh học [31], [106], [107], [139].
Alcaloid của TNHC: đến nay đã có 36 alcaloid được phân lập và định danh, phần lớn
thuộc khung crinin và lycorin (Bảng 1.1).
- Thành phần và hàm lượng alcaloid thay đổi đáng kể theo thời kỳ sinh trưởng, thời
kỳ trước và sau khi cây ra hoa [58], [62], [106].
- Đã có 12 alcaloid được phân lập từ TNHC trồng ở Việt nam, tài liệu [9] công bố
nhiều nhất với 12 alcaloid từ dịch chiết lá và thân hành. Alcaloid thuộc khung crinin
chiếm số lượng nhiều nhất, gồm 7 alcaloid: 6-hydroxybuphanidrin [9], ambellin [8],
[9], [11]; crinin [8], [9]; powellin [9]; crinamidin [8], [9], [11]; 6-hydroxycrinamidin
[8], [9], [11], [102]; 6-hydroxyundulatin [9]; khung lycorin có pratorinin [9], lycorin
[8], [9]; hippadin [9], lycorin-1-OAc [9], khung augustamin có augustamin [9], [11].
-Tài liệu [11] công bố 4 alcaloid từ dịch chiết lá, trong đó 6-hydroxycrinamidin là
hợp chất alcaloid tự nhiên lần đầu tiên được công bố (năm 1998).
Nhóm carbohydrat: glucan A và B [60]; lectin (methyl-α-mannopyranosid) đều được
phân lập từ dịch chiết thân hành [78].

Footer Page 20 of 126.


Header Page 21 of 126.

10

Coumarin: từ dịch chiết methanol, tài liệu [104] công bố hợp chất coumarin 4senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin. Hiện tại thành phần này chưa được
phát hiện trong các loài Crinum khác.

Nhóm acid hữu cơ: para-hydroxycinnamic methyl ester và 2,5-dihydroxycinnamic
ethyl ester từ dịch chiết lá tươi [33].
Flavonoid của TNHC: so với nhóm alcaloid thì flavonoid có số lượng các hợp chất
được công bố ít hơn, gồm 8 flavonoid sau [33], [103], [104]:
OH

OH

OH

OH

O

O

4’,7-dihydroxyflavan

3’4’-dihydroxyflavan

OMe

OCH=CH2
OH

OH

OH
OH

O

4’,7-dihydroxy-3’-methoxyflavan

4’,7-dihydroxy-3’-vinyloxyflavan

OH

OMe
OMe

OMe
OMe

O

OH

O

O

O

OH
OH

O

5,6,3’-trihydroxy-7,8,4’-trimethoxyflavon

7-hydroxy-8-methoxyflavanon
OH

OH

OH

O

OH

O Glc

OH

O

2’,4’,7-trihydroxydihydrochalcon

OH

O

Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC

Footer Page 21 of 126.

Header Page 22 of 126.

11

Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L.
Stt
Tên alcaloid - TLTK
Khung crinin

CTPT

R1

R2

R3

R4

(I)

1
3

(I)
11-O-acetylambellin [54]

(II)
C20H23NO6

C18H21NO5

OMe

H

OMe

OAc

OMe

H

OMe

OH

C18H21NO6
C16H17NO3

OMe

OH

OMe

OH

OMe

H

H

H

13 Powellin [9], [84]

C17H19NO4

OH

H

OMe

H

16 6-hydroxybuphanidrin [9], [100]

C18H21NO5

OMe

OH

OMe

H

6
8

Ambellin [9],[11],[57],[92],[100],[126]
Crinafolin [61]
Crinin [9], [58], [83]

C20H23NO6
C18H21NO6

OMe

(II)
H
OMe

OMe

H

OMe

OH

11 Undulatin [84],[92], [100], [130], [129]

C18H21NO5

OMe

H

OMe

H

12 6-hydroxyundulatin [9], [92]

C18H21NO6

OMe

OH

OMe

H

14 Crinamidin [9], [11], [92]

C16H18NO5

OH

H

OMe

H

15 6-hydroxycrinamidin [8], [9], [11], [92], [102]

C17H19NO6

H

OH

OMe

H

2
4

11-O-Acetyl-1,2-β-epoxyambellin [54]
1,2-β-epoxyambellin [57], [56]

(III)

7 Crinamin [83]
9 Hamayn [83]
10 Hamyan-3-O-acety [83]

C17H19NO4
C16H17NO4
C18H19NO5

Me

H
Ac

H
H
H

(IV)

5

Crinafolidin [62], [61]

Footer Page 22 of 126.

C19H23NO6

OAc


Header Page 23 of 126.

