Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩmngày

Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

MỤC LỤC


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

LỜI NÓI ĐẦU
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình
sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan
trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân
tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường.
Nghiên cứu, sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme được phát triển
mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến này. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại
những lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước, Việt Nam là một trong nhiều nước
có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme, Tuy nhiên, nền công nghiệp
của nước ta chưa thực sự phát triển.
Ngành công nghệ enzyme có mối liên hệ chặc chẻ với các ngành
nghề khác, do vậy để thúc đẩy sự phát triển của các ngành khác, thì ngành
công nghệ enzyme nói riêng và các ngành khác thuộc lĩnh vực Công nghệ
sinh học phải đi trước một bước, việc sản xuất và đưa vào sử dụng các sản
phẩm sinh học trong nước thay thế dần nguồn hàng ngoại nhập sẽ cải thiện
đáng kể khả năng cạnh tranh của hàng hóa trong nước trước xu thế hội
nhập toàn cầu như hiện nay.
Lý do tôi chọn đề tài sản xuất enzyme protease cho khóa luận tốt
nghiệp của mình cũng xuất phát từ những quan điểm trên, việc hiểu rõ về
các quá trình trong việc xây dựng nhà máy trên mặt lý thuyết sẽ giúp chúng
ta có thể nắm bắt nhanh công nghệ vào sản xuất khi tham gia vào xây dựng
nhà máy thực tế.!

Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

CHƯƠNG 1. LẬP LUẬN KINH TẾ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Nhằm đón đầu các nguồn đầu tư từ Quốc tế vào khu vực miền trung
– Tây Nguyên, và nhằm mục đích thực hiện chiến lược đưa khu vực kinh tế
Miền trung – Tây Nguyên thành khu vực kinh tế trọng điểm Quốc gia, việc
lựa chọn vị trí và hình thành các khu công nghiệp gắn liền với các thuận lợi
về mặt địa lý, nguồn nguyên liệu, nguồn nhân lực tại địa phương là một
chiến lược hiệu quả để triển khai các mục tiêu như đã đề cập.
Và thực tế trong vòng 10 năm qua khu vực Miền trung – Tây Nguyên
đã hình thành nhiều khu công nghiệp lớn, giúp giải quyết hàng ngàn công
việc cho nhân dân, góp phần to lớn trong việc phát triển kinh tế tại địa
phương. Thực tế cho thấy sự phát triển vượt bậc của thành phố Đà Nẵng
như ngày hôm nay chính là nhờ những cố gắn trong việc đón đầu những
nguồn đầu tư từ các Dự án Quốc tế vào Đà Nẵng.
Trên đà của sự thành công đó, Đà Nẵng tiếp tục đề ra các kế hoạch phát
triển mới cho tương lai với trọng tâm lấy sự phát triển của ngành Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thông tin làm mũi nhọn để tăng tốc sự phát
triển của nền kinh tế không chỉ của Đà Nẵng mà cho toàn bộ khu vực Miền
Trung – Tây Nguyên.
Từ khi xuất hiện các khu công nghiệp về thực phẩm, dược phẩm,
thủy hải sản… trên địa bàn Đà Nẵng và các khu vực liên kết với Đà Nẵng,
nhận thấy một nhu cầu rất lớn về nguồn enzyme cho các quá trình sản xuất
của các nhà máy, xí nghiệp, trong đó đáng kể nhất là nhu cầu về enzyme
Protease trong ngành chế biến thực phẩm, dược phẩm và chế biến thủy
sản. Cùng với những thuận lợi sẽ đề cập chi tiết ở các mục tiếp theo. Tôi
quyết định đề xuất xây dựng nhà máy sản xuất enzyme protease kỹ thuật từ
vi khuẩn Bacillus subtilis, theo phương pháp lên men chìm năng suất 1000
kg sản phẩm/ca, đặt tại khu công nghiệp Hòa Cầm.

1.2. Vị trí xây dựng
Việc chọn Đà Nẵng làm địa điểm xây dựng nhà máy có nhiều thuận
lợi đối với quá trình sản xuất của nhà máy, trong đó các yếu tố tác động tích
cực đến quá trình xây dựng nhà máy bao gồm: đặc điểm tự nhiên, giao
thông vận tải, nguồn nguyên liệu, các vấn đề điện nước, xử lý nước thải và
đặc biệt là vấn đề tiêu thụ và nguồn nhân lực của Đà Nẵng.
Khu công nghiệp Hoà Cầm có vị trí địa lý nằm về phía Tây Nam
Thành phố Đà Nẵng, giáp đường Quốc lộ 14B thuộc trục hành lang kinh tế


