Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch

Header Page 1 of 126.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
*******

PHẠM MINH NHỰT

BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT
QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG
TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY
NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP
HĨA MƠ MIỄN DỊCH

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006
Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

*****

BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT
QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG
TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY
NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP
HĨA MƠ MIỄN DỊCH

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. NGUYỄN VĂN HẢO

PHẠM MINH NHỰT

ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN

KHĨA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
Footer Page 2 of 126.


Header Page 3 of 126.

NONG LAM UNIVERSITY, HCMC

DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

*****

STANDARD CHALLENGE TEST MODEL
AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY PRIMARILY
INVESTIGATING PATHOGENESIS OF
WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN BLACK
TIGER SHRIMP (Penaeus monodon)

GRADUATION OF THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor:

Student:

PhD. NGUYEN VAN HAO

PHAM MINH NHUT

MSc. NGO XUAN TUYEN

TERM: 2002 - 2006

HCMC, 8/2006

Footer Page 3 of 126.

Header Page 4 of 126.

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
BGH Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM và các thầy cô ở Bộ Môn Công Nghệ
Sinh Học đã tạo mọi điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm
đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
để chúng em hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
TS. Nguyễn Văn Hảo, ThS. Ngô Xuân Tuyến, CN. Đồn Văn Cƣờng đã tận tình
chỉ bảo, giải đáp các vƣớng mắc, các khó khăn mà tơi gặp phải trong suốt q trình
thực tập, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
KS. Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình tơi
thực hiện đề tài.
TS. Lý Thị Thanh Loan đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập tại
Viện.
Các anh chị ở phịng Mơ học tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Mơi
Trƣờng và Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên
Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong
q trình thực hiện đề tài.
Các anh chị ở phòng Sinh Học Thực Nghiệm và Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ
Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành q trình bố trí thí nghiệm.
Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt và các bạn thân yêu ở lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã
cùng tôi chia sẻ những cảm xúc vui buồn trong thời gian học tập và giúp đỡ, động viên
tơi để tơi hồn thành khóa luận này.
Và con vơ cùng biết ơn cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã ln động
viên, giúp đỡ con để con có thể hồn thành khóa luận này.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006.
Sinh viên thực hiện
Phạm Minh Nhựt

Footer Page 4 of 126.

iv


Header Page 5 of 126.

TÓM TẮT
PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006.
“BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM
TRẮNG TRÊN TƠM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM
THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH”.
Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. NGUYỄN VĂN HẢO
ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN
Bệnh đốm trắng do virus đốm trắng (WSSV) gây ra là nguyên nhân gây chết
hàng loạt đối với tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên tại Việt Nam và trên thế giới. Các
nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tơm hiện nay rất ít.
Do đó việc hiểu rõ hơn về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng sẽ giúp cho
việc tạo ra những phƣơng thức kiểm sốt bệnh. Kết hợp mơ hình gây nhiễm thực
nghiệm chuẩn và phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch trên tôm sú không mang các virus
thông thƣờng nhằm xác định vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng, phân tích sự
xâm nhiễm và tìm ra ngun nhân gây chết trên tơm.
Tiến trình thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau: tôm không mang các virus thông
thƣờng đƣợc gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ với liều thấp (10 1,5 SID50/ml) và
liều cao (104,0 SID50/ml). Ở mỗi liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo từng thời điểm
sau khi gây nhiễm. Sử dụng phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch để khảo sát các mẫu theo
từng thời điểm nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm
sú.
Các kết quả thu đƣợc:

Các biểu hiện lâm sàng của tơm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất
thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết, đƣợc phát hiện vào thời
điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao.
Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú ở liều thấp xảy ra vào
thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này
là 33,3 % và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của chúng là các tế bào của tim với cƣờng
độ nhiễm là (+)
Footer Page 5 of 126.

v


Header Page 6 of 126.

Ở liều cao, các cơ quan phát hiện dƣơng tính với virus đốm trắng vào thời điểm
12 giờ sau khi tiêm sau khi nhuộm bằng hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm
trắng tại thời điểm này là 50 %. Và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng ở
liều cao là các tế bào của tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten và các tế bào của màng
bao bên ngoài gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+).
Ở thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và ở cả 2 liều gây nhiễm tất cả các cơ
quan đều bị nhiễm virus đốm trắng.
Cƣờng độ nhiễm virus đốm trắng trên các cơ quan khi gây nhiễm với liều cao
và liều thấp có sự khác biệt trên các cơ quan lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten,
dạ dày, biểu mô dƣới vỏ và mô liên kết của màng bao gan tụy.

Footer Page 6 of 126.

vi

Header Page 7 of 126.

MỤC LỤC
TRANG
TRANG TỰA
LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... ..... iv
TÓM TẮT................................................................................................................. ...... v
MỤC LỤC ................................................................................................................ ....vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... ...... x
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..........................................................................................xii
PHẦN I: GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1

1.2.

Mục đích .............................................................................................................. 2

1.3.

Yêu cầu ................................................................................................................ 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1.

Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú ................................................... 3

2.1.1. Miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác ............................................................... 3

2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác ............................ 3
2.1.3. Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase ................................................................... 3
2.1.4. Hệ thống đông máu .............................................................................................. 6
2.1.5. Các chất ức chế proteinase ................................................................................... 7
2.1.6. Hệ thống nhận diện không chuyên biệt ................................................................ 7
2.1.7. Các peptide kháng khuẩn ..................................................................................... 8
2.1.8. Peroxynectin ......................................................................................................... 9
2.2.

Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng ................................................ 9

2.2.1. Bệnh đốm trắng .................................................................................................... 9
2.2.1.1.

Lịch sử và phân bố ........................................................................................ 10

2.2.1.2.

Triệu chứng, bệnh tích .................................................................................. 11

2.2.2. Virus đốm trắng .................................................................................................. 11
2.2.2.1.

Phân loại và tên gọi ....................................................................................... 11

2.2.2.2.

Hình thái........................................................................................................ 12

2.2.2.3.

