ENROFLOXACIN TRONG TÔM

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

MỤC LỤC

Trang

1.Đặc điểm nguyên liệu tôm................................................................................................3
1.1.Cấu tạo chung của tôm.................................................................................................3
1.2. Thành phần hoá học của tôm......................................................................................3
1.2.1. Protêin....................................................................................................................4
1.2.2. Nước.......................................................................................................................4
1.2.3.Vitamin và các chất khoáng....................................................................................4
1.2.4. Các sắc tố...............................................................................................................5
1.2.5. Các chất ngấm ra....................................................................................................5
2. Các hiện tượng hư hỏng thường gặp của tôm..................................................................5
2.1. Nguyên nhân cơ học...................................................................................................5
2.2. Nguyên nhân hoá học..................................................................................................5
3. Các sản phẩm tôm............................................................................................................6
4. Tìm hiểu về chất ENROFLOXACIN..............................................................................6
5. Nguyên nhân ENROFLOXACIN có trong nguyên liệu tôm.........................................8
6. Các phương pháp xác định ENROFLOXACIN..............................................................9
6.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Với Detetor huỳnh quang..............9
6.2 Phương Pháp Elisa....................................................................................................17
7. Cách tiến hành phân tích Enrofloxacin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)...............................................................................................................................18

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................24

GVHD:

Page 1

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

LỜI MỞ ĐẦU
Trong nền kinh tế quốc dân, thuỷ sản là ngành kinh tế kĩ thuật có vai trò quan trọng,
nguồn lợi thuỷ sản là tài nguyên sinh vật có khả năng tái tạo, có giá trị kinh tế xã hội và
có ý nghĩa khoa học đối với sự phát triển của đất nước.
Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn của Thái Bình Dương, có diện
tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km. Vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng
226.000km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km 2 với hơn 4.000 hòn đảo,
tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km 2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu
thuyền. Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh và phát
tán của nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới Ấn Độ - Thái Bình Dương với chừng
11.000 loài sinh vật đã được phát hiện.
Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt
động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng
trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm. Với chủ trương
thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát
triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm,
đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước.
Hằng năm xuất khẩu thuỷ sản đem lại nguồn ngoại tệ lớn cho đất nước. Trong đó tôm là
một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực góp phần không nhỏ vào tăng trưởng kinh
tế chung của đất nước. Nhưng trong những năm gần đây tình hình sử dụng kháng sinh
trong nuôi tôm đang tăng cao và diễn biến ngày càng phức tạp đặc biệt là kháng sinh
Enrofloxacin. Dư lượng kháng sinh trong tôm đang ngày càng đe doạ sức khoẻ của người
tiêu dùng và gây khó khăn cho việc xuất khẩu thuỷ sản ra nước ngoài. Hiểu được những
trăn trở đó nhóm chúng em quyết định chọn đề tài “ Tìm hiểu về kháng sinh cấm
Enrofloxacin trong tôm/ sản phẩm tôm”.

GVHD:

Page 2


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
1.Đặc điểm nguyên liệu tôm
1.1.Cấu tạo chung của tôm.
Tôm gồm hai phần, phần trước là đầu và ngực, phần sau là thân. Đầu tôm có cấu tạo
nguyên thủy, mắt có cuống, chân có đốt, có hai đôi râu xúc giác, phần đầu ngực được bao
bọc bằng giáp đầu ngực, ba đôi chân đầu tiên được biến hoá thành chân hàm dùng để đón
thức ăn, năm đôi chân ngực còn lại dùng để lam chân bò. Một số loài tôm chân trước
được biến thành kềm rất khoẻ.
Phần thân tôm gồm có bảy đốt, có bảy đôi chân phân thành hai nhánh, đốt cuối cùng
hợp với chân bơi tạo thành chân đuôi để tạo nên bánh lái trong quá trình di chuyển.
Tôm đất
Tôm sú
Tôm thẻ

