Luận văn tốt nghiệp Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) của thuốc natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn

Header Page 1 of 133.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)
CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT)
LÊN VI KHUẨN
Trung tâm Học Edwardsiella
liệu ĐH Cầnictaluri
Thơ @
liệu họchydrophila
tập và nghiên cứu
VÀTài
Aeromonas

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2008
Footer Page 1 of 133.


Header Page 2 of 133.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)
CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT)
LÊN VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TỪ THANH DUNG
NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2008
Footer Page 2 of 133.


Header Page 3 of 133.

MỤC LỤC
MỤC LỤC ..................................................................................................... 1
DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... 3
DANH SÁCH BẢNG..................................................................................... 4
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................ 5
TĨM TẮT...................................................................................................... 6

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU........................................................................... 7
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 9

Trung tâm

2.1 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra ..................................................................9
2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri.......................................................9
2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E. ictaluri ....................................................................9
2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila .......................................................10
2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila...................................10
2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc....................................................................................10
2.2.3 Hình dạng tế bào .........................................................................................10
2.2.4 Phân bố của Aeromonas hydrophila.............................................................11
2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila .................................................11
2.3 Cây thảo dược ................................................................................................12
2.3.1 Sơ lược về cây thảo dược.............................................................................12
2.3.2 Một vài cây thuốc thảo dược và cơng dụng phịng trị bệnh thủy sản.............12
2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh thủy sản 13
2.4 Natsol.............................................................................................................14
2.5 Chloramphenicol ............................................................................................14
2.6 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thuốc kháng sinh
Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
thảo dược .............................................................................................................14

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................16
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu...................................................................16
3.1.1 Thời gian nghiên cứu...................................................................................16
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................16
3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................16

3.2.1 Hố chất và mơi ttrường ..............................................................................16
3.2.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................16
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm .....................................................................................16
3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm ....................................................................................17
3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................17
3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu.................................................................17
3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn.....................................................................................17
3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh ......................................................18
3.3.2 Thực hiện nghiên cứu ..................................................................................20
3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò .................................................................................20
3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ ................................................................21
3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường thạch
(Lila Ruangpan, 2004): ........................................................................................22
3.3.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp
pha loãng (Geert Huys, 2002):..............................................................................23

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN......................................................25
4.1 Kết quả nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế của thuốc kháng sinh thực
vật natsol lên vi khuẩn gây bệnh trên cá tra ..........................................................25
4.2 Xác định nồng độ MIC ...................................................................................26

Footer Page 3 of 133.

1


Header Page 4 of 133.
4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của thuốc natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A.
hydrophila............................................................................................................27
4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E.

ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp pha loãng.........................................28
4.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A.
hydrophila............................................................................................................28
4.3.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E.
ictaluri .................................................................................................................30
4.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E.
ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp thạch. ..............................................32

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................35
5.1 Kết luận .........................................................................................................35
5.2 Đề xuất...........................................................................................................35

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................36
Phụ lục A: Pha dung dịch nhuộm gram vi khuẩn.......................................41
Phụ lục B: Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn .......................................42
Phụ lục C: Pha môi trường ..........................................................................43
Phụ lục D: Pha nước muối sinh lý và pha môi trường NB .........................44
Phụ lục E: Pha thuốc kháng sinh chloramphenicol và natsol ....................45

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Footer Page 4 of 133.

2


Header Page 5 of 133.

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X (gram âm –

hình que) ........................................... ............................................................10
Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 40X (gram
âm – hình que)................................... ............................................................11
Hình 4.3: Kết quả MIC trên mơi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa
đối chứng (trái), đĩa mơi trường chứa thuốc nồng độ 375ppm (phải)).............34
Hình 4.4: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa
đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 750ppm (phải)).............34

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Footer Page 5 of 133.

3


Header Page 6 of 133.

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương
pháp pha loãng hai lần ...................... ............................................................18
Bảng 3.2: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn
theo phương pháp pha lỗng hai lần ............................................................19
Bảng 3.3: Ni vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi
khuẩn) .. ............................................ ............................................................19
Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi
khuẩn) .. ............................................ ............................................................20
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc
Natsol trên vi khuẩn E. ictaluri......... ............................................................26
Bảng 4.2: Nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc chloramphenicol trên E. coli ...27
Bảng 4.3: Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra độ nhạy của thuốc natsol bằng đĩa

kháng sinh tự chế .............................. ............................................................28
Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh natsol trên vi
khuẩn A. hydrophila ở chủng CAF2 .. ............................................................29

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bảng 4.5: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn A.
hydrophila ở chủng CAF133 ............. ............................................................29

Bảng 4.6: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 6 và 7 ở độ pha loãng 105 trên vi
khuẩn A. hydrophila .......................... ............................................................30
Bảng 4.7: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở
chủng vi khuẩn E.3B3 ....................... ............................................................31
Bảng 4.8: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở
chủng vi khuẩn E.223........................ ............................................................31
Bảng 4.9: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 8 và 9 ở độ pha loãng 104 trên vi
khuẩn E. ictaluri................................ ............................................................32
Bảng 4.10: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila với
các đĩa môi trường 5, 6, 7 ứng với các nồng độ 1500; 750; 375ppm ...............32
Bảng 4.11: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn E. ictaluri với các
đĩa môi trường 6, 7, 8 ứng với các nồng độ 750; 375; 187,5ppm ....................33

Footer Page 6 of 133.

4


Header Page 7 of 133.

LỜI CẢM TẠ
Tôi đặc biệt biết ơn cô Từ Thanh Dung và Nguyễn Thị Như Ngọc đã ân cần

hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài tốt đẹp.
Chân thành cảm ơn cô cố vấn học tập – cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã nhiệt tình
dạy dỗ và dẫn dắt lớp và tôi thời gian qua.
Tôi xin cảm ơn tất cả thầy cơ của Khoa thuỷ sản nói chung và thầy cô của Bộ
môn Sinh học và bệnh thuỷ sản nói chung đã truyền dạy cho tơi những kiến
thức q giá trong suốt 4 năm học vừa qua và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề
tài này.
Cảm ơn bạn bè trong lớp cũng như bạn bè khác lớp đã tận tình trao đổi với tơi
những kiến thức khiếm khuyết và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong q
trình thực hiện đề tài.
Tơi gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã ni dạy tơi và tạo điều kiện cho
tơi ăn học. Tơi có được thành quả như ngày hơm nay thì khơng thể kể hết cơng
ơn trời biển của cha mẹ đã dành cho tôi.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Footer Page 7 of 133.