Cấu trúc ......................................................................................................... 13

2.3.

Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng ............................................. 15

Footer Page 7 of 126.

vii


Header Page 8 of 126.

2.3.1. Vật liệu gây bệnh ................................................................................................ 15
2.3.2. Cơ chế gây bệnh ................................................................................................. 16
2.3.3. Cơ chế lây lan ..................................................................................................... 17
2.4.

Mơ hình cảm nhiễm chuẩn virus trên tơm ..................................................... 18

2.5.

Phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch ..................................................................... 19

2.5.1. Ngun lý .......................................................................................................... 19
2.5.2. Kháng nguyên ..................................................................................................... 20
2.5.3. Kháng thể............................................................................................................ 20
2.5.4. Phƣơng pháp nhuộm ........................................................................................... 21
2.5.4.1.

Phƣơng pháp trực tiếp ................................................................................... 21

2.5.4.2.

Phƣơng pháp gián tiếp .................................................................................. 22

2.5.4.3.

Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) .......................... 23

2.5.4.4.

Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) ................................. 23

2.5.4.5.

Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) .................................... 24

PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 25
3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 25
3.1.1. Thời gian .............................................................................................................. 25
3.1.2. Địa điểm .............................................................................................................. 25
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 25
3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm ................ 25
3.2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................. 25
3.2.1.2. Dụng cụ............................................................................................................. 25
3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC ....................................................... 26
3.2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................ 26
3.2.2.2. Vật tƣ ................................................................................................................ 26

3.2.2.3. Thiết bị .............................................................................................................. 26
3.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 27
3.3.1. Tơm và điều kiện thí nghiệm .............................................................................. 27
3.3.2. Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) ................................................... 27
3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú .............................................................. 27
3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ................. 28
Footer Page 8 of 126.

viii


Header Page 9 of 126.

3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28
3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus ...................................................................... 28
3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tôm................................................................................... 29
3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC .................................................................................... 30
3.4.4. Xử lý thống kê ..................................................................................................... 34
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 35
4.1. Độc lực của virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) ........................................... 35
4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ gây chết .............................................................. 35
4.1.2. Tỷ lệ nhiễm của tơm thí nghiệm theo từng thời điểm ......................................... 36
4.2. Khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dịng Việt Nam
trên tơm sú ............................................................................................................ 37
4.2.1. Q trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tơm sú
ở liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) ................................................................ 38
4.2.2. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú
ở liều cao (104,0 SID50/ml) .................................................................................. 42
4.2.3. So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh ............................. 46
4.3. Thảo luận .............................................................................................................. 48

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 50
5.1. Kết luận ................................................................................................................. 50
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 52
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 57

Footer Page 9 of 126.

ix


Header Page 10 of 126.

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
WSSV

White Spot Syndrome Virus

WSSV-VN

White Spot Syndrome Virus – Việt Nam

WSSV-TL

White Spot Syndrome Virus – Thailand

WSD

White Spot Disease

MBV

Monodon Baculovirus

YHV

Yellow Head Virus

proPO

Prophenoloxidase

PO

Phenoloxidase

AMPs

Antimicrobial Peptides

LPS

Lipopolysaccharide

PG

Peptidoglycan

PPAE

Prophenoloxidase Activating Enzyme

CP

Clotting Protein

TGase

Transglutaminase

PAMPS

Pathogen-associated Molecular Patterns

PRR (PRP)

Pattern Recognition Receptor (protein)

GBP

Beta Glucan Binding Protein

LPBP

Lipopolysaccharide binding protein

ICTV

International Committee on Taxonomy for Virus

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

SID

Shrimp Infectious Dose

LD

Lethal Dose

IHC

Immunohistochemistry

ctv

cộng tác viên

Footer Page 10 of 126.

x


Header Page 11 of 126.

DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng ............................... 4
Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ............ 27
Bảng 4.1: Tỷ lệ phần trăm (%) tôm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng ở các thời
điểm sau khi gây nhiễm ................................................................................. 34
Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng
thời điểm ........................................................................................................ 35
Bảng 4.3: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan
khảo sát ở liều thấp (%) ................................................................................. 37
Bảng 4.4: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan
khảo sát ở liều cao (%) .................................................................................. 41
Bảng 4.5: Tỷ lệ (%) các cơ quan bị nhiễm WSSV-VN theo từng thời điểm khảo sát ... 46

Footer Page 11 of 126.

xi


Header Page 12 of 126.

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Tơm bị bệnh đốm trắng .................................................................................. 11
Hình 2.2: Hình thái của virus đốm trắng quan sát dƣới kính hiển vi điện tử ................. 12
Hình 2.3: Thành phần các protein của virus đốm trắng ................................................. 13
Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng.......................................................................... 14
Hình 2.5: Kháng thể đa dịng và kháng thể đơn dịng .................................................... 20
Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC ........................................................................ 21

Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm .................................................................................. 26
Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tơm thí nghiệm............................................................ 27
Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tơm ......................................................... 28
Hình 3.4: Các giai đoạn thực hiện IHC .......................................................................... 29
Hình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu ................................................................................. 30
Hình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC ................................................................................. 31
Hình 4.1: Tơm bị nhiễm virus đốm trắng ....................................................................... 35
Hình 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tơm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo
từng thời điểm................................................................................................. 36
Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN .................... 37
Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan
ở liều thấp. ...................................................................................................... 38
Hình 4.5: Các tế bào của các cơ quan bị nhiễm WSSV ở tơm thí nghiệm liều thấp ...... 40
Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan
ở liều cao ........................................................................................................ 42
Hình 4.7: Các cơ quan bị nhiễm WSSV ở liều cao sau khi nhuộm IHC ........................ 43
Hình 4.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ nhiễm trên các cơ quan khảo sát ở liều cao
và liều thấp ..................................................................................................... 45

Footer Page 12 of 126.

xii


Header Page 13 of 126.

1

PHẦN I: GIỚI THIỆU
1.1.

