báo cáo thực hành lý sinh hay

MỤC LỤC
Bài 1 - XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA QUÁ TRÌNH CO BÓP TIM ẾCH TÁCH
RỜI ................................................................................................................................................................. 1
1.1.

LÝ THUYẾT...................................................................................................................................... 1

1.2.

THỰC HÀNH .................................................................................................................................... 3

1.2.1.

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu ..................................................................................................... 3

1.2.2.

Các bước tiến hành..................................................................................................................... 3

1.2.3.

Kết quả thực hành ...................................................................................................................... 5

Bài 2 - TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH .................................................................................. 7
2.1.

LÝ THUYẾT...................................................................................................................................... 7

2.1.1.

Cơ chế vận chuyển thụ động ...................................................................................................... 7

2.1.2.

Cơ chế vận chuyển tích cực ....................................................................................................... 8

2.2.

THỰC HÀNH .................................................................................................................................... 9

2.2.1.

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu ..................................................................................................... 9

2.2.2.

Các bước tiến hành..................................................................................................................... 9

2.2.3.

Kết quả thực hành .................................................................................................................... 10

Bài 3 - XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU ........................................................ 13
3.1.

LÝ THUYẾT.................................................................................................................................... 13

3.2.

THỰC HÀNH .................................................................................................................................. 15

3.2.1.

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu ................................................................................................... 15

3.2.2.

Các bước tiến hành................................................................................................................... 15

3.2.3.

Kết quả thực hành .................................................................................................................... 15

Bài 4 - XÁC ĐỊNH ÁP SUẤT THẨM THẤU BẰNG PHƯƠNG PHÁP BAGIERAST ....................... 17
4.1.

LÝ THUYẾT.................................................................................................................................... 17

4.2.

THỰC HÀNH .................................................................................................................................. 19

4.2.1.

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu ................................................................................................... 19

4.2.2.

Các bước tiến hành................................................................................................................... 19

4.2.3.

Kết quả thực hành .................................................................................................................... 22

Bài 5 - ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HUYẾT THANH BẰNG KHÚC XẠ KẾ ....................................... 24
5.1.

LÝ THUYẾT.................................................................................................................................... 24

5.1.1.

Những khái niệm cơ bản .......................................................................................................... 24

5.1.2.

Nguyên lý hoạt động của khúc xạ kế ABBE............................................................................ 25

5.1.3.

Cách sử dụng khúc xạ kế ABBE .............................................................................................. 27

5.2.

THỰC HÀNH .................................................................................................................................. 27

5.2.1.

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu ................................................................................................... 27

5.2.2.

Các bước tiến hành................................................................................................................... 28

5.2.3.

Kết quả thực hành .................................................................................................................... 29

Bài 6 - TÍNH CHẤT QUANG HỌC CỦA PHÂN TỬ HEMOGLOBIN................................................ 32
6.1.

LÝ THUYẾT.................................................................................................................................... 32


6.2.

THỰC HÀNH ...................................................................................................................................33

6.2.1.

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu ....................................................................................................33

6.2.2.

Các bước tiến hành ...................................................................................................................33

6.2.3.

Kết quả thực hành .........................................................................................................................34

Bài 7 - ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI .................................................................37
7.1. LÝ THUYẾT ..........................................................................................................................................37

7.1.1. Thước đo thị kính ............................................................................................................................37
7.1.2. Thước đo vật kính ............................................................................................................................38
7.2. THỰC HÀNH.........................................................................................................................................39
7.2.1. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị ...........................................................................................................39
7.2.2. Các bước tiến hành ..........................................................................................................................39
7.2.3. Kết quả thực hành ............................................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................................................45


Bài 1
XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA QUÁ TRÌNH
CO BÓP TIM ẾCH TÁCH RỜI
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Xác định được đối tượng nghiên cứu của động học;
2. Nắm vững năng lượng hoạt hóa của một phản ứng (một quá trình);

3. Mô tả mối liên quan giữa hằng số tốc độ của phản ứng với nhiệt độ;
4. Nắm vững bản chất của đại lượng Q10 và ý nghĩa của nó;
5. Thành thạo phương pháp cô lập tim ếch và tính năng lượng hoạt hóa của một quá
trình sinh học.

1.1.

LÝ THUYẾT
Động học nghiên cứu tốc độ của phản ứng (hay quá trình) và sự phụ thuộc của nó vào các

yếu tố như nhiệt độ, nồng độ và sự có mặt của chất xúc tác hoặc ức chế.
Để một phản ứng hóa học xảy ra thì các nguyên tử, phân tử của chất tham gia phải thay
đổi, sắp xếp lại cấu trúc của nó và hình thành nên một trật tự cấu trúc mới trong sản phẩm của

phản ứng. Muốn vậy, nguyên tử hoặc phân tử phải
có một năng lượng tối thiểu để vượt qua hàng rào
lực đẩy giữa các lớp vỏ điện tử để liên kết với nhau,
do đó năng lượng hoạt hóa là năng lượng tối thiểu
cần thiết để nguyên tử, phân tử có thể tham gia vào
phản ứng.
Theo Maxwell – Boltzmann, sự phân bố phân
tử theo năng lượng có dạng như trên hình 1. Giả sử
Ehh là năng lượng tối thiểu cần thiết để phân tử của

Hình 1-1. Sự phân bố phân tử theo
năng lượng

một chất có thể tham gia vào một loại phản ứng thì

E- năng lượng; Ehh – năng lượng hoạt hóa;

ta thấy chỉ những phân tử nào có năng lượng bằng

N – số phân tử; Ze – đường thẳng song
song với trục tung

hoặc lớn hơn Ehh (là những phân tử có năng lượng

nằm bên phải đường thẳng Ze) là có khả năng tham gia vào phản ứng tạo thành sản phẩm.