5


Header Page 8 of 133.

TĨM TẮT
Thí nghiệm thăm dị nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật
natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và xác định được khoảng nồng độ ức chế của
natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 50-100ppm.
Thực hiện nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh
thực vật natsol bằng ba phương pháp:
 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp lập kháng

sinh đồ, nhưng qua thí nghiệm trên thuốc natsol khơng cho kết luận gì.
 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng,
xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E.
ictaluri là 93,75ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 375ppm.
 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp thạch, xác
định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E.
ictaluri là 187,5ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 750ppm.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Footer Page 8 of 133.

6


Header Page 9 of 133.

CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU

Trung

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là lồi cá da trơn nước ngọt được ni
phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Từ những năm 1998-2000
thành cơng trong nghiên cứu “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo và ương
nuôi cá tra thương phẩm” của Khoa Thuỷ sản - Đại học Cần Thơ, đẩy mạnh
phong trào nuôi cá tra thương phẩm phát triển ở vùng ĐBSCL, năng suất và sản
lượng nuôi không ngừng tăng. Theo Dương Nhật Long (2006) thì sản lượng cá
tra năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001 đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000
tấn, năm 2003 đạt 220.000 tấn, năm 2004 đạt trên 300.000 tấn, năm 2005 đã

vượt qua 500.000 tấn. Song bên cạnh mặt thuận lợi còn tồn tại những vấn đề
khó khăn, đó là tình hình bệnh trên cá tra nuôi. Trong nhiều năm qua người
nuôi cá tra bị thiệt hại khá lớn do dịch bệnh xảy ra, như bệnh đốm đỏ, trắng da,
phù đầu phù mắt, bệnh do ký sinh trùng ngoại ký sinh…(Ferguson & ctv,
2001). Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) bệnh trắng gan (còn gọi là bệnh mủ
gan) do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) gây ra là bệnh phổ biến,
xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra, gây thiệt hại nghiêm trọng trong nuôi cá
thâm liệu
canh. Mặt
bệnh
đốm@
đỏ (còn
là bệnh
huyết)
vi khuẩncứu
tâmtraHọc
ĐHkhác,
Cần
Thơ
Tàigọi
liệu
họcxuất
tập
và do
nghiên
Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) gây ra trên nhiều lồi cá nước ngọt
trong đó có cá tra nuôi (Từ Thanh Dung, 2005).
Từ Thanh Dung (1996) cho rằng bệnh vi khuẩn là một vấn đề quan trọng trong
nuôi trồng thuỷ sản, việc điều trị chủ yếu bằng hoá chất hoặc sử dụng thuốc
kháng sinh penicillin, streptomycin, chloramphenicol, oxytetracylin,

tetracylin.... Tuy nhiên sử dụng hố chất phịng và trị bệnh vi khuẩn trong thời
gian dài, đặc biệt là kháng sinh lại gặp nhiều khó khăn, như giá thành các loại
thuốc kháng sinh cao, lại gây ra hiện tượng kháng thuốc của các tác nhân gây
bệnh, làm giảm hiệu quả phịng và trị bệnh về sau. Thêm vào đó là vấn đề ơ
nhiễm mơi trường nước, tích tụ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản…
ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu, nhất là không tốt cho sức khoẻ
người tiêu dùng. Theo Direkbusarakom (1995), một giải pháp phòng trị khác là
sử dụng cây thảo dược điều trị bệnh vi khuẩn trong thuỷ sản, tuy hiệu quả
không nhanh chóng nhưng khắc phục được những khó khăn đã gặp khi sử dụng
hóa chất và thuốc kháng sinh. Vì vậy, ở Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ… kể cả
Việt Nam, một vài cây thảo dược có sẵn trong tự nhiên được dùng làm dược
phẩm cho người và gia súc, cũng được thử nghiệm làm thuốc trị bệnh trong
ngành thuỷ sản (Sivarajan, 1994). Chất chiết cây đậu (Clinacanthus nutans) ức
chế bệnh Yellowhead Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon)

Footer Page 9 of 133.

7


Header Page 10 of 133.

(Direkbusarakom & ctv, 1995). Theo Kamei (1988) cho rằng chiết suất thảo
dược từ cây ổi (Psidium guajava) phòng trị được bệnh vi rút như IHNV, IPNV,
OMV trên cá. Từ Thanh Dung (1996) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của
cây thảo dược lên vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá trê lai
(Clarias macrocephalus x C.gariepinus). Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu
khoa học đề cập đến cách phòng trị bệnh cá tra bằng thảo dược. Vì vậy, để làm
phong phú thêm cho phương pháp điều trị cũng như làm đa dạng danh mục
thuốc phịng trị bệnh cho cá là lý do chính để đề tài “Xác định nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn E.
ictaluri và A. hydrophila” được thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A.
hydrophila và E. ictaluri.
Nội dung nghiên cứu
Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha lỗng và mơi
trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Footer Page 10 of 133.

8


Header Page 11 of 133.

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra
2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri
Theo Hawke & ctv (1981) E. ictaluri là lồi thuộc Enterobacteriaceace, gram
âm, hình que ngắn, kích thước 0,75x1,5-2,5µm, di động yếu ở 25-30 0C, khơng
di động khi nhiệt độ cao hơn. Catalase dương tính, cytochrom oxidase âm tính
và lên men glucose. Khơng sinh H2S và indole âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri
phát triển trên mơi trường TSA (trypton soya agar) chậm 36-48 giờ tại 18-280C.
Giống vi khuẩn Edwardsiella cịn phát triển tốt trên mơi trường BHI (brain
heart infusion) và mơi trường TSA, vi khuẩn có dạng khuẩn lạc nhỏ màu xanh
có nhân đen trên mơi trường EIA (E. ictaluri agar) (Từ Thanh Dung, 2005).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X
(gram âm – hình que)
2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E. ictaluri
E. ictaluri có thể truyền bệnh qua môi trường nước, đất và các động vật khác.
Vi khuẩn E. ictaluri là mầm bệnh nguyên thuỷ trong ngành nuôi cá nheo Mỹ.
Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri được chuẩn đốn ở vùng ni cá da trơn tại
Mississippi, Arkanas, Alabana, Louisiana, Georgia và Florida. Theo Hawke &
ctv (1998), bệnh cũng thường xuyên xảy ra ở Virginia, Texas, Idaho, Kentucky,
California, Arizona và Maryland. Ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất
hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển
mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó, bệnh lây lan sang các
Footer Page 11 of 133.