Đặt vấn đề
Bệnh đốm trắng (White Spot Disease) do virus gây hội chứng đốm trắng (White

Spot Syndrome Virus – WSSV) gây ra trên tôm sú nuôi. Đây là bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm cho nhóm tơm he, bệnh có sức tàn phá rất lớn, làm tôm chết trong thời gian
rất ngắn, gây chết 100 % trong khoảng thời gian từ 3 – 7 ngày (Leong, 2005) và có khả
năng lây lan rất nhanh. Chính virus này đã làm suy giảm sản lƣợng tôm hằng năm trên
thế giới, gây thiệt đáng kể đến nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có
Việt Nam.
Hiện nay, trên thế giới có nhiều cơng trình nghiên cứu về bệnh đốm trắng và
WSSV ở nhiều khía cạnh khác nhau nhƣ hình thái, cấu trúc, di truyền, các yếu tố nguy
cơ xảy ra dịch bệnh, phát triển thuốc, vaccine… Trong khi đó các cơng trình nghiên
cứu về quá trình phát sinh bệnh của WSSV lại rất hạn chế. Kết quả của nghiên cứu quá
trình phát sinh bệnh ở các mức độ tế bào, phân tử giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế
tƣơng tác quan trọng của các giai đoạn virus tiếp cận, xâm nhập, nhân bản, hình thành
hạt virus bên trong và phát tán ra ngồi tế bào vật chủ. Từ những kết quả quan trọng
này giúp cho chúng ta tìm ra đƣợc các thời điểm hay giai đoạn mấu chốt của quá trình
nơi mà chúng ta có thể phát triển các giải pháp can thiệp, ngăn chặn khác nhau (thuốc,
vaccine, các yếu tố lý hoá...). Đây cũng là hƣớng tiếp cận mới cho WSSV do trƣờng
đại học Ghent-Bỉ đề xuất, trong đó sử dụng mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và
các kỹ thuật nhuộm miễn dịch đặc hiệu sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protein
VP28 của WSSV để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ cơ quan, mô, tế
bào và phân tử. Với phƣơng pháp này, cho phép chúng ta biết đƣợc về quá trình xâm
nhiễm của WSSV theo thời gian, tiến trình, mức độ xâm nhiễm của virus ở các cơ
quan đích khác nhau. Việc nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng
trên tơm sú là rất cần thiết, nó làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu và các thí
nghiệm đánh giá độ mẫn cảm của các dịng tơm đối với virus, hay tác dụng của các
thuốc, chế phẩm, vaccine trên hệ miễn dịch của tôm đối với việc đề kháng lại virus,
đồng thời nhằm phát triển các chiến lƣợc kiểm soát WSSV và sự bùng nổ bệnh đốm

Footer Page 13 of 126.


Header Page 14 of 126.

2

trắng ở các mức độ khác nhau trên tôm sú (ở mức độ cá thể, quần thể, ao nuôi, khu
nuôi, khu vực nuôi, vùng nuôi và quốc gia).
Từ cơ sở quan trọng đó, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học
và sự chấp thuận của Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II, tôi đã thực hiện đề tài “Bước đầu
khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot
Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây
nhiễm

thực

nghiệm

chuẩn

và

phương

pháp

hóa

mơ

miễn

dịch

(immunohistochemistry)”
1.2.

Mục đích
Thực hiện gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tôm sú sử dụng liều virus

SID50/ml đã đƣợc chuẩn độ xác định nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus
đốm trắng trên tơm bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch.
1.3.
-

Nội dung
Gây nhiễm thực nghiệm chuẩn với liều virus SID50/ml thấp và cao trên tôm sú
45 ngày tuổi, theo dõi tôm và thu mẫu theo thời gian sau cảm nhiễm.

-

Sử dụng IHC để khảo sát quá trình xâm nhiễm của WSSV ở các cơ quan đích
khác nhau theo từng thời điểm trên cơ thể tôm.

Footer Page 14 of 126.


Header Page 15 of 126.

3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú

2.1.1. Cơ chế phòng vệ chung của giáp xác
Hệ thống phòng vệ ở động vật đƣợc chia thành 2 nhóm chính là miễn dịch thụ
động và miễn dịch chủ động. Ở giáp xác khơng có hệ thống miễn dịch chủ động, do đó
cơ chế phịng vệ của giáp xác chủ yếu dựa vào đáp ứng miễn dịch thụ động
(Jiravanichpaisal, 2005).
Hệ thống phòng vệ thụ động đóng vai trị quan trọng trong sự tồn tại của giáp
xác. Lớp vỏ bên ngoài là một rào cản vật lý hữu hiệu chống lại sự gắn kết và xâm nhập
của các tác nhân gây bệnh. Hệ thống phòng vệ của lớp cutin này rất hiệu quả, chống
lại các tác nhân gây bệnh và các tác nhân gây bệnh chỉ tạo nên bệnh tích khi lớp vỏ
bọc này bị tổn thƣơng. Đƣờng tiêu hóa, là con đƣờng chính của sự xâm nhập, đƣợc
bảo vệ bằng màng chitin. Trong ruột có mơi trƣờng acid và chứa nhiều enzyme làm
bất hoạt và tiêu diệt nhiều loại virus và vi khuẩn. Khi các tác nhân gây bệnh vƣợt qua
đƣợc các rào cản trên xâm nhập khoang máu của cơ thể vật chủ, chúng vấp phải một
cơ chế phòng vệ phức tạp liên quan đến đáp ứng miễn dịch thể dịch và tế bào. Đầu
tiên, hệ thống prophenoloxidase (proPO) đƣợc hoạt hóa tạo nên q trình melanin hóa
và tạo ra các nhân tố liên quan đến phản ứng miễn dịch nhƣ peroxinectin. Kế tiếp, đáp
ứng miễn dịch tế bào ở nhiều loại tế bào máu khác nhau sẽ tham gia vào quá trình tiêu
diệt các mầm bệnh bằng cách thực bào các vi sinh vật hay bẫy chúng trong tế bào máu
bằng cách đơng máu hay tạo khối u hoặc đóng gói các vi sinh vật lớn hơn và các phản
ứng độc tế bào. Cuối cùng, trong quá trình xâm nhập của vật lạ, một tỷ lệ lớn các phân
tử tác động cảm ứng nhƣ các peptide kháng khuẩn (AMPs), các nhân tố cần cho q
trình opsonin hóa cũng đƣợc tạo ra (Jiravanichpaisal, 2005).

