Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria Applanata (FÉE) D. D. Awasthi

Header Page 1 of 146.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
­­­­­­­­­­

LÂM VĨNH PHÚ

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y
DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2014

Footer Page 1 of 146.


Header Page 2 of 146.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
­­­­­­­­­­

LÂM VĨNH PHÚ

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y
DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. NGUYỄN TRỌNG TUÂN

Cần Thơ, 2014

Footer Page 2 of 146.


Header Page 3 ofLuận
146.văn tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN


Trong suốt những năm đại học, em vô cùng biết ơn quý Thầy, Cô trường
Đại học Cần Thơ nói chung và Khoa Khoa Học Tự Nhiên nói riêng đã hết
lòng giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức nghề nghiệp, nền tảng
cuộc sống vô giá, là hành trang để em vững bước trên con đường tương lai.
Học kỳ cuối, em thực sự đã tiếp thu được thêm những kiến thức, kinh nghiệm
thực tiễn vô cùng bổ ích từ những khó khăn vấp phải trong quá trình thực hiện
luận văn tốt nghiệp, những vấn đề này bổ sung và củng cố cho lý thuyết em đã
được học một cách trọn vẹn nhất.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Trọng
Tuân đã tin tưởng giao đề tài cho em, cùng ThS. Nguyễn Thế Duy không ngại

khó khăn, bỏ thời gian và công sức tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ khi bắt
đầu đến khi hoàn thiện luận văn. Nhờ sự chỉ bảo và những kinh nghiệm học
hỏi từ các Thầy, em đã hoàn thành luận văn của mình.
Em cũng xin cảm ơn những người bạn ở lớp Hóa Dược K37 đã đồng
hành và trải qua nhiều khó khăn cùng em trong suốt quãng đời sinh viên, các
anh, chị và các bạn cùng thực hiện luận văn ở phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1 đã
hỗ trợ, giúp đỡ và mang lại nhiều niềm vui trong suốt thời gian cùng thực hiện
luận văn.
Cuối cùng, không thể dùng từ ngữ nào để thể hiện lòng biết ơn vô bờ của
con đối với gia đình, cha mẹ, người đã sinh thành, nuôi nấng, tạo mọi điều
kiện tốt nhất để con được học hành đến nơi đến chốn, tiếp cận tri thức khoa
học, trở thành người có ích cho xã hội. Cảm ơn cha mẹ đã luôn bên con, là chỗ
dựa cho con về mọi mặt để con bước tiếp đến tương lai tốt đẹp.
Xin chân thành cảm ơn!

i
Footer Page 3 of 146.


Header Page 4 ofLuận
146.văn tốt nghiệp

Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học

­­­­­­­­­­­­

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Trọng Tuân.
2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của
loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi”.
3. Sinh viên thực hiện: Lâm Vĩnh Phú
MSSV: 2112069
Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37.
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

Cán bộ hướng dẫn

TS. Nguyễn Trọng Tuân

ii
Footer Page 4 of 146.


Header Page 5 ofLuận
146.văn tốt nghiệp

Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học

­­­­­­­­­­­­

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………
2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của
loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi”.
3. Sinh viên thực hiện: Lâm Vĩnh Phú
MSSV: 2112069
Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014
Cán bộ phản biện

iii
Footer Page 5 of 146.


Header Page 6 ofLuận
146.văn tốt nghiệp

TÓM TẮT
Luận văn này được thực hiện với mục đích khảo sát thành phần hóa học

trong phân đoạn cao chiết petroleum ether từ loài địa y Dirinaria applanata
(Fée) D. D. Awasthi, được thu mẫu ngay ở khuôn viên Đại học Cần Thơ. Tiếp
theo là đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao tổng methanol, các phân
đoạn cao với độ phân cực khác nhau như cao petroleum ether, cao ethyl
acetate và cao nước cùng các chất tinh khiết phân lập được từ loài địa y này.
Từ phân đoạn cao petroleum ether đã phân lập được 1 hợp chất tinh khiết
là methyl haematommate (HP1). Cấu trúc của hợp chất này được xác định
bằng các phương pháp phổ hiện đại như 1H­NMR, 13C­NMR, DEPT, HMBC
và đối chiếu với các tài liệu đã công bố.
Hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao chiết từ địa y Dirinaria
applanata (Fée) D. D. Awasthi được đánh giá bằng phương pháp sử dụng gốc
tự do DPPH (2,2­diphenyl­1­picrylhydrazyl) qua giá trị IC50.
Từ khóa: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, methyl
haematommate, DPPH, IC50.

iv
Footer Page 6 of 146.