9


Header Page 12 of 133.

vùng lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số
tỉnh ven biển mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng
(Từ Thanh Dung & ctv, 2004). Bệnh mủ gan chủ yếu xuất hiện trên cá tra (ở tất
cả các giai đoạn phát triển), thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa. Tỷ lệ hao hụt
cao ở cá tra giống, nhưng gây thiệt hại lớn nhất về kinh tế ở giai đoạn cá tra thịt
cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung & ctv, 2004).
2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila
2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila
A. hydrophila là vi khuẩn gram âm hình que, được tìm thấy trong mơi trường

nước, gây bệnh trên động vật có xương sống máu lạnh và động vật hữu nhũ, tồn
tại tự do trong nước (Ho & ctv, 1990). A. hydrophila là mầm bệnh chủ yếu của
động vật thủy sản vùng nước ngọt, động vật trên cạn và kể cả con người (Bùi
Quang Tề, 2006).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 40X
(gram âm – hình que)
2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc
A. hydrophila có thể sống đơn độc trong hầu hết các môi trường. Khuẩn lạc của
vi khuẩn A. hydrophila là những cụm màu vàng, hình trịn, như mặt trăng, nổi
(Từ Thanh Dung, 2005).
2.2.3 Hình dạng tế bào
A. hydrophila có những đặc trưng sau: gram âm, que thẳng, kích thước khoảng
0,5x1,4-4,0µm, có roi ở cực cơ thể, kỵ khí, lên men cacbonat hình thành acid
hoặc khí gas, sản phẩm của 2,3-butandiol, oxydase dương tính, khử nitrat.
(Shotts & Rimler, 1973).

Footer Page 12 of 133.

10


Header Page 13 of 133.

2.2.4 Phân bố của Aeromonas hydrophila
Thông thường, bệnh rất dễ phát sinh do kết quả tương tác giữa vật chủ, mầm
bệnh và môi trường. Mặc dù khi điều kiện mơi trường khơng thích hợp là
ngun nhân chính của tác nhân gây bệnh nhiễm trùng, thì tác nhân ngẫu nhiên

và tác nhân cơ hội chỉ có thể là nguyên nhân mầm bệnh khi cả hai yếu tố tình
trạng sinh lý của vật chủ và điều kiện mơi trường của hệ thống ni khơng
thích hợp (Subasingha, 1995).
Bệnh xuất huyết do A. hydrophila có thể lây truyền qua nước, từ cá bệnh sang
cá khỏe, cá tạp làm thức ăn nhân tạo, và kết hợp động thực vật ký sinh bên
ngoài và bên trong cơ thể (Newman, 1993). Các yếu tố gây sốc như mật độ
nuôi cao, thức ăn thừa, áp suất nước cao, nồng độ oxy hòa tan thấp, nghèo dinh
dưỡng là nguyên nhân cá dễ mắc bệnh (Shotts & ctv, 1972).
Vi khuẩn A. hydrophila tồn tại trong môi trường ni, đặc biệt ở trong nước có
hàm lượng hữu cơ cao (Snieszko & Axelrod, 1971). Vi khuẩn có thể tồn tại bên
ngoài cơ thể cá khỏe (Trust & Sparrow, 1974). Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ độc
của vi khuẩn. Giống A. hydrophila sống đơn độc trong nước lây truyền với hàm
lượng vi khuẩn thấp trong cá bệnh và mồi câu tôm nước ngọt. Một vài chủng vi
khuẩn của A. hydrophila có độc tố ngoại lệ đối với cá, khơng có độc khi vi
khuẩn yếu đi.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
A. hydrophila có thể xâm nhập qua những tổn thương do ký chủ trung gian.
Nhiều trường hợp bệnh bộc phát có liên quan đến yếu tố gây sốc, chẳng hạn
hàm lượng oxy hồ tan thấp kết hợp với khí ammonia và khí cacbonic cao, làm
tăng áp suất nước và nồng độ nitrat. Cá càng trở nên nhạy cảm với A.
hydrophila (Pai & ctv, 1995).
2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila
Triệu chứng của bệnh này giống triệu chứng của các bệnh xuất huyết do vi
khuẩn khác, chỉ khác ở bốn điểm phổ biến: nhạy với độ độc thấp, hình dạng
phù và hình dạng vết loét. Biểu hiện bệnh xuất huyết ở cá chép (Cyprinus
carpio) là những đốm đỏ trên thân, ở cá trê lai thì bị phù (Rogers & Burke,
1981).
A. hydrophila gây bệnh trên nhiều lồi cá: cá lóc (Ophicephalus striatus)
(Bloch), cá trê (Clarias batrachus), cá diếc (Glossogobius giurus) (Hamilton),

cá hồi đốm đen (Oncorhynchus mykiss) (Walbaum) (Lio-Po & ctv, 1992).
Bệnh phù xảy ra ở cá trê lai cỡ nhỏ. Tonguthai & ctv (1993) tìm thấy nguyên
nhân của bệnh này là A. hydrophila, Vibrio sp, và Pseudomonas sp với các triệu

Footer Page 13 of 133.