2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác
Ở động vật có vú, các loại tế bào máu khác nhau đảm nhiệm các chức năng
chuyên biệt khác nhau chủ yếu liên quan đến sự sống của cá thể nhƣ sự vận chuyển
oxy và sự phòng vệ chống lại sự xâm nhập của vật thể lạ. Ở động vật khơng xƣơng
sống, vai trị quan trọng nhất của các tế bào máu là bảo vệ chúng chống lại sự xâm
nhập của vật thể lạ (Jiravanichpaisal, 2005). Ở giáp xác, các dạng tế bào máu có thể
Footer Page 15 of 126.


Header Page 16 of 126.

4

đƣợc phân biệt dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu của chúng. Tuy nhiên,
các tế bào máu của giáp xác chƣa đạt đến độ biệt hóa rõ rệt và chƣa thể xếp thành các
nhóm tế bào máu nhƣ ở cá và động vật có xƣơng sống (Đỗ Thị Hịa, 2004). Ở giáp xác
thƣờng chứa ba nhóm tế bào máu: hyaline (bạch cầu không hạt), semigranular (bạch
cầu bán hạt) và granular (bạch cầu có hạt) (Jiravanichpaisal, 2005; Đỗ Thị Hịa, 2004)
với chức năng đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng
Chức năng

Nhóm bạch cầu

Thực bào

Đóng gói

Độc tế bào

Hoạt hóa proPO

Khơng hạt

Có

Khơng

Chƣa biết

Khơng

Bán hạt

Hạn chế

Có

Có

Có

Có hạt

Khơng

Rất hạn chế

Có

Có

Bạch cầu khơng hạt có khả năng thực bào, phát hiện đƣợc trong máu các loài
giáp xác bộ mƣời chân, nhƣng số lƣợng tƣơng đối của các tế bào này thay đổi tùy theo
từng loài (Đỗ Thị Hòa, 2004).
Bạch cầu bán hạt đƣợc đặc trƣng bởi sự tồn tại của một số hạt nhỏ trong tế bào
chất tƣơng tự nhƣ bạch cầu có hạt ở động vật có xƣơng sống. Các tế bào này phản ứng
với các polysaccharide có trong thành phần của vách tế bào vi sinh vật nhƣ LPS ở vi
khuẩn, -1,3-glucan của nấm. Các tế bào này cũng có khả năng đóng gói các hạt ngoại
lai (Đỗ Thị Hịa, 2004).
Bạch cầu có hạt đặc trƣng bởi các túi hoặc hạt lớn trong tế bào chất. Đặc điểm
này có lẽ đóng vai trị trong việc sản sinh, dự trữ và tiết ra các hợp chất kháng khuẩn.
Các bạch cầu có hạt của giáp xác khơng có khả năng thực bào và khả năng đóng gói
các hạt ngoại lai rất hạn chế. Vai trị chính yếu của chúng là dự trữ proPO – hợp chất
đóng vai trị chính yếu trong đáp ứng bảo vệ của cơ thể giáp xác. Khi tiếp xúc với 1,3-glucan, LPS và PG, bạch cầu có hạt tiết và hoạt hóa proPO thành PO – có tác dụng
xúc tác phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol thành quinone và sản phẩm cuối cùng là
melanin. Quinone và các sản phẩm trung gian của quá trình này là những chất độc đối
với vi sinh vật do hoạt tính cao của chúng (Đỗ Thị Hòa, 2004).
2.1.3. Hệ thống prophenoloxidase (proPO)
Footer Page 16 of 126.


Header Page 17 of 126.

5

Động vật không xƣơng sống không có kháng thể, do đó phải dựa vào hệ thống
nhận diện không đặc hiệu nhƣng chúng vẫn phải nhận biết vật thể lạ và đáp ứng lại nó
để bƣớc đầu chống lại và tiêu hủy chúng. Quá trình nhận biết các vật thể lạ đƣợc thực
hiện nhờ hệ thống proPO (Sritunyalucksana, 2001). Hệ thống proPO chứa nhiều loại

protein liên quan đến sự phịng vệ miễn dịch ở động vật khơng xƣơng sống. Đó là sự
tổng hợp melanin, sự gắn kết tế bào, sự đóng gói và sự thực bào. Hệ thống proPO là
một hệ thống miễn dịch nhận diện không đặc hiệu cực kỳ hiệu quả và đƣợc hoạt hóa
bằng sự nhận biết các LPS hoặc PG có ở vi khuẩn và -1,3-glucan có ở nấm. Hệ thống
chứa một tập hợp proteinase gồm có các protein nhận biết (PRPs), nhiều loại
proteinase, các nguồn tạo enzyme và proPO (Lee, 2001).
Dạng hoạt động của proPO, phenoloxidase (PO) nằm trong bạch cầu có hạt
(Flegel, 1998), cịn đƣợc xem nhƣ là tyrosinase, có khả năng thực hiện hai phản ứng:
sự khử monophenol thành o – diphenol (hoạt tính monophenoloxidase) và sự oxy hóa
của o – diphenol thành o – quinone (hoạt tính diphenoloxidase). Sự tạo ra o – quinone
của PO là bƣớc đầu tiên của chuỗi phản ứng sinh hóa tổng hợp melanin (Lee, 2001).
Mặc dù melanin đƣợc xem là có hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp, nhƣng sự tạo ra các
sản phẩm trong q trình oxy hóa nhƣ các anion superoxide, các gốc hydroxyl trong
q trình tạo quinoid cũng có một vai trị kháng khuẩn quan trọng. Thêm vào đó, các
phản ứng sinh học nhƣ sự thực bào, đóng gói và tạo khối u cũng đƣợc hoạt
hóa.(Flegel, 1998).
Hệ thống proPO đƣợc hoạt hóa bằng các thành phần thành tế bào vi khuẩn nhƣ
LPS, -1,3-glucan hay PG, từ đó kích thích sự hoạt hóa của các proteinase trong hệ
thống proPO (Lee, 2001). Sau đó dƣới điều kiện sinh lý, các protein chuyên biệt của
hệ thống proPO cần sự phân cắt của các proteinase này để tạo ra trạng thái hoạt động;
hệ thống proPO từ trạng thái bất hoạt với trọng lƣợng phân tử là 76 kDa đƣợc chuyển
đổi thành dạng hoạt động có trọng lƣợng phân tử là 62 kDa bằng enzyme hoạt hóa
prophenoloxidase (PPAE) (Sritunyalucksana, 2001). Bên cạnh đó, q trình hoạt hóa
hệ thống proPO cần có sự hiện diện của ion Ca2+. Nếu thiếu Ca2+ thì q trình hoạt hóa
khơng xảy ra ngay cả khi có các yếu tố kích thích (Flegel, 1998).
Tóm lại, sự hoạt hóa proPO ở giáp xác liên quan đến hai bƣớc: Bƣớc thứ nhất là
quá trình mất hạt xảy ra khi tế bào máu bị kích thích bởi các thành phần của vi khuẩn
Footer Page 17 of 126.