1


Khi nhiệt độ thay đổi, làm thay đổi động năng do chuyển động nhiệt của các phân tử. Do

đó tổng năng lượng của các phân tử cũng thay đổi. Chẳng hạn khi nhiệt độ tăng lên (T2 > T1)
thì năng lượng của các phân tử tăng lên, phân tử có năng lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh sẽ nhiều
hơn, thể hiện ở đường cong phân bố Maxwell – Boltzmann dịch sang bên phải, do vậy chúng
có khả năng tham gia vào phản ứng nhiều
hơn làm cho tốc độ phản ứng tăng lên. Mối

lnK

liên quan giữa tốc độ và phản ứng và nhiệt
độ được biểu diễn qua phương trình
Arhenius.
𝐸ℎℎ

𝐾 = 𝑝𝑧𝑒 − 𝑅𝑇 (1.1)
trong đó: K – tốc độ của phản ứng; Enh –

𝛼

năng lượng hoạt hóa; P – yếu tố lập thể;

1

R – hằng số khí; Z – hệ số va chạm; T –

Hình 1-2. Sự phụ thuộc của tốc độ phản
ứng vào nhiệt độ

nhiệt độ tuyệt đối.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của lnK vào đại lượng

1
𝑇

𝑇

được thể hiện trên hình 2. Đồ thị

này có ý nghĩa quan trọng, dựa vào nó chúng ta có thể xác định được giá trị năng lượng hoạt
hóa của một quá trình:
𝑡𝑔𝛼 =

𝐸ℎℎ
𝑅

(1.2)

Năng lượng hoạt hóa còn có thể được xác định thông qua một đại lượng khác, đại lượng
Q10. Đại lượng Q10 hay còn được gọi là hệ số Van’t Hoff. Đại lượng này là tỷ số giữa hai hằng
số tốc độ của phản ứng ở điều kiện chênh lệch nhau 10 độ Censius (10oC).
𝑄10 =

𝐾2 𝐾𝑇+10
=
𝐾1
𝐾𝑇

(1.3)

Trong đó: K1 – hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ ban đầu T1; K2 – hằng số tốc độ của

phản ứng ở nhiệt độ T2 = T1 +10;
Đại lượng Q10 có nghĩa quan trọng. Nó cho biết hằng số tốc độ của phản ứng tăng hay giảm
bao nhiêu lần khi nhiệt độ thay đổi 10oC. Biểu thức toán học thể hiện mối liên quan giữa năng
lượng hoạt hóa của quá trình đại lượng Q10 như sau:
𝐸ℎℎ = 0,46. 𝑇1 . 𝑇2 . 𝑙𝑔𝑄10

2

(1.4)


Trong thực nghiệm chúng ta có thể xác định đại lượng Q10 và do vậy việc tính giá trị năng
lượng hoạt hóa của một quá trình (nhất là quá trình sinh học) trở nên dễ dàng. Mục đích của bài
thực tập này là xác định năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách rời.

1.2.

THỰC HÀNH
1.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
 1 kéo to









1 kéo con

1 chọc tủy
1 khay mổ
10 đinh ghim
4 cốc thủy tinh
4 canuyl
1 cuộn chỉ
2 khăn lau dùng để mổ











4 con ếch / nhóm
1 bàn xốp để ghim ếch
2 công tơ hút
3 bình tam giác có nút cao su dài hai lỗ
1 nồi cách thủy
1 khay (chậu) nước đá
2 nhiệt kế loại 0 – 50oC
1 lít dung dịch Ringer dung cho động vật biến nhiệt
1 đồng hồ bấm giây

1.2.2. Các bước tiến hành
1.2.2.1. Tách rời tim ếch

 Dùng kim chuyên dụng chọc tủy ếch, đặt ếch lên bàn mổ, dung ghim cố định bốn chi
ếch vào bàn mổ.
 Dùng kéo to mở rộng xoang ngực ếch, cẩn thận cắt bỏ màng bao tim sẽ thấy tim ếch
cùng hai động mạch: một rẽ sang trái, một rẽ sang phải từ động mạch chủ. Nhẹ nhàng lật tim
ếch lên sẽ thấy tĩnh mạch chủ phía dưới.
 Dùng kéo panh nhỏ, luồn sợi chỉ dài chừng 15-20cm xuống dưới hai động mạch và tĩnh
mạch chủ. Cẩn thận trong khi luồn chỉ qua tĩnh mạch vì thành tĩnh mạch rất mỏng nên dễ bị
rách.
 Thắt chặt tĩnh mạch chủ và động mạch phía phải của ếch.
Nhẹ nhàng kéo sợi chỉ để nâng động mạch trái lên, cắt vát một
đường, tạo một lỗ nhỏ để luồn canuyl có chứa dung dịch Ringer
(dung dịch sinh lý máu lạnh) vào sâu trong tâm thất. Sự xuất hiện
cột máu trong canuyl khi tim co bóp đẩy lên chứng tỏ canuyl đã
đưa vào đến tâm thất.
 Dùng ống hút rút bỏ máu trong canuyl, tiếp tục cho dung
dịch Ringer vào canuyl để rửa tim cho đến khi toàn bộ máu trong
tim đã được thay thế hết bằng dung dịch Ringer.
 Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl rồi dung kéo
con cắt rời tim ra khỏi lồng ngực ếch, quả tim sau khi tách rời khỏi
3

Hình 1-3. Tim ếch cô
lập trong bình tạo ẩm


cơ thể mà vẫn đập, đẩy cột dung dịch sinh lý trong canuyl lên xuống nhịp nhàng thì việc tách
rời (hay cô lập) tim ếch mới đạt yêu cầu.
 Gắn canuyl có tim ếch và nhiệt kế vào hai lỗ nhỏ của nút bình tạo ẩm sao cho bầu thủy
ngân của nhiệt kế và mỏm tim ở một độ cao như nhau. Bình ẩm là bình tam giác thủy tinh có
chứa dung dịch sinh lý để tạo độ ẩm cho tim cô lập hoạt động tốt hơn. Nếu kỹ thuật tách tốt ta

có một quả tim cô lập đập nhịp nhàng tới 8 giờ liên tục.

