Xác định thành phần loài và một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt naman vietnam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

ĐỖ NGỌC ÁNH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA
SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Ký sinh trùng Y học
Mã số: 62 72 01 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2017


Công trình hoàn thành tại
HỌC VIỆN QUÂN Y

Cán bộ hƣớng dẫn khoa hoc:
1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực
2. PGS.TS. Trần Thanh Dƣơng

Phản biện 1: PGS.TS. Lê Thanh Hòa
Cơ quan: Viện CNSH, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS. Đoàn Huy Hậu
Cơ quan: Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng

Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại

Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng vào hồi
……..giờ, ngày……..tháng……năm……

Có thể tìm thấy luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Thƣ viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) ở người và động vật do Fasciola hepatica
(Linnaeus, 1758) và Fasciola gigantica (Cobbold, 1885) gây ra. Đây là bệnh nhiệt
đới bị lãng quên, lây truyền từ động vật sang người thông qua đường thực phẩm.
Trong 25 năm qua, toàn thế giới có khoảng 17 triệu người mắc bệnh và 180 triệu
người sống trong vùng nguy cơ nhiễm SLGL. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít
nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL.
F. hepatica và F. gigantica có thể được phân biệt dựa vào hình thái nhưng
phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế. Dạng trung gian (Fasciola sp.) với
hình thái và kiểu gen hỗn hợp của F. hepatica và F. gigantica, xuất hiện ở nhiều
nơi trên thế giới bao gồm Việt Nam, rất khó xác định loài bằng hình thái. Vì vậy,
ở những nơi tồn tại dạng trung gian, trong giám định loài SLGL, bên cạnh
phương pháp hình thái học, ứng dụng sinh học phân tử là rất cần thiết.
Hiện nay, dữ liệu hình thái và phân tử của SLGL ở Việt Nam còn rất hạn chế.
Vì vậy, nghiên cứu về hình thái và phân tử của SLGL là rất cần thiết. Đó là lý do
chúng tôi tiến hành đề tài “
t
v
ts

s
t
s
t
t
.
2. Mục tiêu nghiên cứu
1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam
bằng phương pháp hình thái học.
2. Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá
gan lớn ở Việt Nam.
3. Tính khoa học, tính mới và tính thực tiễn của đề tài
- Bằng việc kết hợp hình thái học và sinh học phân tử với cả gen nhân và gen
ty thể để nhận dạng, xác định loài SLGL thập tại các vùng địa lý khác nhau ở Việt
Nam nên các kết quả giám định loài khách quan, chính xác, tin cậy.
- Đề tài đã chỉ ra được SLGL ở Việt Nam có tính đa hình về hình thái và di
truyền với F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. cùng tồn tại ở cả 3 khu
vực địa lý và các vật chủ khác nhau.
- Bước đầu chỉ ra được tần suất của F. gigantica và dạng trung gian Fasciola
sp. ở Việt Nam mà trước đó chưa nghiên cứu nào công bố.
- Cung cấp dữ liệu ban đầu, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tìm hiểu
những khác biệt về bệnh học, đáp ứng miễn dịch… ở vật chủ nhiễm F. gigantica
và dạng trung gian Fasciola sp.
4. Bố cục luận án
Luận án gồm 151 trang, gồm: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (36
trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (29 trang); Kết quả nghiên cứu (43
trang); Bàn luận (36 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); 40 bảng số
liệu, 29 hình và 146 tài liệu tham khảo.

2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sán lá gan lớn Fasciola spp. và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis)
1.1.1. Đặc điểm sinh học của Fasciola spp.
- Các loài sán lá gan lớn và phân bố của chúng
Sán lá gan lớn (SLGL) thuộc ngành giun dẹt, lớp sán lá, giống Fasciola. Hiện
tại, giống Fasciola gồm có 4 loài: F. hepatica (Linnaeus, 1758), F. gigantica
(Cobbold, 1855), F. nyanzae (Leiper, 1910) và F. jacksoni (Cobbold, 1869).
Trong đó, F. hepatica và F. gigantica là 2 loài gây bệnh chủ yếu ở người và động
vật. F. hepatica phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, trong khi F. gigantica phân
bố chủ yếu ở khu vực có khí hậu nhiệt đới như Châu Á, Châu Phi.
- Đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn
Hì t sán trườ t
: F. hepatica trưởng thành có kích thước 8 - 15 x 20 –
30 mm. F. gigantica khá giống F. hepatica, tuy nhiên chiều dài có thể tới 75 mm.
F. gigantica thường thon và dài, trong khi F. hepatica thường ngắn và rộng.
Hì t trứ : Trứng F. hepatica rất giống với trứng của F. gigantica. Trứng F.
hepatica (150 x 90 μm) nhỏ hơn trứng của F. gigantica (200 x 100 μm).
- Vòng đời sinh học: Vòng đời của SLGL rất đặc biệt trong lớp sán lá. Chúng chỉ
có 1 vật chủ phụ là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trước khi
nhiễm vào vật chủ theo con đường ăn uống. Trong khi đó, hầu hết các loại sán lá
khác vòng đời qua 2 vật chủ phụ trước khi xâm nhập vào vật chủ chính.

Hình 1.2. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn
- Các yếu tố ảnh hƣởng tới vòng đời của sán lá gan lớn
Sự phát triển các giai đoạn vòng đời của SLGL phù thuộc rất nhiều vào các
điều kiện môi trường và vật chủ trung gian. Trung gian truyền bệnh SLGL là các
loài ốc thuộc họ Lymnaeidae. Sự phân bố của các loài ốc là vật chủ trung gian
hoàn toàn phù hợp với sự phân bố của SLGL. Ở Việt Nam, 2 loài ốc nước ngọt

Lymaea viridis và Lymaea swinhoei được xác định là vật chủ trung gian chủ yếu
của SLGL.