Header Page 18 of 126.

6

nhƣ LPS, -glucan hoặc PG và tạo ra dạng bất hoạt của cả proPO lẫn PPAE. Bƣớc thứ
hai đòi hỏi sự tham gia của Ca2+ để chuyển đổi PPAE bất hoạt thành proteinase hoạt
động để phục vụ cho quá trình biến đổi proPO thành PO hoạt động (Flegel, 1998).
2.1.4. Hệ thống đông máu
Một hệ thống khác cũng đƣợc hoạt hóa bởi các sản phẩm của vi sinh vật là hệ
thống đông máu. Đây là một đáp ứng phịng vệ quan trọng ở giáp xác bởi vì nó ngăn
chặn sự mất máu khi bị tổn thƣơng ở bộ xƣơng ngoài lẫn sự xâm nhập của vi sinh vật
khắp cơ thể. Protein huyết tƣơng cấu thành những khối máu đƣợc gọi là các protein
đông máu (CP) (Flegel, 1998).
CP đƣợc tinh sạch từ nhiều loài giáp xác khác nhau gồm tôm hùm Panulirus
interruptus, crayfish P. leniusculus, và tôm thẻ chân trắng P. vannamei. Trong tất cả
các trƣờng hợp, CP đƣợc xác định là một glycoprotein với trọng lƣợng phân tử 420
kDa với 2 tiểu đơn vị tƣơng tự nhau đƣợc nối với nhau bằng liên kết disulfide. Thêm
vào đó, thành phần cấu tạo của CP ở tôm thẻ chân trắng thì cũng tƣơng tự nhƣ
crayfish, tơm hùm và cua, mặc dù những lồi này có những loại tế bào đơng máu khác
nhau (Flegel, 1998).
Yếu tố đóng vai trị quan trọng của q trình đơng máu là transglutaminase
(TGase) tế bào đƣợc tạo ra bởi tế bào máu (có lẽ là tế bào khơng hạt) dƣới sự kích
thích của các tác nhân ngoại bào. Kết quả phản ứng phân giải của TGase là tạo thành
những liên kết chéo -( -glutamyl)-lysine nội phân tử giữa mặt bên của gốc glutamine
trên một chuỗi polypeptide với mặt bên của gốc lysine trên một chuỗi polypeptide
khác (Vargas-Albores và ctv, 1998; Flegel, 1998)
Mặc dù có sự khác nhau trong cấu trúc nhƣng hệ thống đông máu của động vật
có xƣơng sống và động vật khơng có xƣơng sống có cơ chế tƣơng tự nhau mặc dù cách
thức thực hiện khác nhau. Trong cả hai trƣờng hợp, khối đơng đƣợc hình thành bởi sự
hoạt động của TGase kết hợp với Ca2+ trên các tế bào huyết tƣơng gây đông,

fibrinogen hoặc protein gây đông. Tuy nhiên ở động vật có xƣơng sống, địi hỏi q
trình phân cắt protein trƣớc đó (fibrinogen thành fibrin) để tạo nên cơ chất cho TGase
trong huyết tƣơng. Trái lại, TGase ở tôm đƣợc giữ trong các tế bào máu (giống nhƣ
các loài động vật không xƣơng sống khác) và hoạt động ngay lập tức khi đƣợc giải
phóng. Xem nhƣ q trình phân cắt protein trƣớc đó khơng cần thiết, chỉ cần sự kích
Footer Page 18 of 126.


Header Page 19 of 126.

7

thích của bạch cầu khơng hạt cùng với sự xuất hiện của LPS vi khuẩn là đủ để kích
thích sự giải phóng TGase và dẫn đến q trình đơng máu tiếp theo (Vargas-Albores
và ctv, 1998; Flegel, 1998).
2.1.5. Các chất ức chế proteinase
Các nhóm proteinase, nhƣ nhóm gây đông máu và hệ thống proPO cần thiết cho
quá trình điều hịa để ngăn ngừa sự hoạt hóa q mức của các nhóm enzyme nội sinh
và gây hại tế bào vật chủ. Hoạt động của các chất ức chế proteinase đƣợc tìm thấy ở
nhiều lồi động vật khơng có xƣơng sống, đóng vai trị quan trọng trong q trình
kiểm sốt và điều hịa hoạt động của hệ thống đơng máu và hệ thống proPO. Các nhóm
chất ức chế đƣợc tìm ra nhƣ Kasal, Kunitz, serpin,