11


Header Page 14 of 133.

chứng lâm sàng: xuất huyết, phù, sưng tấy ở vây ngực, tác nhân quan trọng nhất
là vi khuẩn A. hydrophila, gây thiệt hại nhiều cho người nuôi thủy sản.
2.3 Cây thảo dược
2.3.1 Sơ lược về cây thảo dược
Thảo dược là những cây có hương thơm ở chồi, lá, hoa, hạt và rễ được dùng
làm hương liệu, gia vị hoặc làm thuốc theo từng mục đích (Eisenbrand & ctv,
1992). Cây thảo dược là một cây mềm, mộng nước, hầu hết phát triển từ hạt,
không phát triển từ thân gỗ, xơ cứng dai. Một vài thảo dược như hương liệu
làm nước giải khát có thể tìm thấy trong tự nhiên nhưng hầu hết thảo dược
được trồng và rất sạch. Chúng được sấy khô và dự trữ làm hương liệu cho năm.
Thảo dược làm thuốc chữa bệnh cả cây hoang dã lẫn cây được trồng đều tốt và
được sấy khô hoặc chế biến kỹ.
Từ xưa đến nay, trong thủy sản đã sử dụng thuốc từ thực vật (Sivarajan & ctv,
1994). Cách đây hàng ngàn năm khai hóa, từ Ai Cập, Trung Quốc, Ấn Độ, Ả
Rập, Ba Tư, các tài liệu đã ghi chép các bằng chứng về sự hiểu biết tinh vi và lý
luận truyền thống với việc trồng những cây thảo dược và cây gia vị.

Trung

Đặc biệt là trong chế biến làm thức ăn, vì chúng giàu dinh dưỡng và có tính sát
cho ĐH
sức khỏe.
trăm
thảo
dược
và gia
đượcnghiên
dùng làmcứu
tâmkhuẩn
Họctốtliệu
CầnHàng
Thơ
@cây
Tài
liệu
học
tậpvị và
thuốc và mỹ phẩm, dùng trong giặt rửa và tắm gội, hun khói trong nhà và theo
mục đích tín ngưỡng (Eisenbrand & ctv, 1992).
Theo Đỗ Tất Lợi (1991) có trên 600 loài cây thuốc ở Việt Nam, Hà (1993) báo
cáo kết quả ban đầu trên cây thuốc là phòng và điều trị được bệnh trên cá và
tôm ở Việt Nam. Hầu hết chiết suất thảo dược cho kết quả chống lại vi khuẩn ở
một vài bệnh cá và tôm nhưng phương thức chiết suất, cơ đặc cho điều trị chưa
hồn thiện.
2.3.2 Một vài cây thuốc thảo dược và cơng dụng phịng trị bệnh thủy sản
+ Cây đinh hương (Eugenia caryophyllus)
Cây đinh hương được sử dụng làm hương liệu kích thích như là vị cay của ớt,
làm gia vị nêm và làm dầu xông hơi. Cây đinh hương dùng làm thuốc chữa
bệnh. Dầu đinh hương dùng trong công nghiệp hương thơm và làm xà phồng,

cũng như làm thuốc giảm đau, đặc trị đau răng (Trease & Evans, 1973).
+ Cây xuyên tâm liên (Andrographus panicullata)
Cây xuyên tâm liên có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu thủng, ức chế vi
khuẩn, tăng cường hiện tượng thực bào của tế bào bạch cầu, dùng trị bệnh viêm
ruột cho cá trắm cỏ (Bùi Quang Tề, 2006)

Footer Page 14 of 133.

12


Header Page 15 of 133.

+ Cây nhọ nồi (Eclipta alba)
Cỏ nhọ nồi có tác dụng cầm máu, khơng gây tăng huyết áp, không làm giản
mạch ở người, điều trị viêm gan (Dixit & Achar, 1979). Eclipta alba có tác
dụng trong điều trị tổn thương gan và vết bổng (Từ Thanh Dung, 1996).
Kết quả thử tác dụng của cao tách chiết thảo dược cao nhọ nồi có tác dụng với
3 vi khuẩn V. harveyi, V. alginolyticus và A. hydrophila (Bùi Quang Tề, 2006).
+ Cây chó đẻ (Phyllathus debilis)
Cây chó đẻ có tác dụng kháng sinh, chữa đinh râu, đau mắt, mụn nhọt… ở
người. Đã thử nghiệm tác dụng kháng sinh với vi khuẩn A. hydrophila, E. tarda
gây bệnh hoại tử ở cá trê, vòng kháng khuẩn 11-20mm (Bùi Quang Tề, 2006).
+ Cây tỏi (Allium sativum)
Kết quả thử cao tách chiết thảo dược từ tỏi có tác dụng với 6 lồi vi khuẩn:
Vibrio parahaemolyticus, V. harveyi, V. alginolyticus, A. hydrophila, E. tarda,
Hafnia alvei) gây bệnh cá nước ngọt, lợ mặn. Tỏi tách chiết thành cao dầu phối
chế thành thuốc chữa bệnh tôm cá, có tác dụng phịng trị bệnh xuất huyết, hoại
tử nội tạng (bệnh đốm trắng) do vi khuẩn cho cá tra nuôi. Kết quả chế phẩm
phối chế từ hoạt chất tách chiết của tỏi và sài đất có tác dụng phòng trị bệnh ăn

mòn vỏ kitin do vi khuẩn Vibrio spp cho tôm nuôi (Bùi Quang Tề, 2006).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh
thủy sản
Từ Thanh Dung (1996) đã kiểm tra tính nhạy của 8 lồi chiết suất thảo dược
trên 6 chủng vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá trê lai (Clarias batrachus
x C.gariepinus). Kết quả chỉ có 2 loại thảo dược nhạy: Phyllanthus debitis (PD)
và Eugenia caryophyllus (EC). Đồng thời đã xác định nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) của cao bột PD là 10.000µg/l, của chiết dầu EC là 1.000µl/l. Căn cứ vào
kết quả MIC và nồng độ gây chết LC50, thử nghiệm được tiến hành trên bể nuôi
để đánh giá khả năng ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng huyết do Aeromonas trên cá
trê bằng cách ngâm vào thức ăn hoặc phương pháp tắm. Đối với EC, dễ dàng
ngâm thuốc vào thức ăn với hàm lượng dưới 10ml/kg thức ăn, vì vậy hàm
lượng EC cơ đặc trong thức ăn là 1ml/kg thức ăn (khoảng giá trị nồng độ nhỏ
nhất MIC). Còn PD, khoảng giá trị MIC trong thức ăn là 10g/kg thức ăn và
khoảng MIC trong phương pháp tắm giảm 10 lần chỉ dùng 1.000µg/ml.
Theo Goujun Yin và ctv (2005) đã kiểm tra ảnh hưởng của 2 loại thảo dược
Astragalus radix và Scutellaria radix lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu ở
cá rô phi (Oreochromis niloticus). Cả Astragalus radix và Scutellaria radix đều
có khả năng điều chỉnh hệ thống miễn dịch bẩm sinh của cá rô phi. Thức ăn
Footer Page 15 of 133.