1.2.2.2.

Xác định đại lượng Q10 và năng lượng hoạt động của quá trình co bóp tim
ếch tách rời



Chuẩn bị ba bình ẩm chứa khoảng 50ml dung dịch Ringer ở 3 nhiệt độ khác nhau.
Bình 1. Đặt ở nhiệt độ của phòng thí nghiệm.
Bình 2. Đặt trong máy điều nhiệt có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng 10oC.
Bình 3. Đặt vào chậu nước đá để hạ nhiệt độ xuống thấp hơn nhiệt độ phòng 10oC



Khi nhiệt độ đã ổn định, đặt tim ếch cô lập vào bình ẩm ở nhiệt độ phòng, đếm số nhịp đập
của tim trong thời gian 1 phút, đó chính là hằng số tốc độ của quá trình co bóp tim ếch tách
rời (KT) đếm ít nhất 5 lần để lấy giá trị trung bình.
Lưu ý: Có thể xác định hằng số tốc độ của quá trình bằng cách xác định thời gian mà tim

đập được 20 nhịp. Suy ra 60 giây đập được bao nhiêu nhịp. Làm như vậy có thể tiết kiệm được
thời gian hơn.


Tiến hành tương tự như trên ở nhiệt độ cao hơn và thấp hơn 10oC so với nhiệt độ phòng để
xác định được KT+10 và KT-10. Cần chú ý mỗi lần thay đổi nhiệt độ phải chờ 3 phút cho tim
thích ứng với điều kiện nhiệt độ mới trong bình ẩm.



Áp dụng công thức để tính đại lượng Q10 trong điều kiện tăng nhiệt độ :
𝑄10 =

𝐾𝑇+10
𝐾𝑇

Từ đó tính năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách rời trong điều kiện này
là:
𝐸ℎℎ = 0,46. 𝑇1 . 𝑇2 . 𝑙𝑔𝑄10 [𝑘𝑐𝑎𝑙]
(T1, T2 chuyển thành nhiệt độ tuyệt đối)
Còn ở điều kiện giảm nhiệt độ thì:

4


𝐾𝑇
𝐾𝑇−10

𝑄′10 =
và năng lượng hoạt hóa là:

𝐸′ℎℎ = 0,46. 𝑇1 . 𝑇2 . 𝑙𝑔𝑄′10 [𝑘𝑐𝑎𝑙]

1.2.3. Kết quả thực hành
Bảng tổng hợp số liệu trung bình
Thời gian (gy)
Số
thứ
tự

Nhiệt
độ

Số
nhịp
đập

1

20

2

20

3

20

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

5

Lần 5

Trung
bình

Hằng số
tốc độ
K

Đại
lượng
Q10

Năng
lượng
hoạt hóa
Ehh


6


Bài 2
TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:

2.1.

1.

Nắm vững thế nào là tính thấm của tế bào mô;

2.

Nắm vững cơ sở của hiện tượng màng có tính thấm chọn lọc;

3.

Mô tả hai cơ chế vận chuyển vật chất qua màng tế bào;

4.

Giải thích được hiện tượng thấm một chiều của tế bào và mô;

5.

Nắm vững phương pháp dùng chất màu để nghiên cứu tính thấm;

LÝ THUYẾT
Là một hệ thống hở, tế bào sống luôn thực hiện quá trình thay đổi chất với môi trường bên

ngoài. Quá trình này chỉ có thể xảy ra nhờ khả năng màng tế bào và mô cho thâm nhập hoặc
thải hồi các chất khí, nước và các chất hòa tan đi qua. Khả năng đó được gọi là tính thấm của
tế bào và mô (tham khảo thêm về lý thuyết màng tế bào).
Tính thấm không những chỉ phụ thuộc vào cấu trúc đặc trưng của từng loại tế bào và mô
mà còn phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái chức năng của chúng. Chính cấu trúc đặc trưng và
trạng thái chức năng của các loại tế bào và mô quy định tính thấm có chọn lọc đối với các chất
khác nhau từ môi trường vào tế bào. Một khi tế bào và mô không còn khả năng hoạt động thực
hiện các chức năng (tế bào bị chết) thì tính thấm chọn lọc cũng không còn nữa, khi tính thấm

của màng tế bào thay đổi, luồng vật chất đi vào hoặc ra khỏi tế bào cũng thay đổi theo.
Ngày nay ngoài thực bào, uống bào (còn gọi là ẩm bào) có hai cơ chế vận chuyển vật chất
qua màng tế bào đã được làm sáng tỏ, đó là:

2.1.1. Cơ chế vận chuyển thụ động
Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng theo tổng các loại gradient, không tiêu tốn năng
lượng. Quá trình vận chuyển này diễn ra như một quá trình khuếch tán, tuân theo định luật Fick:
𝑑𝑚
𝑑𝑐
= −𝐷𝑆
𝑑𝑡
𝑑𝑥
Trong đó:

𝑑𝑚
𝑑𝑡

(2.1)
𝑑𝑐

– tốc độ khuếch tán vật chất qua màng (g/s); 𝑑𝑥 - gradient nồng độ (g/cm3); 𝑆 –

Tiết diện mà vật chất khuếch tán qua (cm2); 𝐷 – hệ số khuếch tán (g/cm2.s).

7


Dấu (–) trong công thức nêu lên ý nghĩa vật lý của quá trình là sau thời gian khuếch tán (t)
lượng vật chất đã bị giảm đi so với giá trị ban đầu. Tốc độ khuếch tán càng lớn thì nồng độ chất
ban đầu càng giảm nhanh.