Bảng 1.Thành phần khối lượng của một số loài tôm (theo%)
Loại tôm
Tôm sú
Tôm thẻ
Tôm chỉ
Tôm hùm

Thịt tôm
59.07
60.00
57.36

36.57

Đầu
31.04
31.00
31.55
52.02

Vỏ
8.09
9.00
1.09
8.39

1.2. Thành phần hoá học của tôm
Thành phần hoá học của tôm bao gồm prôtein, lipit, tro, nước, vitamin, men, muối vô
cơ, gluxit. Những thành phần tương đối nhiều là nước, prôtein và một số muối vô cơ.
Thành phần hoá học khác nhau tuỳ theo giống loài, trong cùng những hoàn cảnh sinh
sống khác nhau thì khác nhau. Ngoài ra chúng còn tuỳ theo trang thái sinh lý, đực cái,
mùa vụ, thời tiết… Sự khác nhau về thành phần hoá học của tôm và sự biến đổi của
chúng làm ảnh hưởng tới mùi vị, và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, đến việc bảo quản
tươi nguyên liệu...
Bảng 2: Hàm lượng các chất dinh dưỡng tính theo phần trăm trong thịt tôm tươi
Loại Tôm
GVHD:

Protein

Lipid
Page 3

Tro

Nước


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
Tôm He
Tôm Sú
Tôm Thẻ
Tôm Chì
Tôm Rảo
Tôm Sắc
Tôm Càng
Tôm Hùm

20.00
21.00
19.27
18.97
20.05
19.05
18.97
20.81

0.70
1.07
0.92
0.93
0.70

0.60
1.19
1.30

1.63
1.42
1.55
1.28
1.55
1.44
1.14
1.32

77.00
75.90
76.63
76.98
76.32
76.56
76.65
74.57

1.2.1. Protêin
Protêin là thành phần chủ yếu trong thịt tôm, nó chiếm từ 70 – 80 % tỷ lệ thịt theo chất
khô. Protêin trong tôm còn liên quan đến các chất hữu cơ, vô cơ khác tạo thành các chất
có đặc tính sinh học đặc trưng khác nhau.
Tuỳ theo loại tôm, mùa vụ, trạng thái sinh lý mà hàm lượng prot êin thay đổi trong
khoảng 18 – 23 %. Protêin trong tôm có thể chia làm hai nhóm sau:
- Chất cơ hoà tan ( tương cơ )
Bao gồm các chất sau: Actin, myozin, troponyozin và actomyozin. Chúng chiếm 70 -80

% hàm lượng protein, chúng có thể hoà tan trong các dung dịch muối trung tính và nồng
độ ion khá cao.
Myoabumin, globulin và các enzyme. Chúng hoà tan trong dung dịch muối trung tính
với nồng độ ion khá thấp, chúng chiếm từ 20 – 35 % protein.
- Chất cơ bản
Calogen, eslactin: Chiếm khoảng hơn 3% protein liên kết, trong đó có khoảng 2,5 %
protêin không hoàn thiện.
1.2.2. Nước
Trong tôm hàm lượng nước chiếm tương đối cao từ 70 – 85 %. Vì vậy làm cho thân
tôm mềm mại, hấp dẫn tăng tính cảm quan nhưng làm cho thân tôm mềm dể bị dập nát và
tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme và vi sinh vật phát triển.
1.2.3.Vitamin và các chất khoáng
Lượng Vitamin và chất khoáng của tôm đặc trưng theo loại và sau đó biến theo mùa.
Nhìn chung thịt tôm giàu Vitamin A, Vitamin B … Về mặt chất khoáng thì thịt tôm được
coi là nguồn quý về calcium và photpho nói riêng nhưng nó cũng là nguồn quý về đồng,
sắt.
Bảng 3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg%)
Ca

GVHD:

Photpho

Fe

Ne

Page 4

K

Mg

Cu


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

29-50

33-6.6

1.2-5.1

11-127

127-565

0.0421

331-

1.2.4. Các sắc tố
Tôm chứa nhiều sắc tố khác nhau nhưng chủ yếu là astoxanthin, là dẫn suất của
canđen. Trong thành phần vỏ tôm astaxanthin tham gia vào thành phần của lipoprotein
gọi là cianin. Ngoài ra trong tôm còn có phân ly được sắc tố tím, đen là tiền astaxanthin
và tetraxanthin.
1.2.5. Các chất ngấm ra
Các chất ngấm ra chủ yếu là các chất hoà tan chứa nitơ là các chất hoà tan trong nước,
phân tử lượng thấp, chứa nitơ với bản chất phiprotein. Khi ngâm thịt tôm vào nước ấm

một phần các chất này hoà tan (cùng với các chất hoà tan không chứa đạm) ta gọi là chất
ngấm ra. Hàm lượng chất ngấm ra chiếm khoảng 2 – 3 % thịt tôm tươi.
Lượng chất ngấm ra đứng về dinh dưỡng không lớn lắm nhưng đứng về mặt sinh lý, mùi
vị thì nó dóng vai trò rất quan trọng, bởi vì nó quyết định mùi vị đặc trưng cho sản phẩm.
Chất ngấm ra dễ bị vi sinh vật tác dụng gây thối rửa làm giảm khả năng bảo quản
nguyên liệu. Tốc độ phân huỷ các nguyên liệu nhanh hoặc chậm cũng do tính chất và số
lượng chất ngấm ra trong nguyên liệu quyết định. Nhóm phiprotein chứa khá nhiều các
acid amim tự do như: Albumine, lucein, acid alphatic, arinine, tyrosine, protêin.
2. Các hiện tượng hư hỏng thường gặp của tôm
2.1. Nguyên nhân cơ học:
Tôm bị hư hỏng cơ thịt: đứt đầu, dãn đốt, long đầu,…
Tác hại: không ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm, nhưng ảnh hưởng đến chất
lượng cảm quan của nguyên liệu và sản phẩm.
2.2.Nguyên nhân hóa học:
Hiện tượng biến đen:
Tôm sau khi đánh bắt vài giờ sẽ xuất hiện những chấm đen nếu không được bảo quản
tốt. Chấm đen xuất hiện gần mang, chân, đầu, khi mới bảo quản xuất hiện những chấm
màu nâu, sau đó chuyển sang những vết đen.
Tác hại: hiện tượng này không làm giảm chất lượng tôm nhưng làm cho cảm quan của
tôm bị giảm, ảnh hưởng xấu đến thành phẩm.
• Hiện tượng biến đỏ
Tôm khi bị biến đỏ: vỏ và thịt tôm có màu đỏ
Tác hại: làm giảm chất lượng, ngoại hình tôm thay đổi, thân tôm bị đỏ, đàu long ra khỏi
thân, vỏ tôm dễ bị tách ra khỏi thân thịt, xuất hiện mùi khai thối của tôm.
3. Các sản phẩm tôm
•

GVHD:

Page 5

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
1. HOSO ( còn đầu, còn vỏ):

2.
3.
4.
5.
6.

7.

Tôm còn nguyên hình dạng được làm sạch, xếp vào khuôn, rồi cấp đông. Tuy
nhiên, thực sự do hình thức chế biến này còn nguyên nội tạng tôm, phần này dễ
làm cho tôm phân hủy nhanh hơn nếu không được bảo quản kỹ lưỡng từ thu hoạch
cho đến đông.
HLSO: headless shell-on:
Tôm bỏ đầu nhưng vỏ và đuôi còn nguyên.
PD: peeled and deveined shrimp:
Tôm lột vỏ, lấy chỉ.
PUD:peeled undeveined shrimp
Tôm đã lột hết vỏ nhưng không rút chỉ
PTO: peeled tail-on
Tom lột vỏ chừa đuôi. Chừa lại đốt thứ 6 cuối cùng và gai nhọn, cánh đuôi
SUSHI
Tôm sushi chín là loại tôm hấp được chế biến theo quy cách của khách hàng Nhật
Bản. Tôm được cắt tia tạo hình và được đóng gói trên khay, hút chân không. Tôm
sushi là nguyên liệu để thành món ăn dân tộc là sushi tôm của người Nhật.
NOBASHI: nobashi Ebi