3

- Quá trình sinh sản, vấn đề lai và chuyển gen ở sán lá gan lớn
Theo K. Cwilinski và CS (2016), SLGL 3 hình thức sinh sản: tự giao phối,
giao phối chéo và sinh sản vô tính. Các hình thức sinh sản này gặp cả ở trong tự
nhiên và trên thực nghiệm. Ở một số quốc gia như Nhật Bản, Việt Nam và Hàn
Quốc, dạng trung gian Fasciola sp. với các các thể mang kiểu gen pha trộn của 2
loài hoặc các cá thể lai với gen nhân của loài này còn gen ty thể của loài kia đã
được xác định (còn gọi là các cá thể chuyển gen). Dạng trung gian cũng được ghi
nhận gây bệnh ở cả người và động vật.
1.1.2. Triệu chứng, chẩn đoán bệnh do Fasciola spp.
- Triệu chứng lâm sàng: Các triệu chứng của bệnh do SLGL ở người thường xuất
hiện sau khi bị nhiễm ấu trùng 2 tuần và phụ thuộc vào số lượng sán ký sinh. Bệnh
được chia làm 4 thời kỳ: ủ bệnh, toàn phát, tiềm tàng và mạn tính. Thời kỳ toàn phát
với những biểu hiện rõ ràng nên bệnh nhân thường đi khám và được phát hiện
bệnh. Thời kỳ này kéo dài 2 - 4 tháng với các triệu chứng cơ năng thường gặp là:
sốt, đau bụng vùng hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, nổi mề đay, gan lách to…
- Đặc điểm cận lâm sàng: Các xét nghiệm có giá trị chẩn đoán là: tăng bách cầu
ái toan trên 5 %, có khi lên đến 83 %; Siêu âm gan thấy tổn thương hình tổ ong.
Xét nghiệm ELISA máu dương tính với kháng thể kháng sán lá gan; Tìm trứng có
giá trị chẩn đoán quyết định nhưng tỷ lệ dương tính rất thấp (< 5 %).
1.2. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở ngƣời và động vật
- Trên thế giới: Nhiễm SLGL ở động vật ăn cỏ rất phổ biến trên toàn thế giới, tỷ
lệ nhiễm trung bình từ 30 % đến 50 %. Ở người, theo Mas-Coma S. và CS (2004),
trên toàn thế giới có khoảng 2,4 đến 17 triệu người có nguy cơ nhiễm SLGL, tập
trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít nhất

2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL.
- Ở Việt Nam: Theo một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu, bò
dao động trong khoảng từ 30 đến 60%. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu thường cao hơn
ở bò và mùa mưa tỷ lệ nhiễm thường cao hơn mùa khô. Ở người, theo Đặng Thị
Cẩm Thạch (2008), tính đến tháng 3 năm 2008 số bệnh nhân nhiễm SLGL là > 5.000
người. Còn theo Nguyễn Văn Đề và CS (2012), tính đến năm 2012, bệnh SLGL ở
Việt Nam lưu hành ở ít nhất 52 tỉnh/thành với số người mắc > 20.000 người.
1.3. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola spp.
1.3.1. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola sp.
2 phương pháp xác định loài chủ yếu được sử dụng là hình thái học và sinh học
phân tử dựa trên các chỉ thị phân tử gen ty thể và gen nhân tế bào.
* Phƣơng pháp hình thái học
Theo Periago và CS (2008), dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW),
SLGL được phân loại thành: nhóm giống với F. hepatica (1,65 - 2,76), nhóm
giống F. gigantica (3,43 - 5,50) và nhóm Fasciola sp. (2,77 - 3,42).
Theo Srimuzipo P. và CS (2000), dựa vào chiều dài SLGL được chia làm 3 nhóm:
nhóm nhỏ (< 25 mm), nhóm trung bình (25 - 35 mm) và nhóm lớn (> 35 mm).


4

* Phƣơng pháp sinh học phân tử
RFLP-PCR và giải trình tự là các công cụ thường được lựa chọn. Các chỉ thị
cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể, các vùng giao gen ITS1, ITS2 và 28S thuộc hệ
gen nhân thường được sử dụng. Simsek và CS (2011) đã sử dụng gen cox1 và các
enzyme RsaI và AluI để phân biệt F. gigantica và F. hepatica. Ichikawa M và CS
(2010) sử dụng vùng gen chứa đoạn giao gen ITS1 và enzyme RsaI để phân biệt
F. hepatica, F. gigantica và dạng trung gian. Dạng trung gian được xác định có
nhiều bất thường cả về hình thái và phân tử theo hướng phù hợp với cả 2 loài nên
khó có thể xếp loại là F. hepatica hay F. gigantica. Vì thế, Mas-Coma và CS

(2009) cho rằng, nếu chỉ dựa vào một trong 2 hệ gen nhân hoặc hệ gen ty thể để
giám định loài SLGL sẽ không chính xác mà cần kết hợp cả 2 hệ gen.
1.3.2. Tính đa hình di truyền di truyền ở sán lá gan lớn
- Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen ty thể: Tính đến hết năm 2016, đã
có 5 hệ gen ty thể hoàn thiện của SLGL được giải mã và công bố trên ngân hàng
gen. Chiều dài toàn bộ hệ gen ty thể của Fasciola sp. là 14453 bp, F. hepatica
14462 bp và F. gigantica 14478 bp, bao gồm 12 gen, 2 vùng mã hóa rRNA, 22
vùng mã hóa tRNA, một vùng không mã hóa và một số tiểu phần khác.
- Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen nhân tế bào: Các vùng giao gen
ITS-1 (khoảng 430 bp) và ITS2 (khoảng 360 bp) là những chỉ thị phân tử quan
trọng để xác định loài SLGL. Trên đoạn ITS-2, F. hepatica và F. gigantica có 6 vị
trí khác biệt và một trong số đó bị khuyết ở F. gigantica. Trên đoạn ITS-1, F.
gigantica có 5 vị trí khác biệt so với F. hepatica. Dạng trung gian của SLGL có
trình tự ITS-1, ITS-2 giao thoa, pha trộn của cả F. hepatica và F. gigantica.
1.3.3. Tình hình nghiên cứu xác định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam
Trước đây, bằng phương pháp giám định hình thái học, một số tác giả cho
rằng F. hepatica và F. gigantica đều có mặt ở Viêt Nam. Tuy nhiên, với sự hỗ trợ
của sinh học phân tử hầu hết các nghiên cứu sau này cho rằng SLGL ở Việt Nam là
F. gigantica và dạng trung gian. Các nghiên cứu sinh học phân tử chủ yếu lựa chọn
gen nad1 hoặc cox1 thuộc hệ gen ty thể và ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân. Do ở Việt
Nam tồn tại các cá thể dạng trung gian (bao gồm các cá thể lai) nên một số nghiên
cứu chỉ sử dụng đơn thuần hệ gen ty thể hoặc hệ gen nhân có thể đã kết luận chưa
thực sự đầy đủ, cụ thể về thành phần loài của SLGL.
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Nghiên cứu hình thái: 316 cá thể SLGL trưởng thành thu từ trâu, bò, dê, cừu và
01 cá thể SLGL thu từ người.
- Nghiên cứu xác định loài và phân tích đặc điểm phân tử: gen cox1, nad1 thuộc
hệ gen ty thể và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 thuộc hệ gen nhân.