2.1.2. Cơ chế vận chuyển tích cực
Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng ngược tổng gradient có tiêu phí năng lượng của
quá trình trao đổi chất. Cơ chế này gắn liền với hoạt động của các chất mang là các phân tử
lypoprotein trong thành phần cấu trúc màng. Hoạt động của một trong các protein chất mang
vận chuyển tích cực ion K+ và Na+ ngược gradient nồng độ của chúng là Na+ - K+ - ATPaza đã
được nghiên cứu khá chi tiết và đươc mô tả như hoạt động của “bơm ion Na+ - K+”. Bằng cơ chế
này, tế bào và mô đã duy trì được gradient nồng độ các chất, nhờ đó mà chúng có khả năng sinh
công dồi dào trong quá trình sống.
Tốc độ cũng như chiều hướng thâm nhập của các chất vào tế bào và mô không chỉ phụ
thuộc vào tính thấm chọn lọc của màng mà còn phụ thuộc vào bản chất của các chất và vào mức
độ thay đổi tính chất hóa lí của các chất đó. Chẳng hạn, nếu có một chất nào đó khi đã xâm
nhập vào nội bào nó tham gia vào phản ứng hóa học thành một chất khác, hoặc nếu nó chuyển
từ trạng thái tự do sang trạng thái liên kết, thì khả năng khuyếch tán trở lại môi trường ngoài
của nó rất khó xảy ra. Ví dụ một axit yếu hoặc kiềm yếu ở ngoài môi trường chúng không phân
li nên dể dàng khuếch tán vào trong tế bào. Khi vào bên trong nội bào, do điều kiện môi trường
đã thay đổi nên chúng bị phân li thành các ion, dễ tham gia vào các liên kết hóa học nên mất
khả năng khuyếch tán ra ngoài, nên axít yếu và kiềm yếu chỉ có khả năng thấm theo một chiều
nhất định.
Da ếch là một đối tượng thuận lợi để quan sát
và nghiên cứu tính thấm một chiều đối với một số
chất (trong đó có xanh methylene, một thuốc
nhuộm có tính kiềm yếu). Da ếch bao gồm biểu
mô ở phía ngoài và mô liên kết ở bên trong. Biểu
mô được cấuu tạo từ 5 đến 8 lớp tế bào. Ngoài
cùng, phủ lên biểu mô là một màng cutin mỏng có
nguồn gốc từ dịch của các tuyến nhầy và một lớp
tế bào sừng. Tiếp theo là các lớp tế bào biểu mô

Hình 2-1. Cấu tạo mô da ếch

có dạng hình tròn, xếp hơi thưa tạo thành các khe

1. Màng cutin; 2. Lớp tế bào sừng; 3. Các
lớp tế bào sinh trưởng biểu mô; 4. Lớp tế
bào màng nền; 5. Các sắc tố; 6. Lớp mô
liên kết

gian bào. Trong cùng là lớp tế bào có hình lăng
trụ, nhân của chúng có hình ô van, xếp xít nhau và

8


được gọi là tế bào màng nền. Tất cả các lớp tế bào này được gọi là lớp tế bào sinh trưởng, chúng
có khả năng phân chia mạnh để thay thế các tế bào biểu mô già. Dưới màng nền là lớp mô liên
kết. nơi định vị các sắc tố màu xanh đen. (Hình 2 – 1)
Biểu mô da ếch có khả năng hấp thụ cao, phản ứng acid yếu (có tính acid yếu), còn lớp mô
liên kết có khả năng hấp thụ yếu và phản ứng kiềm yếu. Với cấu trúc mô đặc trưng như vậy, da
ếch thấm một chiều từ mô liên kết ra biểu mô đối với một số thuốc nhuộm có tính kiềm yếu
như xanh methylene. Bởi vì ở lớp mô liên kết có tính kiềm yếu, các chất này không bị phân li
thành các ion. Chúng cũng không bị hấp thụ mạnh nên dể dàng khuyếch tán ra lớp biểu mô. ở
lớp biểu mô do có tính axít nên các chất bị phân li và bi hấp thụ mạnh do đó chúng không có
khả năng khuyếch tán theo chiều ngược lại.
Tính thấm một chiều của tế bào và mô không phải là bất biến mà cũng có thể bị thay đổi
tính chất hóa lý của môi trường.

2.2. THỰC HÀNH
2.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
 1 kim chọc tủy

 1 máy so màu để xác định mật độ

 1 kéo to sắc

quang học của dung dịch

 1 cuộn chỉ

 100 ml cồn 96o

 1 khay mổ hoặc bàn mổ

 100ml dung dịch xanh methylen 0,1%

 4 ống thủy tinh hình trụ có chiều dài

trong dung dịch sinh lí
 1000ml dung dịch sinh lí dung cho

7-8 cm

động vật biến nhiết

 4 nắp đậy lá nhôm hoặc nhựa, ở giữa
được đục một lỗ có đường kính bằng

 2 pipet loại 5 -10 ml và giá để pipet

đường kính ống thủy tinh

 2 khăn lau dùng để mổ

 6 cốc thủy tinh loại 100ml

 2 con ếch/nhóm sinh viên.

2.2.2. Các bước tiến hành
2.2.2.1.

Chuẩn bị túi da ếch

Mỗi nhóm bắt hai con ếch, dung kim chọc tủy ếch cho ếch bất động. Cẩn thận lấy da của
bốn bắp chân ếch sao cho không bị thủng để làm các túi da ếch. Dùng hai chiếc, một để nguyên,
chiếc kia lộn ngược lại cho biểu mô vào trong rồi ngâm vào dung dịch sinh lý cho da ếch giữ
nguyên trạng thái sinh lý bình thường. hai chiếc còn lại làm như trên nhưng ngâm trong cồn 96o
với thời gian là 120 phút nhằm giết chết da ếch.