-macroglobulin và chất ức chế

metalloproteinase (Jiravanichpaisal, 2005)
Trong số các chất ức chế proteinase ức chế hoạt động của hệ thống proPO thì
có nhiều chất ức chế proteinase ngăn chặn sự hoạt hóa quá mức của PPAE và một chất
ức chế phenoloxidase trực tiếp ức chế hoạt tính của phenoloxidase. Chất ức chế PPAE
hiệu quả nhất ở crayfish là pacifastin, một protein heterodimer 155 kDa với một cấu

trúc duy nhất. Nó chứa một chuỗi nhẹ với 9 đơn vị ức chế proteinase và một chuỗi
nặng chứa 3 thùy transferrin. Phân tử này đƣợc gắn bằng các liên kết giữa các peptide
và hình thành nên một chất ức chế proteinase mới đƣợc gọi là các chất ức chế serine
proteinase giống pacifastin, hiện diện và ức chế hệ thống proPO ở nhiều loài giáp xác
(Jiravanichpaisal, 2005).
2.1.6. Hệ thống nhận diện không chuyên biệt
Hệ thống miễn dịch thụ động ở động vật khơng xƣơng sống đƣợc hoạt hóa bởi
các tác nhân gây bệnh và nó là trung gian cho phản ứng giữa các phân tử nhận diện và
tác nhân gây bệnh. Những phân tử nhận diện các vật thể lạ đƣợc Janeway gọi là các
protein nhận diện kháng nguyên (PRP) (Lee, 2001). Các PRP này nằm trên bề mặt của
tế bào hoặc ẩn trong hemolymph, để sẵn sàng nhận diện sự xâm nhập của vi sinh vật lạ
(Jiravanichpaisal, 2005).
Một số protein nhận diện đã đƣợc tìm thấy ở động vật khơng xƣơng sống. Đó
là:
Lectin/ agglutinin là những glycoprotein khơng có hoạt tính phân giải nhƣng có
khả năng gắn kết với các carbohydrate chuyên biệt và có mặt ở hầu hết các sinh vật
sống. Chúng có thể gắn kết tế bào và tạo ra phản ứng ngƣng kết. Tƣơng tác giữa lectin
Footer Page 19 of 126.


Header Page 20 of 126.

8

và carbohydrate có liên quan đến nhiều hoạt động sinh học khác nhau ví dụ nhƣ là sự
vận chuyển carbohydrate của mô và tế bào, các glycoprotein, sự gắn kết tế bào, sự
opsonin hóa và sự hình thành các khối u. Đặc biệt, các lectin type C, các lectin có hoạt
tính phụ thuộc vào Ca có liên quan đến sự nhận biết miễn dịch ở động vật không
xƣơng sống (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001)
GBP và LPBP có trình tự tƣơng tự nhƣ glucanase ở vi khuẩn nhƣng chúng

khơng biểu hiện bất kỳ hoạt tính nào của glucanase và thay vào đó là làm tăng sự hoạt
hóa hệ thống proPO. Các GBP ở crayfish nằm trong huyết tƣơng và tƣơng tác với 1,3- glucan để gia tăng sự hoạt hóa của hệ thống proPO và cũng hoạt động nhƣ một
opsonin để tăng khả năng thực bào (Jiravanichpaisal, 2005).
Protein giống masquerade (mas-like protein) là một protein nhận diện kháng
ngun trong tế bào máu vì nó có khả năng gắn với LPS, -1,3-glucan, vi khuẩn gram
(-) và nấm men. Các mas-like protein cũng có hoạt tính opsonin và gắn kết tế bào. Do
đó, các mas-like protein là một protein đa chức năng. Trình tự aminoacid của nó tƣơng
đồng với serine proteinase ngoại trừ sự thay thế bộ ba xúc tác  khơng có hoạt tính
phân giải (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005)
Hemolin thuộc liên họ immunoglobulin chứa những vùng giống Ig có thể gắn
với phần lipid A của LPS và vi khuẩn gram (-) (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005).
Vai trò của hemolin trong động vật không xƣơng sống vẫn chƣa đƣợc xác định rõ
ràng, tuy nhiên có những báo cáo cho rằng hemolin có khả năng nhận biết khơng
chun biệt và tạo ra đáp ứng miễn dịch và cũng có vai trị trong sự hình thành thần
kinh (Lee, 2001)
2.1.7. Các peptide kháng khuẩn
Các peptide/polypeptide chống lại vi sinh vật (AMPs) do gene mã hóa có vai
trị rất lớn trong giới sinh vật sống từ vi sinh vật đến thực vật và động vật. Một phần
quan trọng của hệ miễn dịch tự nhiên là tạo ra những chất chống lại vi sinh vật mà chủ
yếu là các peptide. Bình thƣờng, AMPs chứa ít hơn 150 – 200 amino acid và đƣợc tạo
ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau. Dựa vào sự phân bố trên mơ của chúng, có thể chắc
chắn rằng AMPs có khả năng bảo vệ vật chủ chống lại các mầm bệnh
(Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001).

Footer Page 20 of 126.


Header Page 21 of 126.