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Đông Tây. Là khu công nghiệp có vị trí thuận lợi nhất trong 5 khu công
nghiệp tại Đà Nẵng.
1.2.1. Đặc điểm tự nhiên
Khí hậu Đà Nẵng chia ra làm hai mùa, mùa nắng từ tháng 1 đến
tháng 8, mùa mưa từ tháng 9 đến tháng 12, nhiệt độ trung bình khoảng
280C, độ ẩm tương đối trung bình 28%, hướng gió chủ yếu là Đông Nam.
Với điều kiện tự nhiên, khí hậu như vậy việc xây dựng nhà máy sản xuất
enzyme protease nói tên là hoàn toàn có cơ sở. Hơn thế nữa điều kiện đất
đai, khi hậu của các vùng lân cận, Đà Nẵng thuận lợi cho việc trồng các loại
cây giàu tinh bột như: lúa, ngô, khoai, sắn…
Khu công nghiệp Hòa Cầm nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, chia hai
mùa rõ rệt: mùa mưa và mùa khô. Mùa mưa thường kéo dài từ tháng 8 đến
tháng 12, mùa khô kéo dài từ tháng 1 đến tháng 7.
Nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng 25,9°C; cao nhất các tháng
6,7,8, trung bình 28 - 30°C; thấp nhất vào các tháng 12,1,2, trung bình 18 23°C; bão thường đổ bộ trực tiếp vào thành phố các tháng 9, 10 hàng năm.
Độ ẩm không khí trung bình là 83,4%; cao nhất vào các tháng 10,11,
trung bình 85,67 - 87,67%; thấp nhất vào các tháng 6,7, trung bình từ 76,67
- 77,33%.

Lượng mưa trung bình hàng năm 2504,57 mm; lượng mưa cao nhất
vào các tháng 10,11, trung bình từ 550 - 1000 mm/tháng; thấp nhất vào các
tháng 1,2,3,4, trung bình từ 23 – 40 mm/tháng.
Số giờ nắng bình quân trong năm là 2156,2 giờ, nhiều nhất vào các
tháng 5,6, trung bình từ 234 - 277 giờ/tháng; ít nhất là vào các tháng 11,12,
trung bình từ 69 - 165 giờ/tháng [1]
1.2.2. Giao thông vận tải
Đà Nẵng nằm ở Trung độ của nước Việt Nam, trên trục giao thông
Bắc - Nam về đường bộ, đường sắt, đường biển và đường hàng không,
trung tâm thành phố cách Thủ đô Hà Nội 764km về phía Bắc, cách thành
phố Hồ Chí Minh 964 km về phía Nam.
Ngoài ra, Đà Nẵng là đầu mối giao thông nối với vùng Châu Á - Thái
Bình Dương và Thế giới, là một trong những cửa ngõ quan trọng ra biển
của Tây Nguyên và các nước Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanma đến các
nước vùng Đông Bắc Á thông qua Hành lang kinh tế Đông Tây với điểm kết
thúc là Cảng biển Tiên Sa. Các trung tâm kinh doanh - thương mại quan


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

-

trọng của các nước trong vùng Đông Nam Á và Thái Bình Dương đều nằm
trong phạm vi bán kính 2.000 km từ thành phố Đà Nẵng.
Cự ly từ Khu công nghiệp đến các công trình hạ tầng quan trọng của
Thành phố Đà Nẵng như sau:
Cách trung tâm thành phố Đà Nẵng:
08 km
Cách cảng Tiên Sa:
18 km

Cách cảng Sông Hàn:
08 km
Cách cảng Liên Chiểu:
07 km
Cách Sân bay Quốc tế Đà Nẵng:
05 km
Cách Ga Đà Nẵng:
07 km
Cách Bến xe Trung tâm Đà Nẵng:
05 km
Cách đường Quốc lộ 1A:
01 km
Cách đường lộ Bắc – Nam tránh TP Đà Nẵng:
01 km
Đặc biệt tuyến đường cao tốc Liên Chiểu - Dung Quất chạy ngang
qua giữa Khu công nghiệp có mặt cắt 60m [1].

Hình 1. Vị trí khu công nghiệp Hòa Cầm trên bản đồ thành phố Đà
Nẵng
1.2.3. Nguồn nguyên liệu
Dù không được xếp vào khu vực có nền nông nghiệp phát triển là
điều kiện để sản xuất các sản phẩm về enzyme, nhưng Đà Nẵng lại là khu
vực giáp với nhiều vùng nông nghiệp phát triển như Quảng Nam, Huế.
Đặc biệt Đà Nẵng là nơi tập trung rất nhiều nhà máy chế biến thực
phẩm từ nguồn nguyên liệu nông nghiệp như các nhà máy sữa bắp, các
nhà máy bia, cồn… Bên cạnh đó sự tập trung của nhiều cơ sở chế biến các