9


Dùng chỉ buộc một đầu của những túi
da ếch đã chuẩn bị trên vào các ống thủy
tinh hình trụ, còn đầu kia buộc túm lại. cho
dung dịch sinh lý vào túi để kiểm tra xem
túi có bị rò rỉ không. Nếu không, đổ dung
dịch sinh lý đi rồi cho 5ml dung dịch xanh
methylen 0,1% vào và nhúng các túi này
vào các cốc đựng một lượng 100ml dung
dịch sinh lý bằng nhau.

Chú ý sao cho mức xanh methylen
trong túi cao bằng mức dung dịch sinh lí
trong cốc.

Hình 2-2. Mẫu túi da ếch; a. Ống thủy tinh
hình trụ; b. Túi da ếch được ngâm trong dung
dịch

2.2.2.2. Quan sát hiện tượng thấm của xanh methylen qua các túi ếch
Đặt các cốc có túi da ếch trên vao bình ổn nhiệt độ 22oC trong 40 phút. Sau đó nhận xét
bằng mắt thường xem Xanh methylen khuyếch tán từ trong ra ngoài theo chiều nào: từ mô liên
kết ra biểu mô hay ngược lại từ biểu mô ra mô liên kết? Đồng thời so sánh với những túi đã
ngâm trong cồn xem có nhận xét gì, ghi các nhận xét vào vở và báo cáo kết quả với cán bộ
hướng dẫn thực hành.
2.2.2.3. Định lượng Xanh methylen đã thấm qua da ếch
 Dựng đồ thị chuẩn
Sau khi đặt các túi da ếch vào bình ổn nhiệt, trong khi chờ đợi kết quả, nhanh nhóng chuẩn
bị các dung dịch xanh methylen có các nồng độ: 0,002; 0,004; 0,006; 0,008; 0,01; 0,02% trong
dung dịch sinh lí. Dung máy so màu xác định mật độ quang học (D) của các dung dịch vừa pha.
Dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang học vào nồng độ, ta có đồ thị chuẩn.
 Xác định lương xanh methylen đã thấm qua da
Sau 40 phút (hoặc lâu hơn nếu có thời gian) nhấc bỏ các túi da ếch ra khỏi các cốc, dung
đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch trong cốc rồi đêm xác định mật độ quang học trên máy so
màu, Dựa vào đồ thị chuẩn xác định nồng độ xanh methylen đã thấm qua da ra ngoài.

2.2.3. Kết quả thực hành
Kết quả thu được lập thành bảng số liệu

10

Bảng tổng hợp số liệu
Đối
tượng
nghiên
cứu

Da ngâm trong dung dịch sinh lí
D1

D2

D3

D
trung
bình

Nồng
độ (C)

Biểu mô
ổ trong
Biểu mô
ổ ngoài

11

Da ngâm trong cốc
D1

D2

D3

D
trung
bình

Nồng
độ (C)


12


Bài 3
XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Phân biệt thế nào là môi trường ưu, nhược và đẳng trương.
2. Phản ứng của tế bào động vật và thực vật trong các loại môi trường đó.
3. Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp nó có thể thay đổi thể tích

trong một giới hạn nhất định.
4. Thế nào là độ bền của màng tế bào hồng cầu. Ý nghĩa.
5. Thành thạo phương pháp sử dụng dunh dịch nhược trương xác định độ bền của màng
tế bào hồng cầu.

3.1.

LÝ THUYẾT
Chúng ta biết màng tế bào có một ý nghĩa

đặc biệt quan trọng trong đời sống của tế bào.
U.B.Frank - một nhà lý sinh nổi tiếng đã nói
rằng: “Mọi hoạt động sống đều diễn ra trên “sân
khấu” - màng”. Màng ở đây được hiểu theo ý
nghĩa rộng, gồm các loại màng có mặt ở bên
trong tế bào (màng nội bào) và màng sinh chất,
Hình 3-1. Tế bào hồng cầu người quan sát
qua kính hiển vi điện tử

màng bao quanh tế bào.

Màng sinh chất giữ nhiệm vụ bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất giữa tế bào và môi
trường bên ngoài. Tế bào hồng cầu là một đối tượng điển hình để chúng ta nghiên cứu cấu tạo,
tính chất và chức năng của màng tế bào.
Trên hình 3-1 là hình ảnh chung về tế bào hồng cầu người quan sát qua kính hiển vi điện
tử. Tế bào có mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường ngoài. Hồng cầu trưởng thành
là một loại tế bào không nhân. Cấu tạo màng tế bào hồng cầu, nhìn chung giống như màng sinh
chất của các loại tế bào khác, gồm các protein màng tế bào – lớp lipid kép – protein khảm vào
nhau (tham khảo về mô hình khảm động màng sinh chất). Có một điểm khác biệt là ở bề mặt
bên trong màng tế bào hồng cầu tồn tại một mạng lưới vật chất có nguồn gốc là protein dạng

13


sợi và được gọi là spectrin. Spectrin chiếm một
tỉ lệ là 30% tổng số protein của màng và là phức

hợp của hai sợi polypeptid có trọng lượng phân
tử khoảng 220.000 – 240.000Da (dalton) (hình
3-2).
Cùng với một vài loại protein khác,
spectrin tham gia vào quá trình biến đổi hình
dạng của hồng cầu thông qua việc co ngắn hay