Tôm được chế biến theo quy cách của người Nhật. Nobashi trong tiếng Nhật có
nghĩa là bóp dãn ra, còn Ebi là tôm.

4. Tìm hiểu về chất ENROFLOXACIN
Enrofloxacin là chất kháng sinh có trong thuốc thú y nhập khẩu từ Trung Quốc để trị
bệnh nhiễm trùng cho gia súc, gia cầm. Trong thủy sản, Enrofloxacin được sử dụng để
kiểm soát môi trường và phòng trị bệnh cho tôm. Chất này nằm trong danh mục các hóa
chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất thủy sản.
Enrofloxacin là kháng sinh phổ rộng có khả năng kháng khuẩn tổng hợp, thuộc nhóm
kháng sinh Fluoroquinolone. Nó có khả năng hoạt động chống lại vi khuẩn Gram dương,
vi khuẩn Gram âm và Mycoplasma. Cơ chế hoạt động chủ yếu của các Quinilones là ức
chế DNA gyrase vi khuẩn, một loại enzyme chịu trách nhiệm kiểm soát quá trình cuộn
DNA của vi khuẩn trong quá trình sao chép. Resealing xoắn kép bị ức chế dẫn đến suy
thoái của các nhiễm sắc thể.
Fluoroquinolones cũng có hoạt tính chống lại các vi khuẩn bằng cách thay đổi tính
thấm của màng Phospholipid bên ngoài tế bào.
Công thức cấu tạo của Enrofloxacin:

GVHD:

Page 6


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

* Một số sản phẩm Enrofloxacin trên thị trường:

*Tác hại:
GVHD:

Page 7


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
Enrofloxacin là kháng sinh có độc tính cao chỉ được sử dụng với liều nhất định, được
quy định rất chặt chẽ và thuộc loại kháng sinh cấm sử dụng.
- Đối với người:
Khi ăn phải sản phẩm có chứa dư lượng Enrofloxacin từ 150-200g sản phẩm/ngày thì
lượng Enrofloxacin đưa vào cơ thể khoảng 2μg/ngày. Với lượng này sẽ không gây độc
tính ngay, nhưng nếu tích luỹ lâu dài hoặc ăn quá nhiều sẽ ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ.
Enrofloxacin phân bố đồng đều cả trong dịch nội bào và ngoại bào, phân bố hầu hết các
cơ quan như phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tuỷ...và qua được
hàng rào nhau thai. Nó được bài tiết chủ yếu qua đường tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt
chất và tái hấp thu thụ động ở thận.
- Đối với bản thân tôm:
Việc sử dụng mất kiểm soát kháng sinh trong nuôi tôm dẫn tới tình trạng kháng thuốc
ở vi khuẩn làm cho việc điều trị bệnh cho tôm sau này ngày càng khó khăn và sản phẩm
tôm không đảm bảo an toàn thực phẩm.
Việc lạm dụng kháng sinh sẽ làm cho tôm chậm tăng trưởng ảnh hưởng nghiêm trọng
đến kinh tế.
5. Nguyên nhân ENROFLOXACIN có trong nguyên liệu tôm.
- Người nuôi vẫn sử dụng Enrofloxacin tràn lang mặc nó đã bị liệt vào danh mục kháng
sinh cấm. Trước thời gian thu hoạch 28 ngày người dân vẫn sử dụng Enrofloxacin nên
tôm vẫn còn dư lượng kháng sinh. Nếu ngưng sử dụng Enrofloxacin ít nhất là 28 ngày
trước khi thu hoạch, thì trong con tôm sẽ không còn dư lượng chất này.
- Công tác kiểm tra, xử phạt đối với việc buôn bán Enrofloxacin của các cơ sở kinh doanh
thuốc thú y, thuỷ sản cũng như người sử dụng vẫn còn lỏng lẻo chưa triệt để.
- Bản thân các nhà máy chế biến cũng rất khó kiểm soát được dư lượng Enrofloxacin trên
tôm nguyên liệu đưa về nhà máy.
6. Các phương pháp xác định ENROFLOXACIN