13


Header Page 16 of 133.

chứa 0,1% và 0,5% Astragalus radix trong 1 tuần đều làm tăng hoạt động của
lisozyme và kích thích thực bào sau 3 tuần, tuy nhiên hoạt động hô hấp của tế

bào thực bào không tăng. Khi cho cá rô phi ăn Scutellaria radix với liều lượng
cao thì hoạt động hơ hấp và thực bào bị ức chế, lisozym khơng hoạt động. Kết
quả thí nghiệm sai khác không đáng kể giữa 2 loại thức ăn với những nồng độ
khác nhau của cả 2 loại cây thảo dược. Liều tốt nhất của Astragalus radix là
0,1% và 0,5% trong 3 tuần. Việc cần làm là xác định liều kích thích và thời
gian cho ăn tốt nhất của Scutellaria radix.
2.4 Natsol
Natsol là chất chiết suất từ cây tự nhiên, là sản phẩm của công ty
BIOFLAVONOIDS. Natsol là dung dịch dạng tinh dầu, trong, hơi vàng như
mật ong.
Natsol có tác dụng ngăn chặn các bệnh khác nhau của vi khuẩn và nấm. Natsol
được mở rộng sử dụng ở Ấn Độ 3 năm trước và thành công trong bước đầu
điều trị bệnh thối chủy, thối mang, cụt phụ bộ. Ngoài ra Natsol cịn dùng điều
trị bệnh vi rút trên tơm cá. Thành phần gồm flavonon sinh học và khơng có
chứa kim loại, hóa chất hay độc tố.
2.5 Chloramphenicol

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh
học hay do con người tổng hợp nên. Có tác động một cách riêng biệt trên một
giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn, nấm và vi rút (Lê Thị
Kim Liên, 2007). Ngoài ra, theo Bùi Thị Tho (2003) cho rằng kháng sinh là
những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn ngừa vi khuẩn
nhân lên bằng tác động ở mức độ phân tử hoặc tác động vào một hay nhiều giai
đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng
lý hóa.
Chloramphenicol là thuốc kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao, nhanh, và
mạnh, đặc biệt phổ kháng khuẩn đã được mở rộng với cả vi khuẩn Gram âm và
Gram dương (Edwardsiella (gram âm) và Aeromonas (gram âm), Pseudomonas
(gram âm), Streptococcus (gram dương)) (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc

Thịnh, 2006).
2.6 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thuốc
kháng sinh thảo dược
Mullika & ctv (2005) tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu
của 19 loại thảo dược (andrographic paniculata, azadirachta indica, barleria
lupulina, carthamus tinctorius, centella asiatica, clinacanthus nutans,
Footer Page 16 of 133.

14


Header Page 17 of 133.

cymbopogon citrates, eupatorium odoratum, garcinia mangostana, hibiscus
sabdariffa, houttuynia cordata, lawsonia inermis, lycopersicon esculentum,
murdennia lorifomis, psidium guajava, senna alata, senna occidentalis, senna
siamea, tagetes erecta) lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và
Staphylococcus epidermidis bằng phương pháp thạch. Kết quả cho thấy 13 loại
thuốc thảo dược có ảnh hưởng đến sự phát triển của hai loài vi khuẩn trên mơi
trường thạch. Trong đó, Garcinia mangostana là thuốc có tác dụng mạnh nhất,
với giá trị MIC nhỏ nhất (39ppm). Điều đặc biệt là giá trị MIC của thảo dược
này trên cả hai lồi vi khuẩn thì bằng nhau. Kumar & ctv (2007) cũng tiến
hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thảo dược lên hai loài vi
khuẩn Probionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis, với 12 loại
thuốc thảo dược hemidesmus indicus, eclipta alba, coscinium fenestratum,
curcubito pepo, tephrosia purpurea, mentha piperita, pongamia pinnata,
symplocos racemosa, euphorbia hirta, tinospora cordyfolia, thespesia
populnea, jasminum officinale. Qua phương pháp thạch có 7 loại thuốc cho kết
quả ức chế sự phát triển của hai lồi vi khuẩn này trên mơi trường thạch. Và
qua phương pháp pha loãng xác định được nồng độ ức chế của Coscinium

fenestratum trên hai loài vi khuẩn này bằng nhau và nhỏ nhất. Giá trị MIC trên
hai loài vi khuẩn là 49ppm.
& ctvĐH
(2005)
kiểm
tra tác
ethylhọc
acetate
n-butanol
chiếtcứu
Trung tâmSupayang
Học liệu
Cần
Thơ
@dụng
Tàicủaliệu
tậpvàvà
nghiên
suất từ vỏ quả Punica granatum lên E. coli O157:H7, E. coli O26:H11, E. coli
O111:NM và E. coli O22 bằng phương pháp thạch. Xác định được giá trị MIC
của cả hai chiết suất này lên E. coli O157:H7 là nhỏ nhất (50ppm). Giá trị MIC
của ethyl acetate chiết suất từ Centaurea lên vi khuẩn Staphylococcus aureus là
62,5ppm, thấp hơn so với giá trị MIC của chloramphenicol (125ppm), nghĩa là
ethyl acetate có tác dụng mạnh hơn chloramphenicol lên vi khuẩn
Staphylococcus aureus (Kiymet & ctv, 2005).
Chiết suất methanol và acetone từ nhiều cây nấm có tác dụng trên vi khuẩn
baccilus cereus, Staphylococcus aureus, listeria monocitogenes, Escherichia
coli, salmonella infantis. Qua phương pháp pha loãng xác định được khoảng
giá trị MIC của các chiết suất này từ 165-2640mg/ml. B. cereus nhạy với hầu
hết các chiết suất từ cinnamomum cassia, azadirachta indica, ruta graveolén,

rumex nervosus với khoảng MIC từ 165-660mg/ml.
Chiết suất từ
Cinnamomum cassia chỉ có hiệu quả trên vi khuẩn E.coli, S. infantis ở giá trị
MIC cao nhất (2640mg/ml) (Mohan & ctv, 2004).