5

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
* Địa điểm thu thập mẫu: Miền Bắc (4 tỉnh): Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Giang,
Điện Biên; Miền Trung-Tây Nguyên (gọi tắt là Miền Trung, 6 tỉnh): Nghệ An,
Quảng Nam, ĐắkLắk, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận; Miền Nam (4 tỉnh): Tây
Ninh, Bình Phước, Đồng Tháp, Cần Thơ;
* Địa điểm phân tích hình thái và phân tử: Học viện Quân y, Hà Nội;
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2013 đến 1/2017
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả có phân tích dựa trên kết quả các
đặc điểm hình thái và phân tử của SLGL.
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
2.2.2.1. Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái
- Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái được tính theo công thức
Z2
. SD2
1


/2
n
, tham khảo giá trị tỷ số chiều dài/chiều rộng trong nghiên cứu của
2
( )

Wannasan A và CS (2014) ở quần thể SLGL tại Thái Lan tính được n = 211. Thực
tế, tổng số 317 cá thể SLGL toàn vẹn được đo đạc các chỉ số hình thái.

- Chọn mẫu và thu thập mẫu SLGL: mỗi cá thể vật chủ trâu, bò, dê, cừu thu
thập ngẫu nhiên từ 2 đến 20 con SLGL. Các mẫu sán được thu thập là các cá thể
sán có hình thái toàn vẹn. Trong đó, Miền Bắc 121 cá thể, Miền Trung 137 cá thể
và Miền Nam 59 cá thể; 126 cá thể sán thu từ 15 cá thể bò, 178 sán từ 16 cá thể
trâu, 6 sán từ 2 cá thể dê, 6 sán từ 2 cá thể cừu và 1 cá thể sán thu từ người.
- Ghi nhãn mẫu SLGL: mẫu sán được dán nhãn và ký hiệu với 4 thông tin:
năm thu thập, vật chủ, địa điểm thu thập và thứ tự mẫu ở địa điểm đó. Ví dụ: mẫu
15Tr-HN1, thu thập năm 2015 từ trâu (Tr = trâu; B = Bò; C = cừu; D = Dê) tại Hà
Nội. Đây là cá thể SLGL đầu tiên được ghi mẫu năm 2015 tại Hà Nội.
2.2.2.2. Cỡ mẫu giám định loài và phân tích đặc điểm sinh học phân tử
- Cỡ mẫu giám định loài
+ Số lượng SLGL: 224 cá thể sán ở động vật và 01 ở người. SLGL ở động vật
được lựa chọn sao cho thuộc cả 3 khu vực địa lý và ở các vật chủ khác nhau.
+ Chọn mẫu giám định loài bằng sinh học phân tử: Mỗi cá thể vật chủ tiến hành
giám định loài không quá 10 con sán. Số lượng sán ở mỗi loại vật chủ như sau: bò
106 cá thể, trâu 108 cá thể sán, dê 6 cá thể, cừu 4 cá thể và người 1 cá thể.
- Cỡ mẫu xác định các đặc điểm phân tử: 17 trình tự gen cox1, 8 trình tự
gen nad1, 16 trình tự ITS1 và 16 trình tự ITS2. Cụ thể trong Bảng 2.1:
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và gen đích giải trình tự
TT

Ký hiệu

1
2
3

15Tr-HN1
15Tr-VP1
SLGL-N

Năm
thu thập
2015
2015
2010

Nơi thu
thập
Hà Nội
Vĩnh Phúc
Hà Nội

Gen đƣợc giải trình tự
Vật
chủ cox1 nad1 ITS1 ITS2
Trâu
X
X
X
X
Trâu
X
X
X
X
X
Ngƣời
X
X

X


6

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

10B-HN1.8
10B-HN1.9
15Tr-NA5
10B-NA1.2
09B-QN1.1
15Tr-KH1
16D-NT1
16D-NT2
16C-NT1
16C-NT2

09B-TN1.1
14B-CT2
15Tr-ĐT1
15Tr-ĐT2

2010
2010
2015
2010
2009
2015
2016
2016
2016
2016
2009
2014
2015
2015

Hà Nội
Hà Nội
Nghệ An
Nghệ An
Quảng Nam
Khánh Hòa
Ninh Thuận
Ninh Thuận
Ninh Thuận
Ninh Thuận

Tây Ninh
Cần Thơ
Đồng Tháp
Đồng Tháp

Bò
Bò
Trâu
Bò
Bò
Trâu
Dê
Dê
Cừu
Cừu
Bò
Bò
Trâu
Trâu

X
X
X
X
X
X
X
X
X
X

X
X
X
X

X
X
X

X
X
X
X
X

X
X
X
X
X

X

X
X
X
X
X
X
X

X

X
X
X
X
X
X
X
X

X

2.2.3. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu hình thái
- Các chỉ số/chỉ tiêu hình thái được khảo sát, xác định: chiều dài cơ thể (BL),
chiều rộng cơ thể (BW), tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác
bụng tới cuối thân (VS-P)
- Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Vật liệu bảo quản và làm
tiêu bản sán, vật liệu đo đạc kích thước sán.
- Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Kỹ thuật làm tiêu
bản sán lá gan lớn bằng thuốc nhuộm Carmin; Xác định các chỉ số hình thái theo
phương pháp của Periago và CS (2006, 2008).
- Phân nhóm sán lá gan lớn theo hình thái: theo Srimuzipo và CS (2000) dựa
vào chiều dài và theo Periago và CS (2008) dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng.
2.2.4. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong giám định loài, phân tích
các đặc điểm phân tử
2.2.4.1. Các chỉ số/chỉ tiêu nghiên cứu về sinh học phân tử: kích thước sản phẩm
PCR; số lượng, kích thước các mảnh cắt giới hạn; tỷ lệ tương đồng nucleotide; số
nucleotide (nu), acid amin (aa) sai khác; tỷ lệ các nucleotide A, T, G, C...
2.2.4.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Hóa chất, sinh phẩm
Bảng 2.2. Các mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng
Gen
đích
Cox1
Nad1
ITS1
ITS2

Tên
Sản
Trình tự
Nguồn
mồi
phẩm
JB3
5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’
Bowles và
450bp
CS, 1992
JB4.5 5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3’
Ita10
5′-AAGGATGTTGCTTTGTCGTGG-3′
Itagaki và
630bp
CS, 2005
Ita2
5′-GGAGTACGGTTACATTCACA-3′
ITS1-F
5′-TTGCGCTGATTACGTCCCTG-3’

Itagaki và
680bp
CS, 2005
ITS1-R
5′-TTGGCTGCGCTCTTCATCGAC-3′
ITS2-F
5’-TGTGTCGATGAAGAGCGCAG-3’
Itagaki và
550bp
CS, 2005
ITS2-R
5’-TGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3’