Header Page 7 ofLuận
146.văn tốt nghiệp

ABSTRACT
The aim of this thesis is to investigate chemical composition of
petroleum ether extract of the lichen Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi,
which is collected in Can Tho University’s campus. Next, evaluate antioxidant
ability of methanol total extract; three different polarity extracts: petroleum
ether extract, ethyl acetate extract, water extract and pure compounds were
isolated from this lichen.
From petroleum ether extract, one pure compound were isolated: methyl

haematommate (HP1). Its structures were determined by modern
spectroscopic method: 1H­NMR, 13C­NMR, DEPT, HMBC, which were
compared with some of previously published data.
Antioxidant activitity of extracts of the lichen Dirinaria applanata (Fée)
D. D. Awasthi were evaluated by DPPH free radical method (2,2­diphenyl­1­
picrylhydrazyl) through IC50 value.
Keywords: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, methyl
haematommate, DPPH, IC50.

v
Footer Page 7 of 146.


Header Page 8 ofLuận
146.văn tốt nghiệp

Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học

­­­­­­­­­­­­

ĐỀ TÀI

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y
DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả
nghiên cứu của tôi, các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ
luận văn cùng cấp nào khác và đã được chỉnh sửa hoàn chỉnh theo ý kiến và
góp ý của các Thầy, Cô phản biện và hội đồng chấm bảo vệ luận văn.
Cần Thơ, ngày …. tháng .… năm ……..

Lâm Vĩnh Phú
Luận văn tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: Cử Nhân Hóa Dược
Đã bảo vệ và được duyệt
Hiệu trưởng……………………………….....
Trưởng khoa………………………………....
Trưởng chuyên ngành

Cán bộ hướng dẫn

……………………...

TS. Nguyễn Trọng Tuân
vi

Footer Page 8 of 146.


Header Page 9 ofLuận
146.văn tốt nghiệp

MỤC LỤC
Lời cảm ơn ……………………………………………………………………..i
Nhận xét đánh giá của cán bộ hướng dẫn ……………………………………..ii
Nhận xét đánh giá của cán bộ phản biện ……………………………………..iii
Tóm tắt ……………………………………………………………………….iv
Abstract ………………………………………………………………………..v
Trang cam kết kết quả ………………………………………………………..vi
Mục lục ………………………………………………………………………vii
Danh sách bảng ……………………………………………………………….ix
Danh sách hình ……………………………………………………………….x
Danh mục từ viết tắt ..………………………………………………………..xi
Chương 1: Giới thiệu ………………………………………………………..1
1.1 Đặt vấn đề ………………………………………………………………1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………………………2
1.3 Nội dung nghiên cứu …..……………………………………………….2
Chương 2: Tổng quan tài liệu ………………………………………………3
2.1 Tổng quan về địa y .……………………………………………………3
2.1.1 Tên gọi ……………………………………………………………3
2.1.2 Đặc điểm sinh học …………………………………………………3
2.1.3 Công dụng …………………………………………………………4
2.1.4 Thành phần hóa học ………………………………………………5
2.2 Đại cương về địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi …………8
2.2.1 Tên gọi …………………………………………………………….9
2.2.2 Phân loại thực vật học …………………………………………….9
2.2.3 Đặc điểm hình thái thực vật ……………………………………….9
2.2.4 Phân bố …………………………………………………………..10
2.2.5 Thành phần hóa học ……………………………………………10
2.3 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp thực nghiệm ……………….10
2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn ­ lỏng) ………………………10

2.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng ­ lỏng ……………………………………….. 11
2.3.3 Phương pháp sắc ký cột (sắc ký cột hở) ………………………….11
2.3.3.1 Chọn chất hấp phụ và nhồi cột ………………………………11
2.3.3.2 Nạp mẫu chất cần phân tích vào cột ………………………...12
2.3.3.3 Chọn dung môi và giải ly cột ………………………………..12
2.3.3.4 Theo dõi quá trình giải ly cột ……………………………….13
2.3.4 Sắc ký lớp mỏng …………………………………………………13
2.3.4.1 Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng ………………………………14
vii
Footer Page 9 of 146.