9

Nhiều peptide chống vi sinh vật đã đƣợc xác định từ nhiều lồi cơn trùng và
chelicerate, nhƣng cũng có một số peptide đƣợc tìm thấy ở giáp xác. Trong thập kỷ
vừa qua, nhiều AMP đã đƣợc phân lập từ cua, tôm và crayfish. Một peptide 6.5 kDa và
3.7 kDa (callinectin) đã đƣợc xác định một phần từ tế bào máu của cua. Một họ AMP
có cả hoạt tính kháng khuẩn lẫn kháng nấm đƣợc phân lập từ máu của tôm
Litopenaeus vannamei và đƣợc đặt tên là penaeidin (Destoumieux và ctv, 1997). Gần
đây, histone H2A đƣợc tạo dịng và xác định từ tơm, L. vannamei và đầu N của nó
đƣợc tìm thấy là có tính tƣơng đồng với các peptide histone kháng khuẩn đã biết là
buforin I, parasin và hipposin. Các nhân tố kháng lipopolysaccharide (ALFs) đƣợc tìm
thấy trong tế bào máu của cua và gần đây là tế bào máu của P. monodon. ALF tái tổ
hợp có một phổ kháng nấm và vi khuẩn rộng chống lại cả vi khuẩn gram (-) lẫn vi
khuẩn gram (+). Hai AMP khác, crustin và peptide có nguồn gốc từ hemocyanin cũng
đƣợc tìm thấy ở tơm và crayfish. Crustin, một peptide kháng khuẩn 11.5 kDa đƣợc tìm
thấy ở Carcinus maenas. Đầu C của hemocyanin có hoạt tính kháng nấm nhƣng cơ chế
mà hemocyanin bị phân cắt và đƣợc hoạt hóa ở tôm vần chƣa rõ ràng. Cuối cùng, 2
peptide kháng khuẩn với trọng lƣợng phân tử thấp tên là astacidin 1 và 2 đƣợc tinh
sạch và xác định từ máu của crayfish P. leniuscus. Asticidin 1 với 16 amino acid đƣợc
tạo ra do sự phân cắt của hemocyanin trong khi asticidin 2 với 14 aa, là một peptide
giàu proline (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005).
2.1.8. Peroxinectin
Trong q trình hoạt hóa hệ thống proPO, peroxinectin, một nhân tố gắn kết tế
bào với hoạt tính peroxidase đƣợc tạo ra. Peroxinectin đƣợc tổng hợp trong các tế bào
máu ở trạng thái bất hoạt, chỉ đƣợc giải phóng khi có các vật thể lạ kích thích và đƣợc
hoạt hóa bên ngồi tế bào để thực hiện sự gắn kết. Ngoài khả năng gắn kết tế bào và
hoạt tính peroxidase, peroxinectin cũng là một nhân tố làm mất hạt của tế bào máu,
một yếu tố mở đầu cho q trình đóng gói và opsosin hóa (Sritunyalucksana, 2001).
Chức năng gắn kết của peroxinectin đƣợc thực hiện thông qua những motif gắn
integrin, KGD- hoặc RGD motif. Ngoài việc gắn với integrin, peroxinectin cũng có thể
gắn đƣợc với Cu-Zn-superoxide dismutase bề mặt tế bào máu ngoại vi. Peroxinectin

có thể tạo ra acid hypohalic từ hydrogen peroxide và do đó nó có chức năng nhƣ là
một hệ thống tấn cơng vi sinh vật hiệu quả chống lại sự xâm nhập của chúng
(Sritunyalucksana, 2001).
Footer Page 21 of 126.


Header Page 22 of 126.

2.2.

10

Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng

2.2.1. Bệnh đốm trắng
2.2.1.1.

Lịch sử và phân bố
Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là một trong những nhóm virus

đƣợc xếp vào nhóm virus gây chết cấp tính trên tơm ni. WSSV gây chết trên hầu hết
các lồi tơm thuộc nhóm Penaeus nhƣ P. monodon, P. japonicus, P.chinensis, P.
merguiensis… và trên tất cả các giai đoạn phát triển của tôm từ ấu trùng đến tôm
giống, tôm trƣởng thành (Lý Thị Thanh Loan, 2003).
Mặc dù bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên vào năm 1992 tại Đài Loan,
nhƣng bằng chứng cụ thể lần đầu tiên về căn bệnh này và tác nhân gây bệnh đƣợc biết
vào năm 1993. Sự bùng nổ căn bệnh này xảy ra ở Nhật Bản và ở các trang trại nuôi
tôm Penaeus japonicus. Trong dịch bệnh này, tỷ lệ tơm chết cao đƣợc tìm thấy trong
tất cả các trang trại ni tơm có nhập khẩu tôm giống từ Trung Quốc  một số tác giả
cho rằng virus có nguồn gốc từ Trung Quốc. Một năm sau đó, một nhóm nghiên cứu

viên Trung Quốc đã xác nhận bệnh đốm trắng (WSD) hiện diện ở Trung Quốc vào đầu
năm 1993 (Zhang và ctv, 1998), chính điều này đã giải thích đƣợc điểm khởi đầu bùng
nổ dịch bệnh. Năm 1994, sự hiện diện của WSSV đã có ở hầu hết các quốc gia có ni
tơm ở châu Á nhƣ: Hàn Quốc, Đài Loan, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia,
Ấn Độ…
Ở Việt Nam, vào tháng 2 năm 1994, tại huyện Bình Đại, huyện Thạnh
Phú – tỉnh Bến Tre và tháng 3 đến tháng 4 năm 1994 tại các đầm ni ở huyện Cần
Giờ - Tp. Hồ Chí Minh đã phát hiện tôm bị bệnh đốm trắng chết hàng loạt sau 30 – 40
ngày nuôi (Lý Thị Thanh Loan, 2003)
Năm 1995, WSSV gây chết tôm hàng loạt ở Texas ở các nông trại nhập
khẩu tôm từ châu Á (Lightner, 1999). Vào năm 1997, WSSV đƣợc tìm thấy ở miền
Nam Carolina và chính sách cách ly đƣợc thực hiện nghiêm ngặt ở bang này để kiểm
soát dịch bệnh nhƣng ngƣời dân vẫn bị thiệt hại rất nhiều. Vào năm 1998, công bố một
nghiên cứu đã phát hiện sự nhiễm WSSV trong tôm thƣơng mại nhập khẩu lấy từ các
siêu thị ở Mỹ và sự rủi ro của việc mang WSSV từ châu Á sang châu Mỹ qua nguồn
tôm sống và tôm đông lạnh ngày càng rõ ràng hơn. Đến năm 1999 thì vùng phân bố
địa lý của virus đã lan rộng đến nhiều nông trại nuôi tôm ở Nicaragua, Guatemela,
Panama, Ecuador. Sự xuất hiện của WSSV ở vùng Trung Mỹ và châu Mỹ La tinh đã
Footer Page 22 of 126.


Header Page 23 of 126.