7

Các sinh phẩm chạy PCR; Các enzyme RsaI, AluI, MspI, KpnI (Thermo,
Mỹ); Các hóa chất chạy điện di và tách chiết ADN.
- Các thiết bị chủ yếu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu gồm: buồng mix PCR, máy
PCR, máy ly tâm lạnh, máy vortex, máy điện di, máy chụp gel…
2.2.4.3. Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu
- Kỹ thuật tách chiết và kiểm tra nồng độ ADN tổng số từ SLGL trưởng thành.
- Khuyếch đại gen của SLGL bằng phản ứng PCR: Phản ứng PCR với tổng
thể tích 50 µl được thực hiện với chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 94 oC/10 phút, tiếp theo
là 35 chu kỳ [94 oC/30 giây, 53oC với gen cox1, 55 oC/45 giây với các gen khác,
72 oC trong 40 giây], sau đó là 1 chu kỳ 72 oC/10 phút và cuối cùng 1 chu kỳ 4 oC.
- Cắt giới hạn sản phẩm PCR (RFLP): Tổng thể tích cắt giới hạn là 16 μl,
gồm: 5 μl sản phẩm PCR, 1 μl enzyme giới hạn, 1 μl đệm 10X, 9 μl H2O. Hỗn
dịch được ủ ở 37 oC có lắc trong 2 - 12 giờ rồi ghi hình trên máy UVP (Canada).
- Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn trên gel Agarose

- Đọc và phân tích trình tự bằng máy ABI 3130xl Gentic Analyzer.
2.2.4.4. Phân loại sán lá gan lớn bằng kỹ thuật PCR-RFLP
- Phân loại SLGL theo Simsek S. và CS (2011) dựa vào kết quả PCR-RFLP
với cặp mồi JB3, JB4.5 và các enzyme RsaI, AluI như dưới đây.
Bảng 2.3. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 và kích thƣớc các
mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI, AluI
Loài sán
F. hepatica
F. gigantica

Sản phẩm PCR với Sản phẩm cắt giới
mồi JB3, JB4.5 (bp) hạn với RsaI (bp)
450
450
450
180, 270

Sản phẩm cắt giới
hạn với AluI (bp)
340, 110
450

- Phân loại SLGL theo Ichikawa M. và CS (2010) dựa vào kết quả PCR-RFLP
với cặp mồi ITS1-F, ITS1-R và enzyme RsaI như dưới đây.
Bảng 2.4. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R và kích thƣớc
các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI
Loài sán
F. hepatica
Fasciola sp.
F. gigantica

Sản phẩm PCR với mồi
ITS1-F, ITS1-R (bp)
680
680
680

Sản phẩm cắt giới
hạn với RsaI (bp)
360, 100, 60
360, 170, 100, 60
360, 170, 60

- Cá thể được xác định là F. hepatica hoặc F. gigantica nếu cả chỉ thị phân tử
hệ gen ty thể và hệ gen nhân của cá thể đó đều thuộc 1 loài.
- Cá thể dạng trung gian được phân loại làm 2 nhóm theo K. Cwiklinski và CS
(2016), bao gồm: Nhóm các các thể có kiểu gen hỗn hợp (hệ gen nhân có dạng tổ
hợp của 2 loài F. hepatica và F. gigantica) và nhóm các cá thể lai (cá thể có hệ
gen nhân thuộc loài này còn hệ gen ty thể thuộc loài kia).
2.2.4.5. Xác định đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn dựa vào sự đa hình của
kiểu gen đơn bội (haplotype): Kiểu gen đơn bôi của các gen nghiên cứu được xác
định dựa vào so sánh với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen.


8

2.3. Đạo đức và y đức trong nghiên cứu: Các vấn đề nghiên cứu được Hội đồng
khoa học và Hội đồng y đức của Viện SR - KST - CT Trung ương thông qua và
cho phép tiến hành. Nghiên cứu bảo đảm vấn đề đạo đức và y đức trong nghiên
cứu y sinh học, tuân thủ các nguyên tắc bảo mật thông tin của đối tượng nghiên

cứu. Các số liệu, dữ liệu nghiên cứu đảm bảo đầy đủ, khách quan, trung thực.
2.4. Xử lý và phân tích kết quả nghiên cứu
2.4.1. Xử lý số liệu hình thái: Số liệu hình thái được đo đạc, tính toán và phân
loại dựa vào kích thước chiều dài theo Srimuzipo và CS (2000) và tỷ số chiều
dài/chiều rộng theo Periago và CS (2008).
2.4.2. Xử lý số liệu về sinh học phân tử: Trình tự các mẫu được so sánh và phân
tích trên ngân hàng gene, cây phả hệ và phân tích trình tự trên các phần mềm
Maga 6, mức độ tương đồng và thành phần các nu A, C, G, T trên đoạn gen được
tính toán bằng công cụ nucleotide composition của phần mềm Bioedit.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại SLGL vào hình thái học
3.1.1. Xác định một số chỉ số hình thái của sán lá gan lớn
3.1.1.1. Kết quả x
ts
ỉs ì t
s
- Đối với sán lá gan lớn thu thập từ động vật
Trong 316 cá thể SLGL thu ở động vật có 120 cá thể ở Miền Bắc (37,97 %),
137 cá thể ở Miền Trung (43,36 %) và 59 cá thể ở Miền Nam (18,67 %).

a

b

Hình 3.2. Chiều dài SLGL thu từ Điện Biên và Bắc Giang năm 2010
(a: Mẫu SLGL ở bò Điện Biên; b: mẫu SLGL ở bò Bắc Giang)
Bảng 3.1. Một số chỉ số hình thái của SLGL tại các khu vực nghiên cứu
Chỉ số hình
thể (mm)
BL

BW
BL/BW
VS-P

Giá trị
Min - Max
X ± SD
Min - Max
X ± SD
Min - Max
X ± SD
Min - Max
X ± SD

Miền Bắc
( n= 120 )
16,00 - 36,00
26,55 ± 3,70
6,00 - 12,00
9,87 ± 1,15
1,73 - 4,46
2,72 ± 0,46
14,50 - 33,00
23,38 ± 3,50

Miền Trung
(n = 137)
13,00 - 46,00
26,78 ± 5,02
6,50 - 15,00

9,21 ± 1,32
1,69 - 6,57
2,95 ± 0,63
12,00 - 43,50
24,13 ± 4,96

Miền Nam
(n = 59)
18,00 - 45,00
30,96 ± 6,96
5,00 - 13,00
9,05 ± 1,91
1,58 - 5,83
3,51 ± 0,86
16,00 - 42,00
28,21 ± 6,81

Chung
(n=316)
13,00 - 46,00
27,47 ± 5,27
5,00 - 15,00
9,43 ± 1,43
1,58 - 6,57
2,97 ± 0,68
12,00 - 43,50
24,61 ± 5,18


9

SLGL có chiều dài trung bình 27,47 ± 5,27 mm (13,00 - 46,00 mm). Chiều rộng
9,43 ± 1,43 mm (5,00 - 15,00 mm). Tỷ số chiều dài/chiều rộng 2,97 ± 0,68 (1,58 6,57). Khoảng cách giác bụng - cuối thân 24,61 ± 5,18 mm (12,00 - 43,50 mm).
Bảng 3.2. Một số chỉ số hình thái của SLGL của các vật chủ khác nhau
Chỉ số
(mm)