Header Page 10 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

2.3.4.2 Cách hiện hình vết sau khi giải ly bản mỏng ………………..15
2.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thử
nghiệm sử dụng gốc tự do DPPH ………………………………………16
2.3.5.1 Giới thiệu về gốc tự do ……………………………………..16
2.3.5.2 Giới thiệu về gốc tự do DPPH và nguyên tắc của thử nghiệm16
2.3.5.3 Biểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH ……………………….16
Chương 3: Phương pháp nghiên cứu ……………………………………..18
3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện …………………………………...18
3.1.1 Địa điểm và thời gian …………………………………………….18
3.1.2 Dụng cụ ………………………………………………………….18
3.1.3 Hóa chất …………………………………………………………18
3.2 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………..18
3.2.1 Phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên từ thực vật ...…………18
3.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết ……18

3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết
phân lập được ………………………………………………………….19
3.3 Thực nghiệm điều chế các loại cao ...…………………………………19
3.3.1 Thu hái và xử lí mẫu địa y……………………………………….. 19
3.3.2 Điều chế cao methanol tổng ……………………………………..19
3.3.3 Điều chế cao petroleum ether ……………………………………19
3.3.4 Điều chế cao ethyl acetate ……………………………………….20
3.3.5 Điều chế cao nước ……………………………………………….20
3.4 Khảo sát và phân tích cao petroleum ether ……………………………21
3.4.1 Sắc ký cột cao petroleum ether …………………………………..21
3.4.2 Khảo sát phân đoạn III …………………………………………...22
3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y cùng hợp chất
HP1 bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH ……………………….23
3.5.1 Cách tiến hành tổng quát …………………………………………23
3.5.2 Chuẩn bị dung dịch DPPH ………………………………………23
3.5.3 Mẫu đối chứng dương ascorbic acid (vitamin C) ………………..24
3.5.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng methanol .………24
3.5.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và cao nước ...……25
3.5.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc… …………….26
3.5.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1 ……………26
Chương 4: Kết quả vả thảo luận ………………………………………….27
4.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học địa y Dirinaria applanata (Fée) D.
D. Awasthi …………………………………………………………………..27
4.1.1 Biện luận cấu trúc hóa học của hợp chất HP1 ……………………27
viii
Footer Page 10 of 146.


Header Page 11 Luận
of 146.

văn tốt nghiệp

4.1.1.1 Phân tích phổ 1H­NMR của HP1 ……………………………27
4.1.1.2 Phân tích phổ 13C­NMR và DEPT của HP1 …………….28
4.1.1.3 Phân tích phổ HMBC ………………………………………28
4.1.2 Kết luận ….……………………………………………………….29
4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y và HP1 đánh giá bằng
phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH ………………………………………30
4.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid (vitamin C) ………….30
4.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng …………………………..31
4.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao petroleum ether ……………….32
4.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethyl acetate …………………..33
4.2.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao nước ………………………….34
4.2.6 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1: methyl
haematommate ………………………………………………………………35
Chương 5: Kết luận và kiến nghị ………………………………………….36
5.1 Kết luận ………………………………………………………………36
5.2 Kiến nghị ……………………………………………………………..36
Tài liệu tham khảo …………………………………………………………37
Phụ lục ………………………………………………………………………39
Phụ lục 1: Phổ 1H­NMR của hợp chất HP1 ………………………………39
Phụ lục 2: Phổ DEPT của hợp chất HP1 ...……………………………….40
Phụ lục 3: Phổ 13C­NMR của hợp chất HP1 ………………………………41
Phụ lục 4: Phổ HMBC của hợp chất HP1 ...………………………………42

ix
Footer Page 11 of 146.


Header Page 12 Luận

of 146.
văn tốt nghiệp

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình trong sắc ký lớp mỏng ………………14
Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả sắc ký cột cao petroleum ether…………………22
Bảng 3.2: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid… 24
Bảng 3.3: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng………25
Bảng 3.4: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và cao
nước …………………………………………………………………………25
Bảng 3.5: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc …...26
Bảng 3.6: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của HP1 .………….26
Bảng 4.1: Số liệu phổ 1H­NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C­NMR (CDCl3, 125
MHz) của hợp chất HP1 ……………………………………………………..29
Bảng 4.2: So sánh số liệu phổ 1H­NMR và 13C­NMR của hợp chất HP1 và
methyl haematommate trong tài liệu [17]
……………………………………30
Bảng 4.3: Phần trăm ức chế của ascorbic acid theo nồng độ trong từng mẫu
thử …………………………………………………………………………...30
Bảng 4.4: Phần trăm ức chế của cao tổng theo nồng độ trong từng mẫu thử...31
Bảng 4.5: Phần trăm ức chế của cao PE theo nồng độ trong từng mẫu thử ….32
Bảng 4.6: Phần trăm ức chế của cao EtOAc theo nồng độ trong từng mẫu
thử ……………………………………………………………………………33
Bảng 4.7: Phần trăm ức chế của cao nước theo nồng độ trong từng mẫu thử ..34
Bảng 4.8: Phần trăm ức chế của hợp chất HP1 theo nồng độ trong từng mẫu
thử ……………………………………………………………………………35

x
Footer Page 12 of 146.