Hình 3-2. Mạng lưới spectrin ở bề mặt bên

duỗi dài dạng sợi của mình. Bằng cách đó tế bào

trong màng tế bào hồng cầu của cừu

hồng cầu có thể biến đổi hình dạng giúp nó đi qua được các mao mạch nhỏ li ti, ở khắp cơ thể.
Đặc biệt là ở lách, những tế bào hồng cầu đã già hoặc bị thoái hóa chức năng, khả năng đàn hồi
co giãn các sợi spectrin kém, không có khả năng đi qua mao mạch kiểm soát của cơ quan màng
và bị lách tiêu hủy.
Ở trạng thái sinh lý bình thường, màng hồng cầu khá bền vững. Thể tích của tế bào thường
không thay đổi và được điều tiết bởi tỉ lệ lượng các chất hòa tan bên trong và bên ngoài tế bào.
Chúng ta biết, lượng các ion của các muối hòa tan bên trong tế bào là một hằng số ổn định. Do
đó thể tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion của môi trường bên ngoài. Chúng ta biết có ba loại
môi trường: môi trường ưu trương, môi trường đẳng trương, môi trường nhược trương.
Màng tế bào hồng cầu bền trong môi trường đẳng trương. Trong môi trường ưu trương, tế
bào nhăn nhúm lại do chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ bên ngoài vào. Còn trong môi
trường nhược trương thì tế bào trương phồng lên và màng của nó bị bung ra do chịu tác động
của một lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu từ bên trong làm cho lượng nước trong tế bào ngày
càng tăng cao và cuối cùng giải phóng các chất từ nội bào ra bên ngoài. Độ bền của màng hồng
cầu chính là nồng độ dung dịch muối trong môi trường nhược trương, tại đó không xảy ra hiện
tượng tế bào hồng cầu bị huyết tiêu.

Hình 3-3. Phản ứng của tế bào hồng cầu trong các môi trường khác nhau
14


Trong bài thực tập này, chúng ta tìm hiểu phản ứng khác nhau của tế bào động vật (hồng
cầu) và thực vật khi tiếp xúc với ba môi trường nêu trên và xác định độ bền của màng hồng cầu.

3.2. THỰC HÀNH
3.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
 10 ống nghiệm loại 10ml

 250 ml dung dịch sinh lý máu nóng pH = 7,4

 1 máy so màu

 3 pipet loại 5 ml

 250 ml dung dịch NaCl 2%

 Tế bào hồng cầu động vật máu nóng

 500 ml nước cất

 1 pipetman 100 l , giấy thấm, khăn lau.

3.2.2. Các bước tiến hành
3.2.2.1. Lấy mẫu tế bào hồng cầu
Dùng citrat natri hoặc heparin để lấy máu chống đông. Rửa tế bào hồng cầu bằng cách quay
li tâm (1200 vòng/phút trong 5 phút) máu chống đông trong dung dịch sinh lý PBS 90/00 (có pH
= 7,4) ba lần.

Lưu ý: Trước khi li tâm dùng ống hút sục nhẹ nhàng cho hồng cầu phân bố đều trong dung
dịch, tránh bị vỡ. Sau lần li tâm thứ ba, phân tán đều hồng cầu trong dung dịch PBS nói trên
sao cho có mật độ là 5.106 tế bào/ml.

3.2.2.2. Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu
Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 0 đến 10. Pha vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch muối
NaCl tương ứng với các nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9%, sau đó thêm vào
mỗi ống nghiệm 500 l dịch hồng cầu đã chuẩn bị trên. Để các ống nghiệm vào tủ ấm 370C
trong 15 phút rồi li tâm 3000 vòng/phút. Sau khi li tâm, quan sát màu của dịch. Màu đỏ là màu
của huyết sắc tố thoát ra sau khi màng tế bào hồng cầu bị vỡ. Nồng độ thấp nhất của các ống
không có màu đỏ là giới hạn bền của màng tế bào hồng cầu.

3.2.3. Kết quả thực hành
Kết quả thu được lập thành bảng số liệu:
Nồng độ (%)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Màu sắc
Kết luận về giới hạn độ bền của màng tế bào hồng cầu.

15

0,6

0,7

0,8

0,9


16


Bài 4
XÁC ĐỊNH ÁP SUẤT THẨM THẤU BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BAGIERAST
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Phân tích vai trò và ý nghĩa của áp suất thẩm thấu đối với cơ thể sinh vật;
2. Khắc sâu bản chất của áp suất thẩm thấu;
3. Nắm vững điều kiện để quan sát và xác định giá trị của áp suất thẩm thấu;

4. Nắm vững nguyên tắc của phương pháp Bagierast;
5. Thành thạo phương pháp xác định áp suất thẩm thấu của dịch sinh vật.

4.1.

LÝ THUYẾT

Đối với hệ thống sống sự khuếch tán và thẩm thấu có một vai trò quan trọng trong quá trình

trao đổi chất. Ở thực vật, những quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng từ đất vào rễ, rồi lên
thân đến lá, sự vận chuyển các chất nhựa theo dọc thân cây đều gắn liền với giá trị của áp suất
thẩm thấu. Ở động vật, sự có mặt của áp suất thẩm thấu keo đóng một vai trò quan trọng trong
việc điều hòa nước trong máu. Ở các loài tiêm mao nước ngọt, có cơ quan điều hòa áp suất
thẩm thấu, cơ quan này chính là những không bào có khả năng co bóp và tiết ra các dung dịch
nhược trương để duy trì áp suất thẩm thấu, nhờ đó mà tế bào không bị trương. Ngoài quá trình
điều hòa nước, áp suất thẩm thấu còn có vai trò quan trọng trong việc bài tiết các chất cặn bã,
còn gây nên lực hóa thẩm thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp ATP – một quá trình sinh năng
lượng quan trọng và chủ yếu của cơ thể sinh vật.
Giá trị của áp suất thẩm thấu ở một số đối tượng bậc thấp có thể dao động trong một khoảng
nào đó tùy thuộc vào nồng độ các chất ở môi trường xung quanh, còn ở các cơ thể bậc cao có
giá trị tương đối ổn định mặc dù nồng độ của các chất ở môi trường xung quanh có thể thay
đổi. Chẳng hạn áp suất thẩm thấu của huyết thanh máu người ở trạng thái sinh lí bình thường
có giá trị là 7,4at (dao động trong khoảng 7,35 – 7,45 at).
Bản chất của áp suất thẩm thấu là do nồng độ phân tử của các chất hòa tan gây nên. Vì vậy
giá trị của áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào giá trị nồng độ, ngoài ra nó còn phụ thuộc vào nhiệt
độ tuyệt đối của môi trường. Van’t Hoff đã tính toán và đưa ra công thức xác định áp suất thẩm
thấu (P) như sau:
𝑃 = 𝛼𝐶𝑅𝑇