Giá trị

Min - Max
X ± SD
Min - Max
BW
X ± SD
Min - Max
BL/BW
X ± SD
Min - Max
VS-P
X ± SD
BL

Bò
(n = 126)
18,00 - 45,00
29,24 ± 5,68
5,00 - 13,00
9,62 ± 1,57
1,96 - 5,83
3,12 ± 0,81

15,50 - 42,00
26,06 ± 5,77

Trâu
(n = 178)
13,00 - 41,00
25,97 ± 3,92
5,50 - 12,00
9,35 ± 1,19
1,58 - 4,43
2,81 ± 0,46
12,00 - 37,00
23,29 ± 3,74

Dê
(n = 6)
19,00 - 46,00
33,00 ± 11,02
6,50 - 15,00
8,75 ± 3,19
2,53 - 6,57
3,96 ± 1,56
17,00 - 43,50
30,83 ± 10,71

Cừu
(n = 6)
21,00 - 43,00
29,50 ± 8,75
6,0 - 10,5

8,33 ± 1,97
3,13 - 4,10
3,52 ± 0,38
19,00 - 41,00
27,08 ± 9,02

Chung
(n=316)
13,00 - 46,00
27,47 ± 5,27
5,00 - 15,00
9,43 ± 1,43
1,58 - 6,57
2,97 ± 0,68
12,00 - 43,50
24,61 ± 5,18

Chiều dài của SLGL ở dê lớn nhất 33,00 ± 11,02 mm, thấp nhất ở trâu 25,97 ±
3,92 mm. Chiều dài/chiều rộng của SLGL ở dê cao nhất, với 3,96 ± 1,56.

d

Hình 3.3. Kích thƣớc SLGL thu từ dê (a), cừu (b), trâu (c) tại Ninh Thuận và
Nghệ An (2015) và con SLGL thu từ ngƣời (d)
- Đối với mẫu SLGL thu ở ngƣời: chiều dài 30,50 mm, chiều rộng 9,50 mm,
chiều dài/chiều rộng 3,21 và khoảng cách giác bụng – cuối thân 26,50 mm. Quan
sát trong tử cung của mẫu sán này không thấy trứng.
- So sánh hình thái của F. gigantica và Fasciola sp. ở Việt Nam
Bảng 3.7. So sánh hình thái của F. gigantica và Fasciola sp. ở Việt Nam
Chỉ số hình

thể (mm)
BL
BW
BL/BW
VS-P

Giá trị
Min - Max
X ± SD
Min - Max
X ± SD
Min - Max
X ± SD
Min - Max
X ± SD

Loài SLGL
F. gigantica1 Fasciola sp.2
(n = 183)
(n = 41)
13,00 - 46,00 16,50 - 45,00 13,00 - 46,00
27,94 ± 5,65 28,17 ± 5,31 26,87 ± 6,94
5,00 - 15,00 5,00 - 13,00 6,50 - 15,00
9,44 ± 1,52
9,35 ± 1,48
9,83 ± 1,64
1,58 - 6,57
1,58 - 5,83
1,69 - 6,57
3,03 ± 0,76

3,08 ± 0,73
2,77 ± 0,81
12,00 - 43,50 15,50 - 42,00 12,00 - 43,50
25,05 ± 5,63 25,29 ± 5,33 23,98 ± 6,77
Chung
(n = 224)

p
P1,2 > 0,05
P1,2 > 0,05
P1,2 < 0,05
P1,2 > 0,05


10

Các chỉ số chiều dài, chiều rộng và khoảng cách giác bụng – cuối thân ở F.
gigantica lớn hơn ở Fasciola sp. nhưng không có ý nghĩa thống kê. Chiều
dài/chiều rộng ở F. gigantica lớn hơn một cách có ý nghĩa so với Fasciola sp.
3.1.2. Phân loại SLGL dựa vào một số chỉ số hình thái
Bảng 3.8. Phân nhóm SLGL tại các khu vực địa lý theo chiều dài cơ thể
Nhóm SLGL
Nhỏ
Trung bình
Lớn
Cộng

Khu vực địa lý (SL, tỷ lệ %)
Miền Bắc
Miền Trung

Miền Nam
34 (28,33)
80 (36,50)
9 (15,25)
85 (70,83)
77 (56,20)
35 (59,32)
1 (0,84)
10 (7,30)
15 (25,43)
120 (100)
137 (100)
59 (100)

Chung
(SL, tỷ lệ %)
93 (29,43)
197 (62,34)
26 (8,23)
316 (100)

Ở cả 3 khu vực, SLGL chủ yếu thuộc nhóm có kích thước trung bình (197
mẫu, 62,34 %). Nhóm kích thước nhỏ chiếm 29,4 3%, lớn chiếm 8,23 %.
Bảng 3.9. Phân nhóm SLGL thu thập ở động vật dựa vào chiều dài cơ thể
Nhóm SLGL
Nhỏ
Trung bình
Lớn
Cộng

Vật chủ (SL, tỷ lệ %)
Bò
Trâu
Dê
22 (17,46)
66 (37,08)
2
86 (68,25) 109 (61,24)
0
18 (14,29)
3 (1,68)
4
126 (100)
178 (100)
6

Cừu
3
2
1
6

Chung
(SL, tỷ lệ %)
93 (29,43)
197 (62,34)
26 (8,23)
316 (100)

Đa số SLGL thu thập ở trâu, bò có hình thái nhỏ và trung bình với 98,32 % và

85,71 %. Ở dê, 4/6 cá thể thuộc nhóm lớn và 2/6 thuộc nhóm nhỏ, không cá thể
nào thuộc nhóm trung bình. Ở cừu 3/6 cá thể thuộc nhỏ, 2/6 thuộc nhóm trung
bình và chỉ 1 cá thể thuộc nhóm lớn.
Bảng 3.11. Phân nhóm SLGL theo tỷ số chiều dài/chiều rộng
Phân nhóm sán
F. hepatica-like
Fasciola sp.-like
F. gigentica-like
Cộng

Khu vực địa lý (SL, tỷ lệ %)
Miền Bắc Miền Trung Miền Nam
67 (55,83)
64 (46,71)
9 (15,26)
47 (39,17)
50 (36,50)
25 (42,37)
6 (5,00)
23 (16,79)
25 (42,37)
120 (100)
137 (100)
59 (100)

Chung
(SL, tỷ lệ %)
140 (44,30)
122 (38,61)
54 (17,09)

316 (100)

Theo tỷ số chiều dài/ chiều rộng có 140 cá thể (44,30 %) thuộc nhóm giống
với F. hepatica, 54 cá thể (17,09 %) giống với F. gigentica, còn lại 122 cá thể
(38,61 %) thuộc nhóm giống với Fasciola sp.
3.2. Xác định loài và phân tích một số đặc điểm phân tử SLGL ở Việt Nam
3.2.1. Kết quả xác định loài và phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam
3.2.1.1. Kết quả k uế
e ,
s
bằ PCR-RFLP dự
v
ỉt
e ty t cox1 và các enzyme RsaI, AluI
Tất cả các mẫu ADN tổng số của SLGL đều được khuếch đại thành công bằng
cặp mồi JB3, JB4.5 cho band khoảng 450 bp.
+ Với enzyme RsaI: 215/225 (95,56 %) mẫu PCR bị cắt với RsaI, trong đó có
mẫu SLGL thu ở người, 10 mẫu PCR còn lại (4,44 %) không bị cắt.