Header Page 13 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Các hình thái phát triển của địa y …………………………………..3
Hình 2.2: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi ……………………8
Hình 2.3: Cấu tạo địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi……………9
Hình 2.4: Minh họa cách tính Rf …………………………………………….14
Hình 2.5: Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH ..……………………………16
Hình 3.1: Quy trình điều chế các loại cao chiết ……………………………..20
Hình 3.2: SKLM cao petroleum ether ………………………………………21
Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP1 …………………………………….23
Hình 4.1: Tinh thể hợp chất tinh khiết HP1 …………………………………27
Hình 4.2: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ
ascorbic acid …………………………………………………………………31
Hình 4.3: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ
cao tổng ……………………………………………………………………..32
Hình 4.4: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ
cao PE ……………………………………………………………………….32
Hình 4.5: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ
cao EtOAc ..…………………………………………………………………33
Hình 4.6: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ
cao nước ……………………………………………………………………..34
Hình 4.7: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ
HP1 ………………………………………………………………………….35

xi
Footer Page 13 of 146.

Header Page 14 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
13

C­NMR
H­NMR
DEPT
HMBC
Rf
DPPH
IC50
SKLM
PE
EtOAc
Dd
s
C
1

Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
Heteronuclear Multiple­Bond Correlation
Retention factor
1,1­diphenyl­2­picrylhydrazyl

Half maximal Inhibitory Concentration
Sắc ký lớp mỏng
Petroleum ether
Ethyl acetate
Dung dịch
Singlet
Carbon

xii
Footer Page 14 of 146.


Header Page 15 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, trên thế giới xuất hiện nhiều loại bệnh mới và nguy hiểm chưa
tìm được thuốc đặc trị như HIV, ung thư, tiểu đường, xơ vữa động mạch... với
số bệnh nhân ngày càng gia tăng đã thôi thúc các nhà khoa học không ngừng
tìm kiếm, tổng hợp các loại thuốc mới trị liệu tốt hơn. Tuy nhiên, thuốc tổng
hợp ít nhiều đều gây nên những tác dụng phụ không mong muốn, do vậy,
những năm gần đây xu hướng sử dụng các hợp chất tự nhiên (dạng thô, cao
chiết hay hợp chất chiết xuất tinh khiết) có hoạt tính sinh học cao để điều trị
bệnh được các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu và đã mang lại nhiều thành

quả. Điển hình như curcumin (từ nghệ), taxol (từ thông đỏ), viblastin,
vincristin (từ cây dừa cạn) trị ung thư; quinin (từ cây canhkina) và artemisinin
(từ cây thanh hao hoa vàng) điều trị sốt rét...
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thiên nhiên đa
dạng, nguồn động thực vật phong phú dồi dào, vì vậy mà từ ngàn xưa nhân
dân đã biết sử dụng các phương thuốc từ thực vật để chữa nhiều bệnh như sốt,
tiêu chảy, đau nhức, cảm ho... Đây là một lợi thế lớn để nghiên cứu hóa học
hợp chất thiên nhiên, tìm ra các loại dược liệu mới, trong đó địa y là loài thực
vật có tiềm năng. Đặc biệt, nước ta có nguồn địa y phong phú và dồi dào với
275 loài, trong đó có 122 loài lần đầu tiên được báo cáo ở Việt Nam [1]
.
Địa y là loài thực vật cộng sinh giữa tảo và nấm, có thể sống ở nhiều nơi
trên đất, đá, thân cây và trong nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt, khô
hạn hay giá lạnh, từ vùng thấp đến núi cao, cho thấy chúng có tính chống chịu
tốt. Các công trình khảo sát thành phần hóa học của địa y trên thế giới cho
thấy nó chứa một lượng lớn chất biến dưỡng sơ cấp (protein, amino acid,
polyol, carotenoid, polysaccharide và vitamin) và thứ cấp (depside, depsidone,
dibenzofuran, steroid, terpene…, trong đó một số chất đặc thù chỉ có ở địa y)
[2,
3]
. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất từ địa y cũng cho thấy
khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng ung
thư, kháng virus HIV... [3,
4].
Đã có rất nhiều nghiên cứu về mặt hóa học, chuyển hóa và hoạt tính sinh
học của địa y trên thế giới bắt đầu từ thế kỉ XIX. Trong khi đó, ở nước ta với
sự đa dạng về chủng loài nhưng mới chỉ có những nghiên cứu về mặt thực vật
học cùng rất ít nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của địa y. Vì
1
Footer Page 15 of 146.