17

(4.1)


Trong đó : C - là nồng độ chất tan (mol); R - là hằng số khí (8.31.103 jun/kmol.độ) ; T - là
nhiệt độ tuyệt đối (oK) ;  - hệ số phân li.
Điều này cũng có nghĩa áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào số lượng các tiểu phần (số ion,

số phân tử, số hạt) trong dung dịch. Cho nên đối với các dung dịch keo có nồng độ loãng thì
định luật Van’t Hoff không còn chính xác nữa, bởi vì các hạt keo có khả năng keo tụ làm cho
số lượng hạt trong hệ giảm đi. Tính chất này giúp chúng ta dễ dàng giải thích được vì sao áp
suất thẩm thấu của các dung dịch keo thường có giá trị nhỏ hơn của dung dịch thực, hay vì sao
áp suất thẩm thấu của hai hệ keo tuy có cùng nồng độ trọng lượng, chỉ khác nhau về kích thước
của hạt mà giá trị của chúng lại khác nhau.
Thực nghiệm cho thấy rằng áp suất thẩm thấu keo tỷ lệ với lũy thừa bậc ba bán kính của
hạt, vì thế cho nên khi kích thước của hạt thay đổi không đáng kể cũng sẽ dẫn đến thay đổi giá
trị của áp suất thẩm thấu rất lớn. Ví dụ : kích thước hạt mới thay đổi hai lần thì áp suất thẩm
thấu đã thay đổi tới tám lần. Trong trường hợp khi dung dịch có nồng độ tương đối đậm đặc thì
phương trình Van’t Hoff có dạng như sau :
1
𝑃 = 𝐶𝑅𝑇 ( + 𝐵𝐶)
𝑀

(4.2)

Trong đó: M - trọng lượng phân tử chất tan; B - hằng số đặc trưng cho sự tương tác giữa
các hạt với nhau.
Điều kiện để quan sát được hiện tượng thẩm thấu là phải có sự chênh lệch về nồng độ các
chất hòa tan giữa hai pha được ngăn cách nhau bởi một màng bán thấm. Màng bán thấm là
màng chỉ cho phân tử dung môi mà không cho phân tử chất hòa tan đi qua.
Trên hình 4-1 cho thấy bình A và B được
ngăn cách nhau bởi một màng bán thấm M, giả
sử chúng cùng chứa một loại dung dịch, nhưng
nồng độ dung dịch ở bình A nhỏ hơn ở bình B
(CA < CB), khi đó sẽ có một dòng dung môi
chuyển từ A sang B làm cho mực chất lỏng trong
bình B dâng cao hơn trong bình A. Cột chất lỏng
ấy gây nên một áp suất tác dụng lên màng M,

ngăn cản dòng dung môi tiếp tục chuyển sang B.
Khi đạt tới trạng thái cân bằng (có bao nhiêu

Hình 4-1. Thí nghiệm quan sát hiện
tượng thẩm thấu

phân tử nước chuyển từ A sang B thì có bấy nhiêu chuyển từ B sang A) áp suất do cột chất lỏng

18


gây nên đạt giá trị (Po). Đại lượng này có thể dùng đặc trưng định lượng cho áp suất thẩm thấu
của dung dịch.
Trong thực tế, có một màng bán thấm lí tưởng như vậy để quan sát và xác định áp suất
thẩm thấu một cách trực tiếp là rất khó, cho nên người ta thường đo áp suất thẩm thấu bằng
phương pháp gián tiếp dựa trên nguyên tắc về sự phụ thuộc của áp suất hơi trên bề mặt vào
nồng độ dung dịch. Dung dịch nào có nồng độ cao (tương ứng với áp suất thẩm thấu lớn) thì áp
suất hơi trên bề mặt nhỏ. Ngược lại, dung dịch nào có nồng độ thấp (có áp suất thẩm thấu nhỏ)
thì áp suất hơi trên bề mặt của nó lớn. Nếu cho bề mặt thoáng của hai dung dịch này tiếp xúc
với nhau sẽ xảy ra hiện tượng dịch chuyển của các phân tử dung môi ở thể hơi về phía dung
dịch có nồng độ cao hơn làm cho thể tích của nó tăng lên, còn thể tích của dung dịch có nồng
độ nhỏ sẽ bị giảm đi. Dựa vào hiện tượng này Bagierast đã xây dựng phương pháp xác định áp
suất thẩm thấu dựa vào quan sát sự chuyển động của bọt khí giữa hai dung dịch có nồng độ
khác nhau trong mao quản. Ưu điểm của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng,
lượng chất cần thiết để nghiên cứu ít nên phù hợp với các đối tượng sinh vật.

4.2. THỰC HÀNH
4.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
 1 kính hiển vi có thước đo vật

 50 mao quản có đường kính 1,5 mm và chiều
dài 5 – 7 cm

kính
 2 đĩa đồng hồ

 10 lam kính

 50 g paraphin

 1 đũa thủy tinh.

 1 đèn cồn

 250 ml nước cất

 1 giá ống nghiệm

 250 ml dung dịch NaCl (1%)

 1 giá pipet.