Việc kiểm nghiệm dư lượng kháng sinh trong thực phẩm là vấn đề cấp thiết để đảm bảo
sức khỏe người tiêu dùng cũng như nhu cầu của xuất khẩu hàng hóa. Enrofloxacin (ENRa) là loại khán sinh được tổng hợp từ hơn mười năm trước, tuy nhiên lại không có quá
nhiều phương pháp phân tích nó.
Có hai phương pháp thường được dùng để phân tích Enrofloxacin:
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detetor huỳnh quang
- Phương pháp Elisa
6.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Với Detetor huỳnh quang
* Khái niệm:
GVHD:

Page 8


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát
triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách
trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia
dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang
đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày
càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định
lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ
sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm,
môi trường…
* Nội dung của phương pháp:
Yêu cầu của phương pháp là sử dụng hệ sắc ký gồm cột tách, pha dao động cho phù
hợp với chất phân tích, đạt hiệu quả tách cao, độ nhạy cao và chọn lọc, vì vậy nội dung
phương pháp bao gồm:
− Lựa chọn hệ sắc ký gồm cột tách , pha dao động và detetor.
− Tối ưu hóa vận hành cột gồm lựa chọn pha động và tốc độ rửa giải.

− Đánh giá phương pháp tách về cực tiểu phát hiện và định lượng, khoáng tuyến tính
của phép đo, độ chính xác, độ lặp lại.
* Phân loại:
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC
thành 4 loại:
•

Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).

•

Sắc ký phân bố (partition chromatography).

•

Sắc ký ion (ion chromatography).

•

Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

•

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích
được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp
chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).
SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và
pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký
pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại

này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các
hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.

GVHD:

Page 9


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha
động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân
cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp
cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân
cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ
được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT.
* Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất
mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
•

Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký
lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).

•

Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase
chromatography)
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm
hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:
o

Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất
mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân
tích.

o

Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không
thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn
các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.
Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý
(thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những
nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m 2 bề mặt):

Hình 1. Bề mặt silica đã thủy phân

GVHD:

Page 10


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan
để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo
nhóm R gắn vào.

Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m 2 bề mặt bị

silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl
người ta còn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác
khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân
cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS
(octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl,
phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy
các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng
nhiều nhất.

Hình 3: Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa phản
ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi
nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với
pha
GVHD:

tĩnh
Page 11

nữa.


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan (SiO2
thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và thời gian
lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như

trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác
với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác
với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB của hãng SUPELCO).

Hình 4. Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với
nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như
isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –
OH với chất cần phân tích.

Hình 5: Cấu trúc cột có gốc isopropyl
Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của
dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh
(cột EPS – Expended Polar Selectivity).
Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren

GVHD:

Page 12


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
(Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 – 13.
Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh.
* Pha động trong sắc ký pha đảo
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
•

Hòa tan mẫu phân tích.

•

Phù hợp với đầu dò.

•

Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

•

Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.

•

Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có
thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH),
acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi
được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.
Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index),
độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải
(eluent strength)…
Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi
sắc ký.

GVHD:

Page 13

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

Bảng 4: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số
dung lượng K’, độ chọn lọc α . Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết
quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung
môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động
phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính baz (nhận
proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm
với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một dung
môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong
pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong
tất cả các dung môi động của SKPĐ.
Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất
cột.