11

1

2

Hình 3.6 (1) và Hình 3.7 (2). Sản phẩm PCR (với các mồi JB3, JB4.5) và các
mảnh cắt giới hạn bằng enzyme RsaI và AluI của một số mẫu SLGL
Hình 3.6a: giếng 1-7: sản phẩm PCR; M: thang DNA chuẩn 50bp; Hình 3.6b:
giếng 1-7 sản phẩm cắt giới hạn; giếng M: thang DNA chuẩn 50bp.

Hình 3.7a: giếng 1-4: sản phẩm cắt với RsaI, M: thang DNA 50bp; Hình 3.7b:
giếng 1-4: sản phẩm cắt với AluI, M: thang DNA 50bp; giếng 5: chứng âm
+ Với enzyme AluI: Cả 225 mẫu sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzyme
AluI, phù hợp với F. gigantica.
- Kết quả thẩm định một số cá thể SLGL dựa vào so sánh trình tự nucleotide
đoạn gen cox1 với ngân hàng gen
So sánh trình tự nucleotide chứa 1 phần gen cox1 với ngân hàng gen cho thấy,
cả 17 trình tự đều phù hợp với F. gigantica. Đoạn gen cox1 này có 5 nhóm kiểu
gen đơn bội, đa số thuộc nhóm H8-CO1.FgVN (11 trình tự: 15Tr-HN1, 15TrVP1, 15Tr-DT2, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 10B-NA1.2, 16D-NT1, 16D-NT2,
16C-NT1, 16C-NT2 và SLGL-N); còn lại thuộc nhóm H9-CO1.FgVN (1 trình tự,
15Tr-KH1); H5-CO1.FgVN (1 trình tự, 09B-TN1.1); H4-CO1.FgVN (1 trình tự,
15Tr-NA5) và H3-CO1.FgVN (3 trình tự, 15Tr-DT1, 09B-QN1.1, 14B-CT2).
- Kết quả phân tích quan hệ phả hệ của SLGL Việt Nam dựa vào chỉ thị cox1

a

b

Hình 3.8 (a) và Hình 3.10 (b). Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các
chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn gen cox1 (447 bp) và gen nad1 (535bp),
xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ
(Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại


12

3.2.1.2. Kết quả
s
bằ dự v
ỉt

e ty t
d1
Đối với đoạn gen nad1, cả 8 mẫu đều có trình tự phù hợp với F. gigantica.
Trên đoạn gen này có 2 kiểu gen đơn bội, nhóm H1-ND1.FgVN với 7 trình tự
15Tr-HN, 15Tr-VP1, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16D-NT1, 16C-NT1 và SLGL-N.
01 trình tự thuộc nhóm H5-ND1.FgVN (15Tr-NA5).
3.2.1.3. Kết quả k uế
e ,
s
bằ PCR-RFLP dự
v
ỉt
e
ITS1 v e zy e Rs I
- Kết quả khếch đại gen ITS-1
Với cặp mồi ITS1-F và ITS1-R, toàn bộ 225 mẫu DNA của SLGL đều được
nhân gen thành công. Tất cả cho band kết quả có cùng kích thước khoảng 680 bp.
- Kết quả phân loại loài SLGL bằng phƣơng pháp PCR-RFLP dựa vào chỉ
thị gen nhân ITS-1 và enzyme RsaI

Hình 3.11. Minh họa sản phẩm PCR và cắt giới hạn với RsaI đoạn gen 680bp
Trong 225 cá thể sán được phân tích, có 184 cá thể thuộc nhóm F. gigantica
(81,78 %), 41 cá thể thuộc nhóm Fasciola sp. (18,22 %).
Bảng 3.16. Phân bố loài SLGL theo khu vực địa lý
Loài SLGL
Miền Bắc
Miền Trung
Miền Nam
Tổng

F. gigantica (n, %) Fasciola sp.(n, %)
67 (76,14)
21 (23,86)
68 (80,95)
16 (19,05)
49 (92,45)
4 (7,55)
184 (81,78)
41 (18,22)

Tổng (n, %)
88 (100,0)
84 (100,0)
53 (100,0)
225 (100,0)

Cả Miền Bắc, Miền Trung và Miền Nam đều tồn tại các cá thể SLGL dạng
trung gian (Fasciola sp.). Tần suất xuất hiện các cá thể trung gian ở khu vực Miền
Bắc cao nhất (23,86 %) và thấp nhất ở khu vực Miền Nam (7,55 %).
Bảng 3.17. Phân bố loài SLGL theo vật chủ
Loài SLGL
Bò
Trâu
Dê
Cừu
Người
Tổng

F. gigantica (n, %) Fasciola sp. (n, %)
88 (83,02)

18 (16,98)
90 (83,33)
18 (16,67)
3
3
2
2
1
0
184 (81,78)
41 (18,22)

Tổng (n, %)
106 (100,0)
108 (100,0)
6
4
1
225 (100,0)

SLGL ở cả 4 loài động vật trâu, bò, dê, cừu đều tồn tại các cá thể trung gian.
Cá thể SLGL ở người là loài F. gigantica.


13

Bảng 3.18. Phân bố loài theo nhóm kích thƣớc chiều dài SLGL
Nhóm kích thƣớc F. gigantica (n, %)
Nhỏ
43 (68,25)

Trung bình
123 (88,49)
Lớn
18 (78,26)
184 (81,78)
Tổng

Fasciola sp. (n, %)
20 (31,75)
16 (11,51)
5 (21,74)
41 (18,22)

Tổng (n, %)
63 (100,0)
139 (100,0)
23 (100,0)
225 (100,0)