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

sản phẩm thủy sản cũng có ý nghĩa thuận lợi đối với dây chuyền sản xuất
enzyme protease.
1.2.4. Điện – Nước – Xử lý nước thải
Nhà máy dự định sẽ đặc tại khu công nghiệp Hòa Cầm với cơ sở hạ
tần đã hoàn thiện. Nguồn cung cấp điện và nước sạch cho sản xuất sẽ
được lấy từ hệ thống cung cấp của khu công nghiệp kết hợp với quá trình
xử lý khi tiếp nhận tại nhà máy.
Toàn bộ nước thải của nhà máy sẽ được thu gom và xử lý sơ bộ đáp
ứng yêu cầu về tiêu chuẩn đầu ra theo quy định của Khu công nghiệp Hòa
Cầm trước khi thải ra khu xử lý nước thải tập trung của khu công nghiệp
Hòa Cầm. Tại trạm xử lý nước thải của KCN có công suất 4000 m3/ca.
Nước thải sẽ được xử lý đạt tiêu chuẩn TCVN 5945 – 2005 trước khi cho
thải ra hệ thống thoát nước chung của khu vực [1].
Như vậy vấn đề Điện - Nước – Xử lý nước thải rất thuận lợi khi xây
dựng nhà máy tại khu công nghiệp Hòa Cầm.
1.2.5. Nhân lực
Về nguồn nhân lực: Đà Nẵng là nơi tập trung của các cơ sở đào tạo,
các trường đại học và các viện trung tâm có liên quan đến ngành Công
nghệ sinh học, với yếu tố là nguồn nhân lực trẻ, năng động, dồi dào và có
kiến thức sâu trong lĩnh vực enzyme, đó chính là sự thuận lợi đáp ứng cho
sự vận hành sản xuất của nhà máy.
1.2.6. Tiêu thụ
Vấn đề tiêu thụ là một trong hai vấn đề quan trọng nhất khi quyết định
xây dựng nhà máy, nguồn nguyên liệu bền vững và đầu ra thuận lợi sẽ giúp
nhà máy làm việc hiệu quả với năng suất thiết kế, đảm bảo việc làm cho
người lao động và doanh thu của nhà máy.
Nhà máy sản xuất enzyme protease được xây dựng tại cụm các Khu
công nghiệp tại Đà Nẵng, với nhiều nhà máy sản xuất và chế biến thực
phẩm, các xí nghiệp thủy hải sản, các nhà máy dệt,… cho thấy tìm năng
tiêu thụ sản phẩm là rất lớn.

Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về enzyme protease
2.1.1. Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme xúc tác thủy phân các liên kết peptide (-CO-NH-) n
trong phân tử protein tạo thành các peptide ngắn và cuối cùng tạo ra acid
amin và NH3.

Hình 2.: Cấu trúc không gian và trung tâm hoạt động của enzyme
protease
Protease là một nhóm enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
như: Nông nghiệp, công nghệ Thực phẩm, trong y học, trong công nghệ
gen và bảo vệ môi trường. Trong những năm gần đây, giá trị thương mại
của các enzyme công nghiệp trê toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong
đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (trên 75%), và protease là một trong
ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (trên 60%).
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng
từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên
nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ,
dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực
vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ
protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất
giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách
ra dưới dạng tinh thể đồng nhất [2].
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi
sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để
và đa dạng [2].

Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

2.1.2. Phân loại nhóm enzyme protease.
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Hình 2.: Sơ đồ phân loại protease
Hệ enzyme protease được phân chia thành hai nhóm enzyme:
endopeptidase và exopeptidase.
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được
phân chia thành hai phân nhóm:
Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu nhóm nitơ
amin (-NH2) tự do của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid
một dipeptide hoặc một tripeptide.
Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu carbon
của mạch polypepide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia
thành bốn phân nhóm:


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm (-OH) của gốc
serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với
hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ:
chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động
vật như: chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại
enzyme vi khuẩn như subtilisin carslberg, subtilisin BPN. Các serine
proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc

hiệu cơ chất tương đối rộng.
Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm (-SH) trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như
papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các
cysteine proteinase thường hoạt động ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ
chất rộng.
Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong
trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bật cao hơn. Các
metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm
mạnh dưới tác dụng của EDTA [7].
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba
nhóm:
Protease acid: hoạt động ở pH từ 2 đến 4, có nhiều ở tế bào động vât,
nấm men, nhưng ít thấy ở vi khuẩn
Protease trung tính: hoạt động ở pH từ 7 đến 8, như papain từ đu đủ,
bromelaine từ dứa.
Protease kiềm: hoạt động ở pH từ 9 đến 11
2.1.3. Tình hình nghiên cứu enzyme protease
2.1.3.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trên thế giới
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu
sớm hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là
protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã
tách được pepxin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các
enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về
các protease trong máu.

Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz
được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật. Đến nay người ta
đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease
như: papain, tripxin, kimotripxin, subtilizin…
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ
năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả
năng phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình
nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các protease
của động và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã
góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng
enzyme trong thực tế.
Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt protease động vật,
thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các
nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về protease vi sinh vật và
đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này protease từ vi sinh vật chiếm
tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới. Hiện nay, số lượng các
enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất
là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản
xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600
tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500
tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất
và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ,
Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích
đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng protease từ vi sinh
vật. Chính vì thế nhịp độ sản xuất protease ở quy mô công nghiệp tại các
nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5%- 10%. Ngày nay người ta có
thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có

thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc ứng dụng protease ngày
càng gia tăng [3].
2.1.3.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước
Hiểu được vai trò và tiềm năng của ngành công nghệ enzyme mang
lại, trong số đó là bộ ba enzyme quan trọng: hệ enzyme amylase, hệ
enzyme protease và enzyme cellulose, trong nước ta những năm gần đây
đã có nhiều công trình nghiên cứu với những ứng dụng thực tiễn đối với
nền kinh tế trong nước, đó là những nghiên cứu cải thiện chất lượng thức
ăn chăn nuôi, các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong lĩnh vực thực phẩm,


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

y học… Có thể kể đến một số công trình tiêu biểu của các nhà khoa học
trong nước như sau:
Trần Quốc Hiền, Lê Căn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu
hoạch, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa,
Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu và thu nhận chế phẩm
protease từ ruột các Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006.
Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme protease từ
ruột cá Basa. Dịch chiết protease kiềm thu được có hoạt tính cao nhất là
15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chết: Tỷ lệ mẫu/dung
môi 1:1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút [4].
Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Tồn, Phạm
Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH tự nhiên, ĐH Quốc gia TP
Hồ Chí Minh, đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm các Serine
protease từ Trùn Quế” (2007), Bước đầu khảo sát hệ enzyme protease từ
trùn quế (Perionyx excavalus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch
chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium
sulfat nồng độ trong khoảng 30% - 80% bão hòa. Nhiệt độ và pH tối ưu cho

enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 55 0C và pH trong khoảng kiềm
từ 10 đến 12 [5].
Nguyễn Châu Sang, Nguyễn Thị Hà, Trường Đại Học Cần Thơ đã
nghiên cứu “Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của protease chịu kiềm
từ Bacillus sp.sv1” Các tác giả đã tinh sạch bằng phương pháp tủa
ammonium sulfate bão hòa ở nồng độ 60%, kết hợp sắc ký trao đổi ion
dương SP-streamline và sắc ký trao đổi ion âm Unosphere Q với đệm
phosphate pH 7,8. Bằng kỹ thuật SDS-PAGE và điện di nhuộm hoạt tính với
cơ chất casein, protease được xác định là một đơn phân có khối lượng
phân tử khoảng 19,2 kDa. Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH và
nhiệt độ lên hoạt tính cho thấy protease này hoạt động ở pH tối ưu 9,0 và
nhiệt độ tối ưu 450C, và sự có mặt của 2,5mM ion Ca2+ làm tăng hoạt tính
protease gấp 2 lần [6].
2.1.4 Ứng dụng của enzyme protease
Enzyme protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong
một số ngành sản xuất như:
Trong công nghiệp sữa:


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ
sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A.candidus, P.roquerti,
B.mesentericus… được dùng trong sản xuất phomat.
Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy…
Protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo
độ xốp và nở tốt hơn.
Trong công nghiệp chế biến thịt:
Protease được dùng để làm mềm thịt nhờ sự phân hủy một phần
protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị

ngon hơn.
Trong chế biến thủy sản:
Khi sản xuất nước mắm (và một số loại mắm) thường thời gian chế
biến kéo dài, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thuộc vào phương pháp
gài nén và nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngày
càng hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vât (bromelain và
papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian sản xuất và cải thiện hương vị
của nước mắm.
Trong sản xuất bia:
Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc gia tăng độ bền
của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A.oryzae được dùng để thủy
phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Trong công nghiệp thuộc da:
Protease được sử dụng để làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần
protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng.
Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất
định. Hiện việc đưa các protease từ vi khuẩn (B. mensentericus, B. subtilis),
nấm mốc (A. oryzae, A. flavous) và xạ khuẩn (S. fradiae, S.griseus, S.
rimosus…) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần
chiếm một vị trí quan trọng.
Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác
như:
Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, tăng vị trong thực
phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với enzyme amylase tạo
thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý
nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Điều chế môi trường dinh dưỡng tron sản xuất vaccine, kháng sinh…
Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt các chất bẩn
protein, sản xuất mỹ phẩm….[21]
2.1.5. Nguồn thu nhận enzyme protease
2.1.5.1. Nguồn thu từ thực vật
Thực vật có nguồn enzyme protease đã được loài người hiểu biết và
ứng dụng rất lâu. Cho đến nay, người ta đã thu nhận enzyme protease từ
thực vật để ứng dụng vào các ngành sản xuất khác nhau, các enzyme thu
nhận từ thực vật với số lượng lớn bao gồm: bromelin, papain, ficin.