GVHD:

Page 14


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC
Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa
cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi
MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích

phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải
chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ
isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien
dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
* Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký
+ Hệ số phân bố
Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như
sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố
(partition coefficient) và được tính như sau:

GVHD:

Page 15


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
CM : nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.
+ Thời gian lưu:
tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.
tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là
thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết.
tR’ : thời gian lưu thật của một cấu tử.

Hình 7. Thời gian lưu của cấu tử phân tích

+Hệ số dung lượng k’
k’ được định nghĩa theo công thức sau:

Với VS : thể tích pha tĩnh
VM : thể tích pha động
Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.
Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng
lâu, mũi có khả năng bị tù.
Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp
nhận trong khoảng rộng 1-20.
+ Hiệu năng
Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của
các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được:
GVHD:

Page 16


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

Hay

Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)
W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)
+ Độ chọn lọc
Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.

+ Độ phân giải:
Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc

và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:

Hay

Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6).
6.2 Phương Pháp Elisa

GVHD:

Page 17


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Hay còn gọi là phương pháp ELISA
hay EIA là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét
nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y
học,nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản
phẩm sinh học.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và
gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được
gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có
thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT. Sự hiện
diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.Với nguyên lý trên,
ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên
cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông
thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).

- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của giếng
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc
hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra. KT đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo
phức hợp KT-KN có thể xảy ra.
Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ
chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp
(secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các
phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp
này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các KT không đặc hiệu, KT không gắn với
KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn
KT liên kết với KN được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của
enzyme liên kết với KT trong phức hợp KT-KN. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất)
sẽ xảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay
các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của
ELISA.
7. Cách tiến hành phân tích Enrofloxacin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)
* Thiết bị dụng cụ:
- Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.
GVHD:

Page 18


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

- Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID: 250 x 3mm, kí hiệu 100 – 5 C18 AB,
loại Nucleosil.
- Máy nghiền đồng thể, tốc độ 6000- 30 000 vòng/ phút ( KCH- 1000).

- Bể điều nhiệt hoạt động ở nhiệt độ 20- 1000C (GRANT Y14).
- Máy lắc, tốc độ 50- 500 vòng/ phút.( IKA KS 260 basic).
- Máy ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút ( Sigama 4K15).
- Máy rung trộn mẫu ( HW ASHN technoogy Co. 250VM).
- Bình khí Nitơ tinh khiết 99.999%
- Ống ly tâm thủy tinh dung tích 15,25 và 50ml.
- Pasteur pipet với quả bóp cao su.
- Pipet định mức 5 và 10ml.
- Bình định mức dung tích: 10; 20; 25; 100; 500 và 1000ml.
- Giấy lọc 0,45mm.
- Cốc có mỏ dung tích 250ml.
* Hóa chất:
Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích gồm:
Axetonitrile ( CH3CN) dùng cho HPLC.
Diclorometan (CH2Cl2) dùng cho HPLC.
Aceton dùng cho HPLC.
Nước cất dùng cho HPLC.
Acid phosphoride (H3PO4) đậm đặc dùng cho HPLC.
Dinatri hydro phosphat ( Na2HPO4).
Acid citric.
GVHD:

Page 19


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
Natri hydroxit ( NaOH).
Tác nhân tạo dẫn xuất luorescamin ( Fluram).
Chuẩn các chất nhóm fluoroquinolone
Chuẩn nội enrofloxacin