 50 ml dung dịch nghiên cứu (dung dịch NaCl

 10 ống nghiệm loại 5 – 10ml


2 pipet loại 5ml

mà sinh viên không biết trước nồng độ)



50 ml huyết thanh nguyên chất

4.2.2. Các bước tiến hành
4.2.2.1.

Xác định áp suất thẩm thấu của dịch nghiên cứu

Bước 1. Chuẩn bị dung dịch kiểm tra
Dùng nước cất và dung dịch NaCl 1% để pha các dung dịch có nồng độ 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;
0,6; 0,7; 0,8% vào các ống nghiệm khác nhau. Các dung dịch đó được gọi là dung dịch kiểm
tra.
Bước 2. Chuẩn bị tiêu bản để soi kính hiển vi
19


 Rót chừng 3 ml dung dịch nghiên cứu ra một đĩa đồng hồ, dùng một đĩa khác để rót một
trong các dung dịch kiểm tra với thể tích như trên.
 Lấy một mao quản, cầm nghiêng và nhúng một đầu vào đĩa đựng dung dịch kiểm tra,
do có hiện tượng mao dẫn dung dịch sẽ từ từ dâng lên trong mao quản. Khi chất lỏng dâng lên
đến giữa mao quản thì nhấc ra khỏi đĩa đồng hồ, quay ngược cho chất lỏng chảy sang đầu kia
của mao quản, khi mực chất lỏng cách đầu mút mao quản chừng 1 – 1,5 mm thì lập tức nhúng
vào đĩa đồng hồ đựng dung dịch nghiên cứu. Dung dịch này sẽ dâng lên đẩy dung dịch kiểm tra
trở về vị trí ban đầu và tạo thành bọt khí ở giữa.

Hình 4-2. a. Tiêu bản mao quản dùng để quan sát sự chuyển động của bọt khí.
b. Vòng cung bọt khí trong hiển vi trường.

 Đặt mao quản lên lam kính (nhớ ghi ký hiệu để không bị nhầm lẫn dung dịch ở hai đầu

mao quản). Hơ trên đèn cồn cho paraphin nóng chảy rồi dùng nó để gắn kín hai đầu của mao
quản lại ta được một tiêu bản để quan sát trên kính hiển vi (hình 11a, hình 11b).
Bước 3. Quan sát sự chuyển động của bọt khí
 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi, chỉnh kính và tiêu bản sao cho một trong hai mép của
bọt khí (có hình vòng cung) trùng với điểm giao nhau của hai đường chéo trong hiển vi trường
rồi theo dõi hướng chuyển động của vòng cung bọt khí (xem hình 11.b). Bọt khí ở giữa hai
dung dịch có nồng độ khác nhau trong mao quản bao giờ cũng chuyển động về phía có nồng độ
thấp hơn (cần lưu ý rằng hướng chuyển động quan sát dưới hính hiển vi ngược chiều với thực
tế). Dựa vào hướng chuyển động của vòng cung ta biết được dung dịch kiểm tra (đã biết trước
nồng độ) có nồng độ lớn hơn hay bé hơn dung dịch nghiên cứu.
 Ghi lại kết quả theo hướng dẫn ở bảng 1. Tiến hành tương tự với các dung dịch kiểm tra
khác cho đến khi vòng cung bọt khí đứng im, không dịch chuyển khỏi vị trí ban đầu. Nồng độ
dung dịch nghiên cứu có giá trị đúng bằng nồng độ của dung dịch kiểm tra đó (trong ví dụ ở
bảng 1 là 0,5%)

20


Bảng 1
[C] Dung dịch kiểm tra, %

Hướng của vòng cung

Dung dịch nghiên cứu

0.2





0,3





0.4





0,5





0,6





0,7





0,8





 Trường hợp nếu vòng cung dịch chuyển ít nhưng về hai hướng ngược nhau trong một
khoảng nồng độ (chẳng hạn khoảng giữa 0,6% và 0,7 %) ta cần chuẩn bị một số dung dịch kiểm
tra khác có nồng độ chênh lệch nhau ít hơn (chẳng hạn cần pha dung dịch 0,62, 0,64, 0,66,
0,68%), rồi tiến hành như đã nêu để tìm ra kết quả chính xác hơn. Kết quả cũng được lập bảng
tương tự:
Bảng 2
[C] dung dịch kiểm tra, %

Hướng của vòng cung

Dung dịch nghiên cứu

0,62





0,64





0,66





0,68





Bước 4. Tính nồng độ áp suất thẩm thấu của dịch nghiên cứu
 Nồng độ % của dung dịch nghiên cứu được xác định được ở trên cần chuyển đổi thành
nồng độ phân tử gam (mol).
Ví dụ: chuyển nồng độ 0,5% dung dịch NaCl ra mol:

5,0
 0,085 mol
58,5

 Tính áp suất thẩm thấu của dung dịch trên ở nhiệt độ 170C theo công thức sau:
21


P  CRT (vì NaCl phân ly thành 2 ion nên   2 )
3
P = 2  0,085mol  8,31.10 jun / kmol. độ  (273+17) độ

= 0,17mol  8,31 jun/mol.độ  290 độ
= 409,68 N.m

 4,1 at

Báo cáo kết quả này cho cán bộ hướng dẫn, sau đó chuyển sang xác định áp suất thẩm thấu
của huyết thanh

4.2.2.2. Xác định áp suất thẩm thấu của huyết thanh nguyên
Dung dịch nghiên cứu được thay thế bằng huyết thanh nguyên, sau đó lặp lại các bước tiến
hành đã nêu trên để tính áp suất thẩm thấu của nó.

4.2.3. Kết quả thực hành
a. Ghi lại kết quả theo hướng dẫn ở bảng 1 và bảng 2.
b. Ghi lại kết quả với dung dịch nghiên cứu là huyết thanh nguyên.

22


23