Footer Page 17 of 133.

15


Header Page 18 of 133.

CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu: Bắt đầu từ tháng 04/2008 đến tháng 05/2008
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm bộ mơn sinh học và bệnh thuỷ
sản, khoa Thuỷ sản, trường đại học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Hố chất và mơi ttrường


Trung

Mơi trường nuôi cấy vi khuẩn: nutrient agar (NA, Merck), nutrient broth
(NB, Merck), muller hinton agar (MHA, Merck).

Các loại hoá chất nhuộm Gram: dd I (ammonium oxalate, crystal violet),
dd II (iodine), dd III (cồn tuyệt đối, ethanol (Merck)), dd IV (safranin).


NaCl.

Dầu xem kính hiển vi.

Glycerol.
tâm Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Nước cất.
3.2.2 Thuốc kháng sinh



Thảo dược: natsol.
Chloramphenicol.

3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm









Footer Page 18 of 133.

Que cấy, pel, khay nhựa, bình xịt cồn, giấy vệ sinh, bút lơng, kính hiển vi,
lame, đèn cồn, hột quẹt.
Cốc thuỷ tinh, lọ thuỷ tinh, que trãi thuỷ tinh, đĩa petri, ống đong, ống

nghiệm.
Pipet 1-5ml, 100-1000µl, 10-100µl, 5-40µl.
Đầu col 5ml, 1ml, 100µl; ống falcon 50ml thanh trùng.
Cân điện tử, nồi thanh trùng, máy li tâm, máy so màu quang phổ, cuvette
3ml, máy lắc, máy trộn mẫu, máy đếm khuẩn lạc.
Giấy lọc làm đĩa kháng sinh.
Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, tủ cấy, nồi chưng cất (water-bath).
Máy ảnh, sổ ghi chép theo dõi hàng ngày.

16


Header Page 19 of 133.

3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm
Vi khuẩn E. coli LMG8223 từ nguồn Đại học Ghent, vương quốc Bỉ.
Vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila được phân lập trên cá tra, nguồn cung cấp
từ Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. Tất
cả vi khuẩn được trữ ở -800C trong môi trường BHI lỏng + glycerol.
Hai chủng vi khuẩn E. ictaluri: E.223 và E.3B3
Hai chủng vi khuẩn A. hydrophila: CAF2 và CAF133
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu
3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn
Nuôi cấy và phục hồi vi khuẩn

Trung

Vi khuẩn trữ được phục hồi bằng cách cho vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10ml
dung dịch NB lỏng, ủ trong tủ ấm 28-300C hoặc lắc đều trên máy lắc (200

vịng/phút) 18-24 giờ, rồi cấy sang đĩa mơi trường kiểm tra tính thuần (dựa vào
các chỉ tiêu về hình thái: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, kết quả nhuộm gram).
Hai loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila được cấy phục hồi và tách ròng
tâmtrên
Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
môi trường thạch NA, ủ ở 280C trong 24 giờ đối với A. hydrophila và 48
giờ đối với E. ictaluri. Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường
NB lỏng, ủ trong tủ ấm ở 280C hoặc lắc đều trên máy lắc từ 18-24 giờ (Rahman
& Kawai, 2000).
Ly tâm vi khuẩn
Cho vi khuẩn vào ống falcon 50 ml, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút, ly tâm
trong 15 phút, sử dụng nước muối sinh lý (0,85% NaCl) tiệt trùng để rửa vi
khuẩn. Lặp lại thao tác 2 – 3 lần. Sau lần ly tâm cuối cùng cho môi trường NB
vào và trộn đều mẫu.
Xác định mật độ vi khuẩn
Ly tâm xong, cho môi trường NB vào đánh tan phần vi khuẩn lắng, rồi tiến
hành so màu bằng máy so màu quang phổ. Mật độ vi khuẩn được đo bằng máy
so màu quang phổ ở bước sóng 590nm, với OD=0,1±0,02 tương đương với mật
độ vi khuẩn A. hydrophila là 1x108cfu/ml và OD=0,01±0,002 tương đương
vớimật độ vi khuẩn E. ictaluri là 1x107cfu/ml (Lương Trần Thục Đoan, 2006).
Sau đó mỗi chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường NA để kiểm tra thao tác
kỹ thuật chuẩn bị dung dịch vi khuẩn trước khi thực hiện nghiên cứu.

Footer Page 19 of 133.

17


Header Page 20 of 133.

3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh
Natsol: được cung cấp từ công ty BIOFLAVONOIDS của Ấn Độ. Chuẩn bị
dung dịch gốc (stock) Natsol như sau: hòa tan 5ml Natsol trong 100ml nước cất
được nồng độ 50000µl/l, sau đó pha lỗng theo phương pháp pha lỗng hai lần
(double dilution method) để được các nồng độ 24000; 12000; 6000; 3000;
1500; 750; 375;187,5; 93,75; 46,875 và 26,4375µl/l (Bảng 3.1). Trong đó, các
nồng độ 24000ppm và 1500ppm được pha từ nồng độ 50000ppm.
Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương
pháp pha loãng hai lần
Ống

Nồng độ cần pha

nghiệm

(ppm)

Thể tích

Thể tích

thuốc kháng sinh natsol

nước cất

(ml)

(ml)

1

24000

6 (50000ppm, dung dịch gốc 1)

6

2

12000

6 (24000ppm)

6

3

6000

6 (12000ppm)

6

4

3000

6 (6000ppm)

6

5 liệu ĐH1500
(3000ppm,
dunghọc
dịch tập
gốc 2)và nghiên
6
Trung tâm Học
Cần Thơ6@
Tài liệu
cứu
6

750

6 (1500ppm)

6

7

375

6 (750ppm)

6

8

187,5

6 (375ppm)

6

9

93,75

6 (187,5ppm)

6

10

46,875

6 (93,75ppm)

6

11

23,4375

6 (46,875ppm)

6

* Chú ý:







Footer Page 20 of 133.