* Dung dịch thử và dung dịch chuẩn:
- Các dung dịch natri hydroxit.
+ Dung dịch natri hydroxit 10M: hòa tan 40g NaOH trong nước cất để có 100ml.
+ Dung dịch natri hydroxit 1M: hòa tan 4g NaOH trong nước cất để có 100ml.
+ Dung dịch natri hydroxit 0,1M: pha loãng 1ml dung dịch NaOH 1M trong nước cất
để có 10ml.
- Dung dịch acetonitril /H3PO4 pH= 6,0.
+ Cho 80ml acetonitril và 20ml H3PO4 0,02M vào cốc 250 ml. Dung dịch này được để
nguội tới nhiệt độ trong phòng. Dùng dung dịch natri hydroxit 1M hoặc dung dịch natri
hydroxit 0,1M chỉnh pH= 6,0; 0,1.
- Dung dịch đệm citrat 0,5M, pH= 3,0.
Hòa tan 10,5g axit citric với 100ml nước cất, chỉnh Ph= 3,0; 0,1 bằng dung dịch natri
hydroxit 10M, dung dịch natri hydroxit 1M và dung dịch natri hydroxit 0,1M.
- Dung dịch đệm cho sự tạo dẫn xuất: trộn theo thể tích gồm 6 phần acetonitril/ H 3PO4
Ph= 6,0 với 4 phần dung dịch đệm citrat 0,5M, pH=3,0.
- Dung dịch fluorescamin 10mg/ml: hòa tan 50mg tác nhân tạo dẫn xuất fluoroquinolone
trong 5ml aceton.
- Các chất thuộc nhóm fluoroquinolone.
+ Dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 1mg/ml: hòa tan 10mg chuẩn nội fluoroquinolone
trong 10ml metanol.
+ Dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 50mg/ml: hút 1ml fluoroquinolone 1mg/ml vào
bình định mức 20ml rồi định mức tới vạch bằng methanol.
+ Dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 5mg/ml: pha loãng 1ml fluoroquinolone 50mg/ml
với nước cất để có 10ml.
- Các dung dịch chuẩn.
+ Dung dịch chuẩn gốc các enrofloxacin 100mg/ml: cân lần lượt 10,0mg từng loại các
chất nhóm fluoroquinolone 100mg/ml. Sau đó, hòa tan rồi định mức đến vạch 100ml
bằng methanol.
+ Dung dịch chuẩn các trung gian fluoroquinolone 1000mg/ml: hút chính xác 1,0ml
dung dịch chuẩn gốc các fluoroquinolone 100mg/ml vào các bình định mức 100ml. Sau

đó, định mức đến vạch bằng methenol.
+ Các dung dịch chuẩn fluoroquinolone để đựng các đường chuẩn: 0; 1,0 ; 2,0; 4,0;
6,0; 8,0; và 10,0mg/ml.
GVHD:

Page 20


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
+ Hút lần lượt 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 dung dịch các fluoroquinolone
1000mg/ml vào bình định mức 500ml. Sau đó, định mức tới vạch bằng methenol.
- Pha động
+ Dung dịch H3PO4 0,02M: hòa tan 2,3g H3PO4 85% với nước cất rồi định mức thành
1000ml.
+ Hỗn hợp dung dịch methanol và acetonitril (tỷ lệ 1:1) hòa tan 500ml methanol trong
500ml acetonitril.
* Cách tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu thử:
+ Nghiền ít nhất 200g mẫu bằng máy nghiền đồng thể. Cân chính xác 5,0g mẫu đã
được nghiền ( kí hiêu W) cho vào ống ly tâm thủy tinh 25ml.
+ Thêm 10m acetonitril và 2,5ml diclorometan vào ống ly tâm thủy tinh 25ml có chứa
5,0g mẫu thử. Sau đó, lắc ống trong 10 phút trên máy lắc. Tiếp theo ly tâm trong 10 phút
ở tốc độ 6000 vòng/ phút.
+ Dùng pasteur pipet hút lớp trên vào bình định mức 25ml. Thực hiện lại bước chiết rồi
gom tất cả phần dịch chiết vào bình định mức 25ml, làm đầy tới vạch định mức bằng
acetonitril.
+ Hút chính xác 10ml dịch chiết cho vào ống nghiệm thủy tinh 15ml để bay hơi tới cặn
khô bằng dòng khí nitrogen ở nhiệt độ 500C trên bể điều nhiệt.
- Chuẩn bị mẫu trắng:
Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã được xác định không có enrofloxacin. Tiến hành chuẩn