Header Page 16 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

vậy, đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của
loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi” được chọn là cần thiết
và có ý nghĩa nhằm góp phần tìm hiểu thành phần hóa học, phát hiện các hoạt
tính sinh học đáng quý của địa y và đưa địa y vào sử dụng như một dược liệu
trong việc chữa bệnh.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Trong phạm vi đề tài luận văn “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt
tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D.
Awasthi” gồm các mục tiêu sau:
­ Tách chiết, phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao petroleum ether của
loài địa y này.
­ Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
­ Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn cao chiết và các
hợp chất tinh khiết phân lập được bằng phương pháp sử dụng gốc tự do
DPPH.
1.3 Nội dung nghiên cứu
­ Tìm hiểu, thu thập tài liệu về địa y nói chung và về loài địa y Dirinaria
applanata (Fée) D. D. Awasthi.
­ Thu mẫu địa y tươi, phơi khô, nghiền thành bột mịn.
­ Tiến hành chiết kiệt bột địa y với methanol thu cao tổng.
­ Tiến hành chiết lỏng­lỏng cao tổng với từng loại dung môi có độ phân
cực tăng dần: petroleum ether, ethyl acetate để thu được các phân đoạn cao có

tính phân cực khác nhau.
­ Sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng để khảo sát, phân lập hợp chất tinh
khiết từ cao petroleum ether.
­ Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
­ Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao và các chất tinh khiết
bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH.
­ Tổng hợp, đánh giá kết quả và viết báo cáo.

2
Footer Page 16 of 146.


Header Page 17 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về địa y
2.1.1 Tên gọi
Tên khoa học: Lichene.
Tên tiếng Việt: Địa y.
Tên tiếng Anh: Lichen.
2.1.2 Đặc điểm sinh học
Địa y là nhóm thực vật bậc thấp hình thành do sự cộng sinh giữa hai
thành phần là nấm và một hay nhiều loài sinh vật có khả năng quang hợp,
thường là tảo lục hoặc khuẩn lam. Thành phần quang hợp là tảo tạo ra chất

hữu cơ cho chính nó và cho nấm, còn nấm có nhiệm vụ bảo vệ tảo khỏi các tác
nhân vật lý có hại và cung cấp muối khoáng, nước từ môi trường cho tảo. Nhờ
sự cộng sinh này, địa y có thể thích ứng ở nhiều điều kiện môi trường khắc
nghiệt như núi cao, vùng băng giá hay nhiệt đới và sống trên nhiều thể nền
khác nhau như đất, đá, lá cây, vỏ cây, kim loại… Địa y được phân chia thành
ba dạng hình thái phát triển: dạng khảm (crustose) dính chặt vào giá thể, dạng
phiến (foliose) với nhiều thùy như lá cây và dạng sợi (fruticose) nhiều sợi như
bụi cây [5]
.

Địa y dạng khảm

Địa y dạng phiến

Địa y dạng sợi

Hình 2.1: Các hình thái phát triển của địa y.

Địa y sinh trưởng chậm và sống lâu năm. Phần lớn các loài địa y vùng ôn
đới, cận nhiệt và nhiệt đới tăng trưởng vài milimét tới vài centimét trong một
năm và phát triển mạnh nhất ở vùng khí hậu ẩm ven biển và rừng mưa Bắc
Mỹ. Ở vùng rất lạnh và rất nóng, địa y phải mất hàng thế kỷ để đạt được kích
thước lớn. Địa y rất nhạy cảm với sự ô nhiễm không khí như chất oxy hóa,
SO2, HF…, đã xảy ra hiện tượng địa y biến mất ở các đô thị lớn; vì vậy mà nó
3
Footer Page 17 of 146.


Header Page 18 Luận
of 146.

văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

phản ánh một phần mức độ ô nhiễm không khí. Nguyên nhân là do nguồn dinh
dưỡng của địa y chủ yếu từ môi trường xung quanh, chẳng hạn như nguồn
nước của địa y là từ sương có thể mang theo nhiều chất ô nhiễm và địa y
không thể thải độc qua quá trình rụng lá như các loài thực vật bậc cao cũng
như không có lớp biểu bì nên các chất ô nhiễm có thể xâm nhập vào địa y [6]
.
Mỗi loài địa y có màu sắc đặc trưng nhưng cũng khó phân biệt giữa một
số loài địa y với nhau: cam, vàng chanh tới lục nhạt, xanh vàng nhạt, xám
trắng, xám xanh, xám đen, nâu, đen… Màu sắc cũng là một yếu tố để nhận
dạng loài địa y [7]
.
2.1.3 Công dụng
Trên thế giới, địa y đã được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau, là
dược liệu trong các bài thuốc dân gian, nguyên liệu làm thuốc nhuộm và nước
hoa. Về mặt dược liệu, Cetraria islandica (rêu Island) dùng trị bệnh phổi và
viêm chảy, thuốc từ nó vẫn còn được bán ở châu Âu. Peltigera canina dùng để
ăn ở Ấn Độ là phương thuốc trị bệnh gan và chứa hàm lượng cao amino acid
methionine là tiềm năng cho việc trị bệnh. Về công nghiệp sản xuất nước hoa,
đây là một ứng dụng quan trọng của địa y: Evernia prunastri (rêu oak) và
Pseudevernia furfuracea (rêu cây) được sử dụng ở Pháp với lượng 8000 ­
10000 tấn mỗi năm. Về công nghiệp nhuộm, ngày nay địa y ít được sử dụng,
chỉ còn Parmelia omphalodes được dùng ở Scotland [8]
.
Một số hợp chất từ địa y đã được chứng minh có các hoạt tính sinh học
như [3]
:

­ Kháng sinh: depsides, depsidones và usnic acid chống lại vi khuẩn gam
dương.
­ Kháng ung thư và kháng đột biến gen: (–)­usnic acid, protolichesterinic
và nephrosteranic acid, polyporic và dẫn xuất, physodalic acid, các glucan và
các dẫn xuất lichenin.
­ Kháng HIV: hợp chất muối sulfate của acetyl glucan từ loài địa y
Umbilicaria esculenta (Miyoshi) Mink. ngăn chặn sự phá hoại tế bào của virus
HIV trong ống nghiệm.
­ Ngoài ra, một số hợp chất còn có tác dụng trợ tim (pulvinic acid
dilactone), giảm đau và hạ sốt (usnic và diffractaic acid), gây dị ứng
(atranorin, barbatic, diffractaic…), ức chế enzyme (lecanoric acid, (­)­usnic
acid…) và ức chế sự phát triển của thực vật (psoromic acid, virensic acid, (­)­
usnic acid…).

4
Footer Page 18 of 146.


Header Page 19 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.4 Thành phần hóa học
Địa y là một trong những nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt
tính sinh học quan trọng, nó đã thu hút các nhà hóa học ngay từ giai đoạn đầu
của hóa học hữu cơ. Các khía cạnh hóa học của hợp chất từ địa y đã được
công bố bởi Zopf vào đầu thế kỷ XIX và cấu trúc của hầu hết các hợp chất này
đã được biết đến bởi nghiên cứu của Asahina và Shibata vào đầu thế kỷ XX.

Gần đây, hơn 800 hợp chất từ địa y được phân lập và chia thành nhóm:
aliphatic acid, γ­, δ­ và macrocyclic lactone, hợp chất thơm đơn vòng,
quinone, chromone, xanthone, dibenzofuran, depside, depsidone, depsone,
terpenoid, steroid, carotenoid và diphenyl ether. Trong đó, depside, depsidone
và dibenzofuran chỉ có ở địa y [9
]
. Các chất chuyển hóa thứ cấp hiện diện với
lượng lớn trong địa y và thường dựa vào chúng để phân loại, do địa y khó
phân biệt về mặt hình thái học [3].
Một số nhóm hợp chất chính trong địa y:
2.1.4.1 Acid béo
Ngoài các acid béo thường thấy trong thực vật như caproic acid, caprylic
acid, linoleic acid… địa y còn tích lũy các acid béo với mạch nhánh có 17, 19
hoặc 20 carbon. Các acid béo không bão hòa như arachidonic acid cũng hiện
diện trong địa y. Các monobasic acid đều khởi nguồn từ protolichesterinic acid
(1), một α­methylene butyrolactone. Protolichesterinic acid không bền, dễ
dàng sắp xếp lại tạo thành dạng tautomeric, gọi là lichesterinic acid (2) [10]
.
HOOC

O

O

O

O

1
HOOC

2

2.1.4.2 Dẫn xuất pulvinic acid
Nhiều địa y chứa sắc tố vàng hoặc da cam cấu tạo bởi hai đơn vị
phenylpropane, mà các đơn vị C3 của những acid từ địa y này là isopropyl hơn
là propyl. Vulpinic acid (4), một methyl ester của pulvinic acid (3) cho thấy
tác dụng kháng khuẩn chống lại sinh vật hiếu khí và kị khí [10]
.
CO 2R
OH

3R=H
4 R = Me

O
O

5
Footer Page 19 of 146.


Header Page 20 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Ngoài ra còn có calycin (5), pulvinamide (6),… [11].
O

O

O

OH

O

O

OH
O

O

5

NH2

6

2.1.4.3 Dẫn xuất hydroxybenzoic acid
Ester của 4­hydroxybenzoic acid như methylparaben (7) được dùng làm
chất bảo quản trong dược phẩm, nhanh chóng bị thủy phân trong cơ thể thành
acid và bị đào thải nên độc tính thấp. Do đó, các hợp chất đơn vòng phenol từ
địa y như methyl orsellinate (8), methyl β­orsellinate (9) và methyl
hematommate (10) thể hiện hoạt tính kháng sinh [10]
.
OH