Hìnhgọi
2.: Dứa
và đu đủ,
protease
thực vậtthực vật chứa nhóm
Bromelin là tên
chung
chonguồn
nhóm
enzyme
sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ
Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái). Bromelin có vai trò trong
y học nên được nghiên cứu rất nhiều, Bromelin là enzyme thủy phân
protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật. Một trong những lợi ích
của nó được chú ý đến là một chất giúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động ở môi
trường acid trong dạ dày và cả môi trường kiềm ở rụôt non. Bromelin có thể
thay thế cho cả những enzyme tiêu hóa khác như pepsin,và trypsin.
Bromelin có tác dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm
thấp khớp, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelin như một chất làm

giảm đau, kháng viêm và kháng sưng.
Được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzyme
thủy phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất
và cơ chế hoạt động, Papain là một sulfhydryl protease, đầu tiên được tách
ra bởi Bals và cộng sự của ông [7].
Ficin (ficain) là một protease được tìm thấy trong nhựa của cây thuộc
họ Ficus (sung vả), thuộc họ Moraceae, bộ Urticales. Ficin là một loại
protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulfhydryl ( -SH ).


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và
bromelin [7].
2.1.5.2 Nguồn thu từ động vật
Enzyme từ nguồn động vật được loài người hiểu biết và sử dụng
trong chế biến sữa từ rất lâu. Người ta chỉ sử dụng động vật để thu nhận
protease. Hai enzyme protease acid quan trọng ở động vật có nhiều ứng
dụng và được quan tâm là pepsin và rennin đặc biệt về khả năng đông tụ
sữa. Hai enzyme này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê,
bò…) [7].
Pepsin là một enzyme quan trọng của tuyến tiêu hóa động vật, thuộc
nhóm enzyme thủy phân, pepsin có khả năng phân cắc các liên kết peptide
của protein. Pepsin tác động lên hầu hết các protein tự nhiên và có khả
năng phân cắt tới 30% liên kết peptide có trong phân tử protein tạo thành
chủ yếu các peptide chứa từ 5 – 8 amino acid.
Renin được định nghĩa là enzyme đông tụ sữa, được tìm thấy ở dịch
tiêu hóa của ngăn thứ tư dạ dày bê. Nó được khám phá bởi Heinz, năm
1951. Renin là một protease acid, là thành phần chủ yếu của rennet chiết
rút từ ngăn thứ tư của dạ dày bê dưới 5 tháng tuổi, càng gần 5 tháng tuổi,

thành phần rennin trong rennet càng giảm đi. Nó là enzyme chuyên gây
đông tụ sữa nên người ta còn gọi tên là enzyme đông tụ sữa điển hình [7].
2.1.5.3. Nguồn thu từ vi sinh vật
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme
này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số
protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng
rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học.
Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease được trình bày ở
bảng sau [7]:


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Bảng 2.: Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease
Vi sinh vật
Vi khuẩn

Xạ khuẩn

Nấm mốc

Bac. subtilispha
Bac. cireulans
Bac. sphaericus
Bac. thermophilus
Bac. aerothermophilus
Bac. thermoacidurans
Bac. thermoproteoly ticus
Bac. brevis
Bac. licheniformis

Bac. mesenlericus
Bac. megaterium
Bac. cereus
Bac. pumilus
Cl. perfringens
Cl. hisolyticum
Cl. sporogens
Ps. Aeruginosa
Str. griseus
Str. rimosus
Str. fradiae
Str. faecalis
Str. reetus var. pro-teolyticus
Asp. Oryzae
Asp. satoi
Asp. awamori
Asp. niegr
Asp. shirousami
Asp. fumigatus
Asp. tericola
Asp. candidus
Asp. ochraceus
Asp. sojae
Asp. flavus
Pen. janthinellum
Pen. chrysogenum
Pen. cyaneo fulvum
Mucor. pusitus
Rh. chinensis
Rh. delemar

Rh. niveus
Rh. nodous
Rh. pseudokinensis
Rh. peka
Phymatorrichum omnivorum

Ghi chú
Protease trung tính, protease kiềm (subtilizin)