bị mẫu trắng như chuẩn bị đối với mẫu thử.
- Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100g/g.
Thêm chính xác 500ml dung dịch các chuẩn fluoroquinolone trung gian 1000mg/ml
vào 5g mẫu trắng. Tiến hành chuấn bị mẫu xác đinh độ thu hồi 100mg/g như chuẩn bị đối
với mẫu thử.
- Chuẩn bị dung dịch đường chuẩn:
Hút chính xác 10ml lần lượt các dung dịch chuẩn fluoroquinolone để dựng các đường
chuẩn vào ống nghiệm thủy tinh 15ml. Sau đó, cho dung dịch bay hơi tới cặn khô dưới
dòng khí nitrogen ở nhiệt độ 500c trên bể điều nhiệt. Tiếp tục thực hiện bước tạo dẫn xuất
huỳnh quang.
- Tạo dẫn xuất huỳnh quang:
Thêm vào các ống nghiệm chứa mẫu đã chuẩn bị các dung dịch gồm: 1ml dung dịch
thêm tạo dẫn xuất, 20ml dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 5mg/ml và 0,2ml dung dịch
fluoroquinolone 10mg/ml. Sau đó, để cho phản ứng khoảng 30- 50 phút ở nhiệt độ trong
phòng.
- Tiến hành phân tích trên HPLC:
GVHD:

Page 21


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
+ Điều kiện phân tích.
Cột sắc ký: cột Nucleosil 250 x 3mm 100-5 C18 AB.
Chương trình pha động.

Thời gian

Dung dịch H3PO4 0,02M

Bắt đầu
20p
25p
39p
40p
50p
51p
58p

60
60
50
50
45
45
60
60

Hỗn hợp dung dịch
methanol và acetonotri ( tỷ
lệ 1:1)
40
40
50
50
55
55
40
40

Tốc độ dòng: 0,6ml/ phút.
Thể tích tiêm: 10ml.
Bước sóng kích thích: l= 405nm.
Bước sóng phát xạ: l= 495nm.
+ Ổn định cột sắc ký trong 30 phút tại chế độ làm việc.
+ Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang. Dựng đường chuẩn
giữa tỷ số diện tích peak các chuẩn sulfonmite/ diện tích peak chuẩn nội enrofloxacin và
nồng độ theo quan hệ tuyến tính bậc nhất ( phương trình y= ax+ b).
+ Tiêm các dịch mẫu trắng, dịch mẫu xác định độ thu hồi và dịch mẫu thử đã tạo dẫn
xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC, mỗi mẫu 2 lần. Xác định trị số diện tích peak
sulfnamit/ sulfanilamit.
- Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích:
+ Độ lặp lại của 2 lần tiêm: độ lệch chuẩn ( CVS) tính theo diện tích peak sắc ký của 2
lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%.
+ Độ thu hồi (R) : Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải nằm trong
khoảng 60- 70%.
- Tính kết quả:
Hàm lượng enrofloxacin có trong mẫu được tính theo công thức sau:
M( mg/kg)= C(X).V/W
Trong đó:
M là hàm lượng enrofloxacin có trong mẫu, tính theo mg/kg.
C là nồng độ của enrofloxacin thu được, tính theo mg/ml.
V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính theo ml.
GVHD:

Page 22


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
W là khối lượng mẫu thử.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
GVHD:

Page 23


KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
[1]. Lâm Thế Hải, Nguyễn Thị Ngọc Hoài (2013), Bài giảng Nguyên liệu thuỷ sản và
công nghệ sau thu hoạch, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại học Công Nghiệp Thực phẩm
TP.HCM
[2]. />[3]. />[4]. />[5] />
GVHD:

Page 24