CO2Me
OH

HO

7

OH

OH
CO2Me

Me

CO 2Me

Me

HO

Me

8

OHC

CO2Me

HO

9

Me

10

2.1.4.4 Depside
Depside là nhóm hợp chất tạo thành do sự ngưng tụ của hai hoặc nhiều
hydroxybenzoic acid, trong đó nhóm carboxyl của phân tử thứ nhất ester hóa
với nhóm hydroxyl phenol của phân tử thứ hai. Có hai loại depside, loại chứa
nhóm chức orcinol như orsellinic acid (11), confluentic acid (12)… và loại
chứa nhóm chức β­orcinol như atranorin (13), diffractaic acid (14)… [10].
Me
Me

OH

CO2H

O

COOH

O
HO

OH

OMe

MeO

11

Me

O

12
Me

Me
OH
OHC
HO

CO2Me

O
O
Me

Me

OH
Me

MeO

O
Me

14

13

6
Footer Page 20 of 146.

CO 2H

OMe O

OH
Me


Header Page 21 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.4.5 Depsidone
Depsidone có thêm liên kết ether so với depside chỉ có liên kết ester, tạo
thành cấu trúc vòng cứng nhắc. Các depsidone đều dựa trên cấu trúc vòng
11H­dibenzo[b,e][1,4]dioxepin
­11­one. Depsidone cũng có hai loại như
depside: orcinol depsidone như physodic acid (15), norlobaric acid (16)… và

β­orcinol depsidone như salazinic acid (17), parellic acid (18)… [10].
Me
Me
O O

O
O

O

O

OH

OH

O

O

HO

CO2H

HO

CO 2H

Me

Me

15
Me

16

O

OH

Me

O

O
O

OMe

OH

O

O
HO

HO

O

CHO
HO

Me

CHO HO2C

O

18

17

2.1.4.6 Dẫn xuất của dibenzofuran
Trong nhóm này, những hợp chất phân tử khối nhỏ có cấu trúc usnic acid
được nghiên cứu nhiều nhất. Usnic acid (19) là hợp chất thể hiện hoạt tính
kháng sinh có tiềm lực nhất trong các hợp chất từ địa y, có tác dụng trên rất
nhiều chủng vi khuẩn. Ngoài ra nó còn kháng ung thư, ngăn cản sự phân bào,
có tác dụng hạ sốt và giảm đau [10
]
.
OH

O

O

Me

Me

Me

HO
Me

O

OH

O

19

2.1.4.7 Hợp chất anthraquinone, naphthoquinone và dẫn xuất

7
Footer Page 21 of 146.


Header Page 22 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hợp chất chứa nhân anthraquinone (20) phân bố rộng trong tự nhiên,
hiện diện nổi bật trong thực vật bậc cao và nấm nhưng cũng là thành phần
quan trọng trong địa y. Các hợp chất anthraquinone là tác nhân kháng virus, kể

cả HIV, đặc biệt là hypericin (21) kháng virus phiên mã ngược [10]
.
Napthoquinone là nhóm hợp chất có nguồn gốc từ naphthalene. Đáng
chú ý có naphthazarin (22) có hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư biểu
mô [10]
.
OH

O

OH

HO

Me

HO

Me

20
OH

O

OH

22

21

2.1.4.8 Terpenoid, steroid và carotenoid [11]
Như những loài thực vật khác, địa y cũng chứa các hợp chất terpenoid,
steroid và carotenoid quen thuộc trong hóa học hợp chất thiên nhiên.
Terpenoid gồm có monoterpenoid (camphor, limonene, pinene…),
diterpenoid (phytol, manool…), triterpenoid (amyrin, lupeol, pyxinol…).
Steroid như cholesterol, ergosterol, lichesterol…
Carotenoid như carotene, lutein, neoxanthin…
2.2 Đại cương về địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi

Hình 2.2: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi.

8
Footer Page 22 of 146.


Header Page 23 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.2.1 Tên gọi
Tên khoa học: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi.
Tên gọi khác: Parmelia applanata, Placodium flavostramineum,
Lecanora flavostraminea, Parmelia redacta.
2.2.2 Phân loại thực vật học
Giới: Nấm
Phân giới: Ascomycota
Ngành: Pezizomycotina

Lớp: Lecanoromycetes
Thứ: Lecanorales
Bộ: Lecanorineae
Họ: Physciaceae
Chi: Dirinaria
Loài: Dirinaria applanata
2.2.3 Đặc điểm hình thái thực vật [12]

(Nguồn: />
Hình 2.3: Cấu tạo địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi.

Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi là loài địa y dạng phiến thuộc
chi Dirinaria, một chi rất phổ biến và chiếm đa số ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt với 36 loài trên thế giới.
Loài địa y này phát triển với kích thước rộng khoảng 5 ­ 10 cm. Các thùy
rộng 0,5 ­ 2 mm, dạng lông chim kế tiếp nhau, gấp nếp theo chiều dọc và tỏa
ra ngoài. Bề mặt trên có màu xám, xám xanh, xám vàng hoặc trắng nhạt, có
thể có phủ phấn trắng, có các chồi vảy phát tán bào tử dạng bột. Mặt dưới có
màu đen ở giữa, rìa màu đen hoặc nâu. Đặc trưng của loài địa y này là sự hiện
diện của divaricatic acid.
9
Footer Page 23 of 146.


Header Page 24 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.2.4 Phân bố
Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi phân bố ở vùng nhiệt
đới, cận nhiệt và mở rộng sang cả vùng ôn đới. Chúng phát triển trên thân cây,
gỗ, đá, từ vùng duyên hải đến rừng núi, có mặt ở một số đảo của thái Bình
Dương, châu Úc, châu Mỹ, châu Á và châu Phi [12]
.
2.2.5 Thành phần hóa học
Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi có thành phần chính là
divaricatic acid (23). Ngoài ra, còn có atranorin (13), chloroatranorin, 3β­
acetoxyhopane­1β,22­diol, một số loại terpene… [12] và các thành ần
phcơ
bản của địa y. Không tìm thấy tài liệu cụ thể về thành phần hóa học của loài
địa y này.
Me
OH
O
O
MeO

OH

COOH

Me

23

2.3 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn ­ lỏng)
Kỹ thuật chiết ngâm dầm dùng để lấy các hợp chất tự nhiên ra khỏi thực

vật thô ban đầu.
Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không
gỉ có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của
lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho
dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự
nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi
sẽ có cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục
quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia
tăng hiệu quả chiết bằng cách đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc gắn bình vào
máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bung ra làm dung dịch chiết trào ra ngoài).
Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi
cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa,
không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng

10
Footer Page 24 of 146.


Header Page 25 Luận
of 146.
văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

dung môi. Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm
khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau [13]
.
2.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng ­ lỏng
Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng áp dụng để phân chia cao chiết thô ban đầu
(thường là cao alcol thô) thành các phân đoạn cao có tính phân cực khác nhau.

Nguyên tắc: dung môi có tính phân cực khác nhau sẽ hòa tan tốt các hợp
chất có tính phân cực tương ứng với nó. Phương pháp này dựa trên sự phân bố
của chất tan vào hai pha và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau, thực
hiện bằng bình lóng. Cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước.
Việc chiết được thực hiện lần lượt bằng các dung môi hữu cơ có độ phân
cực tăng dần. Chiết nhiều lần với mỗi loại dung môi, mỗi lần một lượng nhỏ
thể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới chuyển sang dung môi khác. Thu hồi
dung môi được các cao phân đoạn tương ứng [13].
2.3.3 Phương pháp sắc ký cột (sắc ký cột hở)
Sắc ký cột dùng để phân đoạn cao ban đầu thành những phân đoạn cao
nhỏ hơn có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập hợp chất tinh khiết từ một
phân đoạn cao nhỏ.
Sắc ký cột được tiến hành ở áp suất khí quyển. Pha tĩnh là chất hấp phụ
được nhồi trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được nạp lên đầu cột,
phía trên pha tĩnh. Pha động là dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi hữu
cơ với tỉ lệ xác định, di chuyển qua lớp chất hấp phụ dưới tác động của trọng
lực, tùy theo ái lực với pha tĩnh và pha động mà mỗi chất sẽ giải ly ra khỏi cột
trước hoặc sau.
2.3.3.1 Chọn chất hấp phụ và nhồi cột
Thường sử dụng silica gel pha thường với cỡ hạt phù hợp cho phân đoạn
cao hay hỗn hợp chất cần tách, còn silica gel pha đảo dùng khi cần cô lập các
hợp chất phân cực mạnh. Muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp phụ phải
lớn hơn 25 – 50 lần trọng lượng của mẫu chất (tùy vào mục đích của cột) và tỷ
lệ chiều cao chất hấp thu : đường kính trong của cột vào khoảng 10 : 1 [13]
.
Cấu trúc mạng silica gel pha thường:
H
O
O

Si
O

O

11
Footer Page 25 of 146.

H
O
Si
O

O

H
O
Si
O

O