Protease kiềm
Protease trung tính
Protease trung tính, protease acid
Protease acid và protease kiềm
Colagenase
Colagenase
Protease trung tính, protease kiềm
Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, Mỹ, gồm ít nhất là 11
enzyme với cơ chất procolagen phân giải 70% đến
amino acid có 5 protease, hai peptidase
(loxinamino- peptidase, cacboxypepridase), hai
protease: protease-serin.
Protease-kim loại, protease serin, có na loại
protease acid, protease trung tính, protease kiềm.
Protease acid (aspergilopepti-dase A)
Protease acid
Hai protease acid
Protease acid
Hai protease: protease acid và protease kiềm
Protease acid có tác dụng làm đông sữa
Protease trung tính

Protease kiềm
Hai protease: protease kiềm và protease trung
tính.
Protease acid
Protease kiềm
Protease acid có tác dụng làm đông sữa đã dùng ở
Nhật để thay cho rennin


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp chủ yếu dựa vào vi sinh
vật. Như vậy, vi sinh vật đóng vai trò quyết định đến hình thái sản xuất
enzyme hiện nay.


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

A

C

B

D
A. Streptococcus Faecalis; B. Bacillus pumilus
C. Aspergillus oryzae; D. Bacillus subtilis
Hình 2.: Một số nguồn thu enzyme protease từ vi sinh vật

Các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease là Bacillus subtilis,

Bacillus mensentericus, Bacillus thermorpoteoliticus và một số giống thuộc
chi Clostridium. Trong đó B.subtilis S5 có khả năng tổng hợp Protease
mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp protease ở vùng pH trung tính
và kiềm [23].
So với động vật và thực vật, vi sinh vật có rất nhiều ưu điểm, Những
ưu điểm đó được tóm tắc như sau:
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh
Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao
Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô
công nghiệp:
Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp
enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài.
Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể
đưa vào quy mô công nghiệp được


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Nguồn nguyên liệu dùn sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ
tiền và
dễ kiếm:
Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm giảm
giá thành sản phẩm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới.
Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác
nhau
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.2.1. Lịch sử phát triển
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do
Christion Erenberg và tên Metallo proteinase của loài vi khuẩn này lúc bấy
giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi

khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài
trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis.
Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng
bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 - 1957, Henry
và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây,
Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó,
thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng
phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn
đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…
Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với
nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý
môi trường [8]
2.2.2. Đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
-

Bộ
Họ
Giống
Loài

: Eubacteriales
: Bacillaceae
: Bacillus
: Bacillus subtilis

2.2.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram
(+), có kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,5 - 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi

khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ
hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8µm. Bào tử phát


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả
năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng
xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm.
Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis
trong 200 - 300 năm.

Hình 2.: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi
2.2.5. Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn Bacillus subtilis có một số đặc điểm sinh hóa như sau:
Vi khuẩn Bacillus subtilis lên men không sinh khí với các loại đường
như: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose.
Khi thử nghiệm các phản ứng sinh hóa, vi khuẩn Bacillus subtilis cho
phản ứng indol âm tính, phản ứng MR-VP dương tính, nitrate dương tính,
sinh khí NH3 và không sinh H2S, cho phản ứng catalase dương tính,
amylase dương tính, casein dương tính, citrate dương tính, có khả năng di
động và là vi khuẩn hiếu khí.
Bảng 2.: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hóa
Hoạt tính catalase
Sinh indol
Phản ứng MR-VP
Sử dụng citrate
Khử nitrate
Tan chảy gelatin

Di động
Phân giải tinh bột
Arabinose
Xylose
Saccharose

Kết quả
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Mannitol
Glucose
Lactose
Maltose

+
+
+
(Theo Holf 1992, trích Lý Kim Hữu 2005)

2.2.6. Hệ enzyme của Bacillus subtilis
2.2.6.1. Các enzyme nội bào Bacillus subtilis
Trong tế bào Bacillus subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có
những enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh
tổng hợp và nằm trong sinh khối tế bào. Các enzyme này thường không có
khả năng di chuyển qua màng tế bào. Đó là những enzyme nội bào.
Vậy, enzyme nội bào (endoenzyme) là những enzyme được vi sinh
vật tổng hợp trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham gia vào quá trình
phân giải (dị hóa) các hợp chất hữu cơ có phân tử lượng thấp hay sinh tổng
hợp các vật chất trong tế bào của chúng.
Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis: các enzyme thủy phân như
protease nội bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin
amidase, catalase, amylase nội bào…; các enzyme tổng hợp như
aspagagin-syntetase; các enzyme tham gia các quá trình oxy hóa - khử như
dehydrogenase, oxydase, cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia
chuyển hóa vật chất có trong tế bào [8].
2.2.6.2. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho
quá trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường:
amylase (α-amylase), β-glucanase, xylanase, protease…[8].
Bảng 2.: Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc
tính và phản ứng thủy phân
Enzyme