SLGL ở cả 3 nhóm kích thước đều tồn tại các cá thể có kiểu gen dạng trung
gian (Fasciola sp.). Tần suất xuất hiện các cá thể trung gian ở nhóm SLGL có
kích thước nhỏ cao nhất (31,75 %) và thấp nhất ở nhóm SLGL có kích thước
trung bình (11,51 %).
- Kết quả phân loại SLGL bằng dựa vào chỉ thị gen nhân ITS-1
Dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS1, 2 trình tự phù hợp với F. hepatica, 11
trình tự phù hợp với F. gigantica và 3 trình tự thuộc kiểu trung gian. 11 trình tự
thuộc nhóm H0-ITS1.FgVN là SLGL-N, 16D-NT2, 16C-NT1, 16C-NT2, 10BHN1.8, 09B-QN1.1, 09B-TN1.1, 14B-CT2, 15Tr-VP1, 15Tr-NA5, và 15Tr-DT1.
Có 1 trình tự thuộc nhóm H1-ITS1.FgVN là 15Tr-HN1, 1 thuộc nhóm H2ITS1.FgVN là 16D-NT1 và 1 thuộc nhóm H3-ITS1.FgVN là 10B-NA1.2. Có 2
trình tự thuộc nhóm H5-ITS1.FgVN là 10B-HN1.9 và 15Tr-DT2.
- Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng SLGL của Việt Nam

dựa vào chỉ thị gen ITS-1
100 F.g_AB514855.1(ITS1Zambia)
F.g_AB207142.1(ITS1Zambia)

FasVN4-ITS1(16Cuu-NT1)
FasVN3-ITS1(16D-NT2)
FasVN1-ITS1(SLGL-N)
AB514853.1_F.g(ITS1-Thailand)
FasVN5-ITS1(16Cuu-NT2)
FasVN06-ITS1(10B-HN1.8)
FasVN08-ITS1(09B-QN1.1)
FasVN10-ITS1(09B-TN1.1)
FasVN11-ITS1(14B-CT2)
62

FasVN13-ITS1(15Tr-VP1)
FasVN14-ITS1(15Tr-NA5)
F.g_AB207143.1(ITS1Indonesia)
F.g_AB207144.1(ITS1Thailand)
F.g_AB385614.1(ITS1Vietnam)
F.g_AB514854.1(ITS1Thailand)

72

F.g_AB514857.1(ITS1Vietnam)
F.g_KC476171.1(ITS1Bangladesh)
F.g_LC076127.1(ITS1Egypt)
F.sp_AB207146.1(ITS1Japan)

76 F.sp_AB211238.1(ITS1Korea)

KF425321.1_F.g(ITS1-Egypt)
90

FasVN15-ITS1(15Tr-DT1)
FasVN12-ITS1(15Tr-HN1)

92
35

FasVN2-ITS1(16D-NT1)
FasVN09-ITS1(10B-NA1.2)
AB514866.1_F.sp(ITS1-Japan)
F.g_KC424482.1(ITS1Bangladesh)
AB514847.1_F.h(ITS1-Uruguay)

62 FasVN07-ITS1(10B-HN1.9)
FasVN16-ITS1(15Tr-DT2)
F.h_AB207140.1(ITS1Australia)
F.h_AB207141.1(ITS1Ireland)
29 F.h_LC076147.1(ITS1Egypt)
F.h_LC076196.1(ITS1Egypt)
F.sp_AB207145.1(ITS1Japan)
F.sp_AB385611.1(ITS1Vietnam)
F.sp_AB514861.1(ITS1China)
41 F.h_KJ689325.1(ITS1Peru)
F.h_KJ689333.1(ITS1Peru)
F.h_GQ231546.1(ITS2Tunissi)
AF040935.1_P.westermani(ITS1-Malaysia)
0.05

Hình 3.12. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp.
dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS1 (432 bp), xây dựng bằng chƣơng trình
MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số
tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại


14

Hình trên chỉ ra rằng, các cá thể 15Tr-DT2 và 10B-HN1.9 có quan hệ gần gũi
với F. hepatica (AB514847.1, Uruguay) và Fasciola sp. (AB514866.1, Nhật Bản).
Còn lại có quan hệ gần gũi với F. gigantica (AB514853.1, Thái Lan).
3.2.1.4. Kết quả
s
bằ
ỉt
e ITS-2
- Kết quả khuếch đại đoạn gen ITS-2 và phân nhóm SLGL
Kết quả nhân đoạn giao gen ITS2 bằng cặp mồi ITS2-F và ITS2-R cho thấy,
toàn bộ ADN của 225 cá thể đều cho kết quả PCR với band kích thước 540 bp khi
điện di trên gel agarose 2 %.
Dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS2, có 2 trình tự phù hợp với F. gigantica.
Có 3 kiểu gen đơn bội ở trình tự này là H0-ITS2.FgVN (6 trình tự), H1ITS2.FgVN (5 trình tự) và H6-ITS2.FgVN (2 trình tự). Không có trình tự của cá
thể nào thuộc các nhóm H2, H3, H4 và H5-ITS2.FgVN.
- Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng SLGL của Việt Nam
dựa vào chỉ thị gen ITS-2

Hình 3.14. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp.
dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS2 (360 bp), xây dựng bằng chƣơng trình
MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số
tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại

Hình trên cho thấy, 11 cá thể 15Tr-NA5, SLGL-N, 14B-CT2, 09B-TN1.1,
09B-QN1.1 và 15Tr-ĐT1… có quan hệ gần gũi với F. gigantica. 02 cá thể SLGL
10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2 có quan hệ gần gũi với F. hepatica và Fasciola sp. 3
trình tự ITS2 còn lại không hoàn thiện, có bất thường ở nucleotide số 435.
Kết quả phân tích PCR-RFLP với gen nhân và gen ty thể không có mẫu SLGL
nào thuộc nhóm F. hepatica thuần chủng. Với chỉ thị gen cox1, các mẫu SLGL
đều phù hợp với F. gigantica. Tuy nhiên, bằng chỉ thị ITS1 chi ra có 41/225


15

(18,22 %) cá thể thuộc nhóm SLGL trung gian (Fasciola sp.), còn lại 184/225
(81,78 %) cá thể thuộc nhóm F. gigantica.
Bảng 3.21. Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài
bằng PCR-RFLP của SLGL thu từ động vật
Phân loại theo
BL/BW
F. hepatica-like
Fasciola sp.-like
F. gigantica-like
Tổng số

Kết quả phân loại bằng PCR-RFLP (n, %)
F. gigantica
Fasciola sp.
67 (36,61)
25 (60,98)
75 (40,98)
11 (26,83)

44 (22,41)
5 (12,19)
183 (100,0)
41 (100,0)

Tổng số
(n, %)
92 (41,07)
86 (38,39)
46 (20,54)
224 (100)

Bảng 3.22. Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài
bằng PCR-RFLP của các mẫu đƣợc so sánh trình trình tự
Tên mẫu
15Tr-HN1
15Tr-VP1
15Tr-KH1
15Tr-NA5
15Tr-DT1
15Tr-DT2
10B-HN1.8
10B-HN1.9
09B-QN1.1
10B-NA1.2
09B-TN1.1
14B-CT2
16D-NT1
16D-NT2
16C-NT1