Ống nghiệm có nồng độ thuốc 24000 và 1500ppm sẽ được pha loãng từ
dung dịch gốc 50000ppm với natsol và ở chloramphenicol thì các nồng độ
512 và 128ppm pha lỗng từ dung dịch gốc 1.024ppm (Bảng 3.3).
Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các nồng độ tiếp theo.
Nồng độ thuốc sẽ giảm đi phân nửa khi cho dung dịch vi khuẩn vào.
Ghi tên thuốc và nồng độ thuốc trước khi bắt đầu thí nghiệm.
Phải lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo.
Điều cần chú ý là ở mỗi nồng độ pha loãng, hàm lượng thuốc giảm đi
phân nửa sau khi cho dung dịch vi khuẩn vào (Bảng 3.2 và Bảng 3.4).
18


Header Page 21 of 133.

Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc natsol khác nhau (cho 1 chủng
vi khuẩn)
Ống
MIC

Nồng độ thật thuốc natsol

(ppm)

Thể tích
thuốc natsol
(ml)

Thể tích
vi khuẩn
(ml)

1

12000

2 (24000ppm, ống 1)

2

2

6000

2 (12000ppm, ống 2)

2

3

3000

2 (6000ppm, ống 3)

2

4

1500

2 (3000ppm, ống 4)

2

5

750

2 (1500ppm, ống 5)

2

6

375

2 (750ppm, ống 6)

2

7

187,5

2 (375ppm, ống 7)

2

8

93,75

2 (187,5ppm, ống 8)

2

9

46,875

2 (93,75ppm, ống 9)

2

10

23,4375

2 (46,875ppm, ống 10)

2

11

11,72875

2 (23,4375ppm, ống 11)

2

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bảng 3.3: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn
theo phương pháp pha loãng hai lần

Footer Page 21 of 133.

Ống
nghiệm

Nồng độ cần pha
(ppm)

1

1024

2

512

3

256

4

128

5
6
7
8
9

64
32
16
8
4

Thể tích
thuốc kháng sinh
chloramphenicol
(ml)
5 (1024ppm,
dung dịch gốc 1)
5 (512ppm)
5 (256ppm,
dung dịch gốc 2)
5 (128ppm)
5 (64ppm)
5 (32ppm)

5 (16ppm)
5 (8ppm)

Thể tích
nước muối sinh lý
(ml)

5
5
5
5
5
5
5
5

19


Header Page 22 of 133.

Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc chloramphenicol khác nhau
(cho 1 chủng vi khuẩn)
Ống
MIC

Thể tích thật thuốc kháng sinh
chloramphenicol (ppm)

Thể tích

Thể tích

thuốc kháng sinh

vi khuẩn

(ml)

(ml)

1

512

2 (1024ppm, ống 1)

2

2

256

2 (512ppm, ống 2)

2

3

128

2 (256ppm, ống 3)

2

4

64

2 (128ppm, ống 4)

2

5

32

2 (64ppm, ống 5)

2

6

16

2 (32ppm, ống 6)

2

7

8

2 (16ppm, ống 7)

2

8

4

2 (8ppm, ống 8)

2

9

2

2 (4ppm, ống 9)

2

Trung tâmChloramphenicol
Học liệu ĐH(Oxiod).
Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Chuẩn bị dung dịch gốc chloramphenicol: Pha 2 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi
ống 50 ml (là thuốc kháng sinh) (ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024 ppm
và ống thứ 2 có hàm lượng thuốc là 256 ppm). Thuốc phải được pha bằng dung
môi phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

Pha thuốc với độ pha loãng 2 lần từ 4-1024 ppm trong ống nghiệm 50ml (Bảng
3.2). Hàm lượng thuốc 512 ppm và 256 ppm được pha từ ống thuốc gốc thứ
nhất (1024 ppm) bằng cách thêm nước muối sinh lý. Hàm lượng thuốc 128, 64,
32, 16, 8 và 4 ppm được pha từ ống gốc thứ 2 (256 ppm).
3.3.2 Thực hiện nghiên cứu
3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò
Tiến hành nghiên cứu thăm dò gồm các bước như sau:
Chuẩn bị dung dịch gốc natsol: thí nghiệm thăm dị nồng độ thuốc natsol trên
vi khuẩn E. ictaluri với chủng E.223 được tiến hành từ nồng độ gốc
(50000ppm) pha loãng các nồng độ: 10000; 8000; 6000; 5000; 4000; 3000;
2000; 1000; 500; 400; 300; 200; 100; 50; 45; 40; 35; 30; 25; 20; 15 và 10ppm.
Pha nồng độ 50000ppm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Footer Page 22 of 133.

20


Header Page 23 of 133.

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1)
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xác định MIC bằng phương pháp
pha loãng
Cho 2 ml vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml thuốc kháng sinh với các
nồng độ 10-10000ppm.Tất cả các ống nghiệm và đĩa cấy kiểm tra ủ với điều
kiện nhiệt độ 28-30oC. Sau 24 giờ đọc kết quả các ống MIC: so sánh độ đục
giữa các ống MIC. Kiểm tra khoảng ống MIC có độ đục khó phân biệt bằng
cách kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên đĩa petri môi trường thạch. Tuỳ
theo từng độ đục khác nhau mà ta có thể pha lỗng theo nồng độ giảm dần sao
cho có thể dễ dàng đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Chọn nồng độ nào có mật
độ vi khuẩn thấp nhất (giảm 80% so với mật độ vi khuẩn gốc) là nồng độ ức

chế tối thiểu (MIC).. Vì sau 24 giờ chưa đủ thời gian cho vi khuẩn E. ictaluri
phát triển trên đĩa mơi trường. Do đó, ghi nhận kết quả các ống MIC sau 24 giờ
rồi ủ lại trong tủ ấm, để đủ 48 giờ đọc kết quả các ống MIC lại cùng với đĩa
môi trường vi khuẩn E. ictaluri.
3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Kiểm tra độ nhạy của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng đĩa
kháng sinh natsol, gồm các bước sau:

Trung tâmChuẩn
Họcbịliệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
dung dịch gốc natsol (như 3.3.1.2)
Chuẩn bị đĩa kháng sinh thảo dược:
Chuẩn bị đĩa kháng sinh: sử dụng giấy lọc và tạo thành những khoanh giấy trịn
nhỏ (sử dụng dụng cụ bấm giấy) có đường kính tương đương với đĩa kháng
sinh thương mại (6mm). Dùng giấy nhơm gói những đĩa giấy và mang đi tiệt
trùng khoảng 2 giờ ở 180 0C.
Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh: dùng chai tiệt trùng pha thuốc kháng sinh
với nồng độ tương tự đĩa kháng sinh thương mại. Lấy khoảng 50 đĩa giấy tiệt
trùng cho vào 10ml dung dịch thuốc kháng sinh, ngâm khoảng 24 giờ (hoặc
ngâm qua đêm). Sau 24 giờ ngâm đĩa, dùng pel tiệt trùng nhặt từng đĩa thuốc
kháng sinh chuyển qua đĩa petri tiệt trùng để đĩa khơ ở điều kiện nhiệt độ
phịng, sau đó cho vào chai lọ tiệt trùng giữ 4 - 6oC và có thể sử dụng lâu dài.
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1)
Lập kháng sinh đồ
Dùng pipet tiệt trùng hút lần lượt 0.2ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường
thạch MHA. Dùng que trãi thủy tinh tiệt trùng trãi đều đến vừa khơ. Sau đó để
n khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa
Footer Page 23 of 133.

21


Header Page 24 of 133.

petri sao cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24mm
và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri 10-15mm. Mỗi đĩa
môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh.
Tất cả các nồng độ thuốc được kiểm tra lặp lại 2-3 lần và ủ ở 280C. Đọc kết quả
sau 48 giờ đối với vi khuẩn E. ictaluri, sau 24 giờ đối với vi khuẩn A.
hydrophila và đo đường kính vịng vơ trùng. Vùng ức chế là đường kính vịng
vơ trùng ủ 24-48 giờ sai khác gần nhất ở các lần lặp lại.
3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi
trường thạch (Lila Ruangpan, 2004):
Xác định nồng độ MIC của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
bằng phương pháp thạch theo Lila Ruangpan (2004), nhưng có điều chỉnh do
điều kiện phịng thí nghiệm khơng có đủ dụng cụ để hồn chỉnh thí nghiệm như
phương pháp. Phương pháp thí nghiệm gồm các bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch kháng sinh thực vật natsol (như 3.3.1.2)

Trung

Bước 2: Chuẩn bị hai loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila. Vi khuẩn cũng
được phục hồi, nuôi cấy và nuôi tăng sinh, ly tâm và điều chỉnh mật độ bằng
máy so màu quang phổ (như 3.3.1.1). Sau đó pha lỗng dung dịch vi khuẩn vừa
điều chỉnh theo phương pháp pha loãng 10 lần để được mật độ khoảng 105-10 6
tâmcfu/ml
Họcvàliệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
cấy kiểm tra thao tác chuẩn bị dung dịch vi khuẩn.

Bước 3: Chuẩn bị mơi trường có thuốc kháng sinh
Môi trường MHA được tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, được giữ ấm 40-45 0C
trong nồi chưng cất (water – bath). Cho thuốc kháng sinh vào môi trường MHA
vào đĩa theo tỷ lệ 1:1, lắc thật nhẹ và đều (để thuốc hồ tan đều trong mơi
trường đồng thời không tạo bọt). Đổ ra môi trường đĩa petri đã được tiệt trùng
kỹ. Tất cả thao tác chuẩn bị được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Bước 4: Đọc kết quả: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc
kháng sinh thảo dược natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
Mỗi đĩa được chia làm hai phần ứng với hai chủng vi khuẩn của một loài vi
khuẩn. Nhỏ 5 µl vi khuẩn vào phần đĩa ứng với chủng vi khuẩn đó. Dùng que
cấy trải mỏng giọt vi khuẩn và lật đĩa lại, ủ ở 28-300C trong 24 giờ đối với vi
khuẩn A. hydrophila và 48 giờ với E. ictaluri. Kết quả được tính là số khuẩn lạc
phát triển của vi khuẩn sống sót. Ở bất kỳ nồng độ nào vi khuẩn sống sót khơng
q 20% thì được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Footer Page 24 of 133.

22


Header Page 25 of 133.

3.3.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương
pháp pha loãng (Geert Huys, 2002):
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của natsol bằng môi trường NB lỏng lên vi
khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila, có thay đổi các bước:
Bước 1: Chuẩn bị mơi trường hóa chất, hóa chất

Mơi trường NB, NA tiệt trùng.


Nước muối sinh lý tiệt trùng, nước cất tiệt trùng.

Ống nghiệm tiệt trùng, đầu col tiệt trùng.
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch thuốc natsol và dung dịch thuốc kháng sinh
chloramphenicol (như 3.3.1.2)
Bước 3: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn



Trung

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1)
Thao tác thực hiện: Cho 2 ml vi khuẩn đã điều chỉnh mật độ vào mỗi ống
nghiệm có hàm lượng thuốc từ 4ppm - 1024ppm và 23,4375ppm 24000ppm.

Lưu ý: Không nên cho vi khuẩn vào thuốc lâu hơn 1 giờ sau khi đo mật độ
vi khuẩn. Lắc đều dung dịch vi khuẩn trước khi cho vào ống nghiệm có
thuốc. Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28 oC - 30oC trong 24 giờ (hoặc lâu
tâm Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
hơn đến khi nào thấy vi khuẩn trong ống đối chứng dương phát triển).

Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ phải được cấy lên môi
trường NA để kiểm tra sự thuần chủng và phải được ủ trong cùng điều
kiện với các ống MIC.

Mỗi thí nghiệm cần có hai đối chứng:
+ Đối chứng âm (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl))
+ Đối chứng dương (2ml vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý (0,85%
NaCl))


Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28 0C, trong 18 - 24 giờ.
Bước 4: Đọc kết quả




Footer Page 25 of 133.

Kiểm tra sự thuần chủng của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA.
Nếu phát hiện có sự tạp nhiễm thì khơng đọc kết quả MIC.
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của
mỗi ống MIC với ống đối chứng âm.
Loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển khơng liên tục thì loại
bỏ, khơng lấy kết quả, thực hiện lại thí nghiệm (ví dụ: vi khuẩn phát triển
ở ống 5 & 7 nhưng không phát triển ở ống 6).

23