α-amylase

βglucanase

Nhiệt độ

tối ưu
(oC)
70 - 80

pH tối ưu

Phản ứng thủy phân

5,6 - 6,2

35 - 55

6,0 - 7,0

Thủy phân liên kết α-1,4-glucoside
trong
tinh
bột
và
những
polysaccharide khác tạo ra các
dextrin và oligosaccharide
Thủy phân liên kết β-1,6-glucoside
của β-glucan tạo ra những chất có
phân tử lượng thấp.


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

Xylanase

25

5,0

Protease

40

6,2 - 7,4

Thủy phân liên kết xylan - một
thành phần của hemicellulose.
Thủy phân liên kết peptide và
protein và các polypeptide, tạo ra
các peptide có phân tử lượng thấp
hơn và các amino acid.

2.2.7. Nghiên cứu và ứng dụng enzyme ngoại bào của Bacillus
subtilis
2.2.7.1. Trong công nghệ chế biến thủy sản
Đã có những nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng enzyme protease
của Bacillus subtilis trong chế biến thủy sản như: sản xuất bột đạm thủy
phân từ cơ thịt cá mối. Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme protease
của Bacillus subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn
có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung
protease của Bacillus subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt
cá mối và thủy phân ở 50oC, pH tự nhiên của cơ thịt cá thì hỗn hợp thủy
phân có các chỉ tiêu cảm quan và hóa học tốt nhất. Ðể ức chế quá trình gây
thối của vi sinh vật trong quá trình thủy phân có thể bổ sung vào hỗn hợp

thủy phân muối ăn với nồng độ 3% hoặc sorbitol với nồng độ 4% hay
ethanol với nồng độ 8%.
Sản xuất nước mắm ngắn ngày cũng được nghiên cứu và ứng dụng
vào sản xuất bằng các chế phẩm protease thu nhận từ vi khuẩn. Để tăng
quá trình thủy phân rút ngắn thời gian chế biến nước mắm người ta đã tiến
hành tạo nhiệt độ thích hợp cho protease hoạt động là khoảng 50 oC và
giảm độ mặn ban đầu của khối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa
protease với cá bằng cách xay nhuyễn cá… Khi cho muối vào chượp cá thì
nhiệt độ thủy phân là 43 - 45oC và sẽ làm giảm hoạt độ của protease thủy
phân cá. Ở điều kiện thích hợp, việc bổ sung protease giúp rút ngắn thời
gian sản xuất nước mắm từ 6 - 9 tháng xuống còn 30 - 40 ngày. Nước mắm
ngắn ngày có hàm lượng đạm khá cao, tuy nhiên về hương vị, độ ngon thì
kém nước mắm dài ngày. Người ta khắc phục nhược điểm này bằng cách
pha trộn nước mắm ngắn ngày với nước mắm dài ngày hoặc bổ sung thêm
hương vị vào nước mắm ngắn ngày. Ngoài nhiệt độ thích hợp, độ xay
nhuyễn cá và bổ sung muối phù hợp cũng làm giảm đáng kể thời gian lên
men sản xuất nước mắm và đảm bảo chất lượng nước mắm thành phẩm
[8].


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

2.2.7.2. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da
Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy
lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da
thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất
nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông.
Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc
nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Enzyme protease
có khả năng làm mềm da nhờ thủy phân một phần protein của da, chủ yếu

là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi
da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó
được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta
dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay,
việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (Bacillus mesentericus, Bacillus
subtilis), nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus) và xạ khuẩn vào
công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí
quan trọng.
2.2.7.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả
các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất
làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzyme vào
các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ
sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại
bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra. Một
tiêu chuẩn quan trọng khác của các protease dùng trong chất tẩy rửa là
hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải thích hợp
với các tác nhân oxy hóa và các chất kiềm hãm có trong thành phần của
chất tẩy rửa. Tham số đóng vai trò chìa khóa cho việc bổ sung protease nào
vào chất tẩy rửa là pI của chúng. Một protease phù hợp khi pI của nó trùng
với pH của dung dịch chất tẩy rửa. Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những
yêu cầu khắt khe trên.
Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào
năm 1956 với tên BIO-40 được thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963,
Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX
được chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các
protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease
được sản xuất từ các chủng Bacillus và chủ yếu là từ Bacillus subtilis. Trên

Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công
nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor
Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme
protease [8].
2.2.7.4. Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường
Việc ứng dụng các enzyme ngoại bào của vi sinh vật nói chung và vi
khuẩn Bacillus subtilis nói riêng đã và đang được nghiên cứu với nhiều triển
vọng và có những ứng dụng nhất định trong việc xử lý ô nhiễm môi trường.
Phương pháp xử lý bằng enzyme là trung gian giữa hai phương pháp
truyền thống, nó bao gồm các quy trình hoá học trên cơ sở hoạt động của
các chất xúc tác có bản chất sinh học. Enzyme có thể hoạt động trên các
chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng bằng cách kết tủa hoặc
chuyển chúng thành dạng khác. Ngoài ra chúng có thể làm thay đổi các đặc
tính của chất thải đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản
phẩm có giá trị hơn.
Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất
các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc
vật nuôi. Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước,
ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo
thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần
rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên
bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ.
Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một mặt để tận
dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các
tác nhân gây ô nhiễm môi trường, mặt khác để xử lý. Các phế thải protein
tồn đọng trong các dạng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi
hôi thối.
Lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể được coi như

là nguồn protein cao trong tạo nên cấu trúc keratin cứng được phá huỷ
hoàn toàn. Lông có thể được hoà tan sau khi xử lý với NaOH, làm tan bằng
cơ học và bằng các enzyme thuỷ phân, như protease kiềm từ Bacillus
subtilis tạo thành sản phẩm có dạng bột, màu xám với hàm lượng protein
cao có thể được sử dụng làm thức ăn [9].
2.2.7.5. Trong nuôi trồng thủy hải sản
Trong nuôi trồng thủy sản Bacillus subtilis và một số loài khác đã
được ứng dụng với vai trò cải thiện sức khỏe, tăng cường các phản ứng


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

miễn dịch và cải thiện môi trường. Khả năng sinh các enzyme phân hủy các
hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây
bệnh (Vibrio) giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng là đặc tính nỗi
trội của nhóm vi khuẩn này [10].
2.2.8. Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis
2.2.7.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi
sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt người ta
sử dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (môi trường bán
rắn).
Môi trường lỏng
Ở môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường
tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không
khí). Ở đây, vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi
trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme
ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi
trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật.
Nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo

phương pháp nuôi cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có
chiều cao khoảng 12 cm – 15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy
theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác.
Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu
chiều cao môi trường lỏng quá lớn, vi sinh vật sẽ không có khả năng đồng
hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi
trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận
enzyme sẽ không cao.
Trong nhiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong khay
nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5 đến 7 cm là hợp lý [7].
Môi trường đặc
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy vi sinh vật thu
nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng
xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử
dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường.
Trong trường hợp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường,
nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩm/ngày

bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt
môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật.
Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn
cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề
mặt của hạt môi trường, nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi
cấy vừa có độ xốp cao vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ
làm bết môi trường lại, nếu độ ẩm quá thấp sẽ không thuận lợi cho vi sinh
vật phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55% - 65%
là hợp lý.

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấy vi sinh vật thu
nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20 đến 25% trấu để làm xốp môi
trường, tạo điều kiện thuận lợi cho không khí dễ dàng xâm nhập vào lòng
môi trường [7].
2.2.7.2. Phương pháp nuôi cấy chìm
Kỹ thuật nuôi cấy
Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng
môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men (fermentor).
Trong các thiết bị lên men, người ta thường lắp đặt hệ thống điều khiển
cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các
chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí và hệ thống khuấy
trộn có ý nghĩa rất lớn. Tỷ lệ cấy giống vào môi trường lỏng 2-2,5%, trong
một số trường hợp nếu có giống tốt ta chỉ cần cho lượng giống 0,5 – 0,6%
là đủ [23].
Tác dụng của hệ thống thổi khí
Người ta thường cung cấp không khí vào bể lên men bằng máy nén
khí (compressor). Không khí sau khi ra khỏi máy nén khí được làm nguội,
làm sạch và tiệt trùng. Không khí được phân phối vào thiết bị lên men bằng
những ống dẫn khí có nhiều lỗ nhỏ. Khi không khí vào trong bể lên men,
chúng có những tác động trực tiếp sau:
Làm xáo trộn môi trường. Nhờ dòng khí vận chuyển trong môi trường
lỏng, các chất dinh dưỡng, tế bào vi sinh vật sẽ phân phối đều khắp môi
trường và chúng luôn luôn ở trạng thái động. Nhờ ở trạng thái động như
vậy, khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào vi sinh vật sẽ rất cao. Khả
năng tiếp xúc này càng cao bao nhiêu, khả năng sinh tổng hợp enzyme sẽ
cao bấy nhiêu.