11

khiến Chính phủ các nƣớc ở khu vực này phải có các biện pháp kiểm sốt. Chính phủ
Peru đã chính thức cấm nhập khẩu ấu trùng tôm và tôm bố mẹ và Mexico cho phép
nhập khẩu tơm từ Texas chỉ khi có chứng nhận là trong sản phẩm khơng có WSSV
(Nguyễn Văn Hảo, 2000)
2.2.1.2.

Dấu hiệu bệnh tích

a. Dấu hiệu bên ngồi
Tơm nhiễm bệnh xuất hiện dấu hiệu đỏ thân cùng với đốm trắng bên trong lớp
vỏ đầu ngực, các đốm trắng có kích thƣớc từ 0,5 đến 2 mm xuất hiện đầu tiên trên lớp
vỏ đầu ngực và ở đốt đuôi cuối cùng (Chou và ctv, 1995; Kou và ctv, 1998). (Hình
2.1A)
Tơm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tôm nhỏ (juvenile) và sắp trƣởng
thành (sub-adult)
b. Dấu hiệu bên trong
Tế bào tôm bị bệnh đốm trắng có hiên tƣợng trƣơng nhân (Chou và ctv, 1995).
Gan tụy trƣơng nhân có màu trắng vàng và trở nên dịn hơn
Dấu hiệu đặc trƣng về mơ bệnh học là sự xuất hiện của các thể vùi Crowdry
type A trong nhân trƣơng (Lightner, 1996) (Hình 2.1B)

Hình 2.1: Tơm bị bệnh đốm trắng (Vlak, 2005)
A: Các dấu hiệu lâm sàng (đỏ thân và xuất hiện đốm trắng)
B: Tế bào nhiễm đốm trắng bị trƣơng nhân
2.2.2. Virus đốm trắng
2.2.2.1.

Phân loại và tên gọi
Sự phân loại của WSSV thì khơng rõ ràng. Trong những năm đầu thì WSSV

đƣợc phân vào họ Baculoviradae, họ phụ là Nudibaculovirinae do hình thái và cấu
trúc genome của nó (Wang và ctv, 1995; Wongsteerasupaya và ctv, 1995). Tuy nhiên,
Footer Page 23 of 126.

Header Page 24 of 126.

12

sáu báo cáo trong Hội đồng phân loại học virus quốc tế (ICTV) đã phủ nhận họ phụ
này. Do WSSV khơng có quan hệ với nguồn gốc của Baculovirus đƣợc chứng minh
qua sự phân tích hệ thống phát sinh lồi, nên một nhóm nghiên cứu đã đề nghị là tạo ra
một họ mới, là Whispovirus (van Hulten, 2001)
Hiện nay, virus đốm trắng thuộc họ Nimaviridae, giống Whispovirus, tên gọi
là virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)
Hiện nay trên thế giới đã thống nhất tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng là
White Spot Syndrome Virus.
2.2.2.2.

Hình thái
Vỏ WSSV là những tiểu phần đối xứng, có hình ellipse hoặc hình que,

khơng tạo thể ẩn, đƣờng kính từ 120 – 150 nm, chiều dài từ 270 – 290 nm. WSSV có
một phần phụ giống nhƣ đi ở điểm cuối của vỏ. Một số loại nucleocapsid cá biệt có
đƣờng kính từ 65 – 70 nm, chiều dài từ 300 – 350 nm (Van Hulten và các ctv, 2001)

A

B

Hình 2.2 Hình thái của virus đốm trắng quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (Vlak, 2005)
(A): phần vỏ
(B): nuclocapsid
2.2.2.3.

Cấu trúc
Cấu trúc của virus đốm trắng gồm có 3 phần: màng bao (envelope),

nucleocapsid và vật chất di truyền
-

Màng bao: chứa hai loại protein là VP28 và VP19. VP28 nằm trên bề mặt của

vỏ virus và đóng vai trị chủ yếu trong q trình gây bệnh của virus đốm trắng (van
Hulten, và ctv, 2001)
-

Nucleocapsid đƣợc phân lập có những đƣờng chéo song song và kích thƣớc

khoảng 300 x 70 nm (Hình 2.3). Nucleocapsid đƣợc hình thành bởi số lƣợng lớn các
vịng (khoảng 14 trong tổng số) mà những vòng này đƣợc tạo ra từ những tiểu thể hình
cầu rỗng có đƣờng kính khoảng 8 nm, xếp thành hai hàng song song. Nucleocapsid
Footer Page 24 of 126.


Header Page 25 of 126.

13

chứa genome của virus và phần lớn là các protein mã hóa cho WSSV là VP664, VP26,
VP24, VP15 (Leu và ctv, 2005; van Hulten và ctv, 2002). VP664, một protein lớn
chứa 6.077 amino acid đƣợc mã hóa bởi một khung đọc mở (ORF) với 18.234
nucleotide và có trọng lƣợng phân tử 664 kDa, đƣợc xem là protein lõi, chịu trách
nhiệm tạo nên những sọc cho nucleocapsid (Leu và ctv, 2005). VP15, một protein
khơng có vùng kỵ nƣớc, là một protein giống histon, một protein gắn với DNA mạch

đôi (Witteveldt và ctv, 2005). Chức năng của VP26 và VP24 trên nucleocapsid vẫn
chƣa rõ. Hơn nữa, có khoảng 40 protein thứ yếu mã hóa cho WSSV đã đƣợc xác định
bằng cách giải trình tự protein của từng band sau khi phân tích virion WSSV bằng
SDS-PAGE (Leu và ctv, 2005; Tsai và ctv, 2004; van Hulten và ctv, 2002). Tùy vị trí
địa lý phân lập WSSV khác nhau mà khi xác định các đặc điểm thì chỉ có điểm tƣơng
tự nhƣng khơng tƣơng đồng về hình thái và proteome (Wang và ctv, 2000).

A

Hình 2.3: (A): Gel protein của WSSV đã đƣợc tinh sạch (1: marker, 2:
nucleocapsid và vỏ của WSSV đã đƣợc tinh sạch. (Lo và ctv, 2004).
(B): Mô hình virion của virus đốm trắng (Vlak và ctv, 2002)
Footer Page 25 of 126.