12

Tên alcaloid - TLTK
Khung lycorin

CTPT

R1

R2

R3

R4

(V)

21 Lycorin-4,5-dehydroanhydro [62]
24 Pratorimin [57]
25 Pratorinin [9], [57]

C16H11NO2
C16H11NO3
C16H11NO3

H
O

H
H

-CH2H
Me

O

H

Me

H

26 Pratosin [57]
27 Pratorin (hippadin) [9], [57]

C17H13NO3
C16H9NO3

O

H

Me

Me

O

H

-CH2-

R2
R1O
H

O
H

O

N

17 1,2-O-Diacetyl-lycorin [83]
18 Lycorin [8], [9], [57], [59], [62], [83]

C20H21NO6
C16H17NO4

Ac

βOAc

H

βOH

19 Lycorin-1-Oac [9], [83]

C18H19NO5

Ac

βOH

20 Lycorin-2-epi [62]
23 Lycorin-1-O-β-D-Glucosid [58]

C16H17NO4

C22H27NO9

H
Glc

αOH
βOH

(VI)

OH
OH

OH

O

(VII)
N

O

22 2-Epipancrassidin [62]
Khung belladin

C16H17NO5
R2
R1O

(VIII)

MeO
R4O

28
29
30
31

Belladin [57]
Ryllistin [56]
Latisodin [55]
Latisolin [55]

Footer Page 23 of 126.

N
R3

C19H24NO3
C19H25NO4
C17H21NO3
C24H31NO8

Me
Me
H
Glc

H

OMe
H
H

Me
H
H
H

Me
Me
Me
Me


Header Page 24 of 126.

13

CH3 N
O

OH
O

O
O

32 Hippeastrin [84]
(khung lycorenin)

C17H17NO5

(IX)

CH3
N

O
O

O

33 Augustamin [9], [11], [93]

O

C17H19NO4

(khung augustamin)
Khung cheryllin

(X)

OH

R2

H

H3CO
N CH3

R1

34 Cheryllin [83]
35 Latifin [58], [83], [84]

C17H19NO3
C17H19NO3
O

OH

H

H

OH

(XI)

O

OH

OH
O

O

N

N

36 Latindin [58] (khung clivimin)

Footer Page 24 of 126.

O

O

O

O

C41H31N3O10

N

(XII)


Header Page 25 of 126.

14

1.3. TỔNG QUAN TÁC DỤNG SINH HỌC CHI CRINUM VÀ TNHC
1.3.1. Tác dụng sinh học của một số loài trong chi Crinum
Các loài trong chi Crinum được quan tâm do có nhiều tác dụng sinh học. Nhóm được

chú ý nhiều nhất là alcaloid [52], [58], [107], [116], kế đến là flavonoid [31], [103].
- Trước đây, các loài này được sử dụng như thuốc cổ truyền:
Thân hành và lá tươi của các loài C. amabile, C. asiaticum, C. defixum, C. giganteum
điều trị các chứng mụn nhọt, sưng lở, sưng do viêm [4], [21], [58].
Cao cồn và cao nước chiết từ thân hành của loài C. zeylanicum được sử dụng như vị
thuốc cổ truyền trong điều trị các chứng viêm, vết thương mưng mủ, trị rắn cắn. Dịch
ép từ lá tươi dùng để trị chứng đau tai [107], [125].
- Các công trình khoa học cho thấy các loài trong chi Crinum thể hiện hoạt tính sinh
học chung của họ Amaryllidaceae [52], [107], [116] như sau:
1.3.1.1. Tác dụng kháng acetylcholinesterase:
- Thử nghiệm sàng lọc khả năng kháng acetylcholinesterase bằng phương pháp
SKLM, chất đối chiếu galantamin trên 15 mẫu cao methanol từ thân hành của 15 loài
trong họ Amaryllidaceae. Kết quả cho thấy cao chiết C. powellii và Amaryllis
belladonna ở nồng độ 10 mg/ml thể hiện hoạt tính cao nhất [117].
- Cao thân hành của loài C. bulbispermum có khả năng kháng acetylcholinesterase
với IC50 = 0,14 ± 0,039 µg/ml và C. moorei với IC50 = 21,5 ± 8,40 µg/ml. Hoạt tính
này được giải thích là do thành phần alcaloid [34], [51].
- Cao methanol từ thân hành của loài C. jagus (45,1%) và C. glaucum (40,8%) ở nồng
độ 100 µg/ml. Tính kháng acetylcholinesterase có liên quan đến sự hiện diện của
nhóm hydroxy trong cấu trúc của alcaloid [66].
1.3.1.2. Tác dụng chống oxi hóa:
- Liều 200 mg/kg, cao ethanol của loài C. asiaticum làm giảm lượng đường trong
máu, giảm cholesterol, triglycerid được quan sát sau 15 ngày điều trị. Đồng thời, các
chỉ số men gan đều giảm chứng tỏ cao chiết có thể bảo vệ tế bào gan theo cơ chế
chống oxi hóa trên mô gan của chuột bị tiểu đường [71].

Footer Page 25 of 126.