16C-NT2
SLGL-N

Chỉ số hình thái
BL/
BL BW
BW
23,0 11,0 2,09
26,0 10,0 2,60
30,5 10,0 3,05
30,5 11,0 2,77
36,5 12,0 3,04
35,0 9,0 3,89
26,0 11,0 2,36
25,0 10,5 2,38
29,0 7,0 4,14
29,5 11,0 2,68
40,0 13,0 3,08
24,0 6,0 4,0
19,0 7,0 2,71
20,0 6,5 3,08
21,0 6,5 3,23
22,0 6,0 3,67
30,5 9,5 3,21

Phân nhóm
theo tỷ lệ
BL/BW
F. hepatica-like
F. hepatica-like

Fasciola sp.-like
Fasciola sp.-like
Fasciola sp.-like
F. gigantica-like
F. hepatica-like
F. hepatica-like
F. gigantica-like
F. hepatica-like
Fasciola sp.-like
F. gigantica-like
F. hepatica-like
Fasciola sp.-like
Fasciola sp.-like
F. gigantica-like
-

Phân
nhóm
theo BL
Nhỏ
Trung bình
Trung bình
Trung bình
Lớn
Trung bình
Trung bình
Trung bình
Trung bình
Trung bình
Trung bình

Nhỏ
Nhỏ
Nhỏ
Nhỏ
Nhỏ
Trung bình

Kết luận loài theo
SHPT
Fasciola sp., trộn lẫn
F. gigantica
Fasciola sp., trộn lẫn
F. gigantica
F. gigantica
Fasciola sp., lai
F. gigantica
Fasciola sp., lai
F. gigantica
Fasciola sp., trộn lẫn
F. gigantica
F. gigantica
Fasciola sp., trộn lẫn
F. gigantica
F. gigantica
F. gigantica
F. gigantica

Các kết quả phân loại SLGL theo hình thái và phân tử cho thấy, phân loại hình
thái không tương đồng với phân loại bằng sinh học phân tử.
3.2.2. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử

3.2.2.1. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử chỉ thị gen cox1
Kết quả so sánh trên ngân hàng gen cho thấy, cả 17 mẫu đều có tỷ lệ tương
đồng cao với SLGL. Các trình tự tương đồng cao hơn với F. gigantica và
Fasciola sp. (tỷ lệ tương đồng trung bình > 98 %), tương đồng thấp hơn với F.
hepatica (tỷ lệ tương đồng trung bình thấp < 94 %).
So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen cox1 giữa SLGL Việt Nam và F.
gigantica (KF543342.1, Trung Quốc) cho thấy, có 11 vị trí xuất hiện sai khác nhưng
số nucleotide sai khác tối đa ở từng chủng không quá 6. Số nucleotide sai khác cụ thể


16

của từng chủng SLGL Việt Nam so với chủng Fasciola sp. (KF543343.1, China)
cũng không quá 6. Tuy nhiên, so với chủng F. hepatica (AF216697.1, Australia) số
nucleotide sai khác > 25.

Hình 3.16. Minh họa 1 số vị trí có sai khác nucleotide gen cox1 của 17 mẫu
SLGL ở Việt Nam so với SLGL trên thế giới
Nucleotide số 67, 75, 93 và 117 của F. hepatica (AF216697.1-Autralia) có sự
khác biệt so với F. gigantica (KF543342.1, Trung Quốc) và Fasciola sp.
(KF543343.1, China) cũng như so với SLGL ở Việt Nam. Riêng 2 chủng 15TrNA5 và 09B-TN1.1 không có vị trí cắt của 2 enzyme RsaI (GTAC) và AluI
(AGCT). Nucleotide A ở vị trí 189 thay bằng G giống như ở F. hepatica
(AF216697.1-Autralia, M93388.1). Tất cả các mẫu SLGL ở nghiên cứu này đều
không có vị trí nhận diện cắt của AluI (AGCT), vị trí này lại xuất hiện ở F.
hepatica (AF216697.1, Autralia).
3.2.2.2. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử chỉ thị gen nad1
Tỷ lệ tương đồng đoạn gen nad1 của SLGL ở nghiên cứu này với các loài
SLGL đã được khẳng định và công bố trên ngân hàng gen như sau: so với F.
gigantica (AB385616.1, Việt Nam) tỷ lệ tương đồng là 99,4 %; so với Fasciola
sp. (AB536756.1, Việt Nam), mẫu 15Tr-NA5 có tỷ lệ tương đồng 98,5 %, các

mẫu còn lại tương đồng 99,6 %; so với F. hepatica (AB477361.1, Trung Quốc) tỷ
lệ tương đồng của SLGL Việt Nam đều < 91,4 %.
Có 6 vị trí nucleotide xuất hiện sai khác giữa các chủng SLGL trong nghiên
cứu này so với chủng F. gigantica (AB385616.1, Vietnam). Chủng SLGL phân
lập từ người (SLGL-N), 15Tr-VP1, 15Tr-HN1, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16DNT1 và 16C-NT1 có 3 vị trí sai khác, các sai khác này dẫn tới 1 sai khác về acid
amin ở vị trí số 38 so với F. gigantica (AB385616.1, Vietnam) nhưng tương đồng
hoàn toàn so với Fasciola sp. (AB536756.1, Việt Nam). Riêng chủng 15Tr-NA5
có 4 vị trí sai khác nucleotide, nhưng cũng chỉ dẫn đến 1 sự sai khác so với F.
gigantica (AB385616.1, Vietnam) ở vị trí acid amin số 79.
3.2.2.3. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử đoạn giao gen ITS-1
Kết quả phân tích cho thấy, đoạn ITS1 của hầu hết các chủng SLGL trong nghiên
cứu này có tỷ lệ tương đồng > 99,0 % giữa các chủng với nhau và với Fasciola trên
thế giới. 14/16 chủng SLGL Việt Nam có tỷ lệ tương đồng với F. gigantica cao hơn
với F. hepatica. 2/16 chủng (10B-HN1.9 và 15Tr-DT2) có kết quả ngược lại, tương
đồng với F. hepatica cao hơn với F. gigantica.


17

Bảng 3.28. Các vị trí có sai khác về nucleotide của SLGL Việt Nam và SLGL
thế giới của đoạn giao gen ITS1
Loài/Chủng
SLGL
F. gigantica
F. gigantica
F. gigantica
F. gigantica
F. gigantica
F. gigantica
F. hepatica

F. hepatica
F. hepatica
F. hepatica
F. hepatica
Fasciola sp.
Fasciola sp.
Fasciola sp.
SLGL_N
16D-NT1
16D-NT2
16C-NT1
16C-NT2
10B-HN1.8
10B-HN1.9
09B-QN1.1
10B-NA1.2
09B-TN1.1
14B-CT2
15Tr-HN1
15Tr-VP1
15Tr-NA5
15Tr-DT1
15Tr-DT2

Vị trí biến đổi nu trên trình tự
đoạn giao gen ITS1
24
114 208 286 306
T
T

T
A
T
T
T
T
A
T
T
T
T
A
T
T
T
T
A
T
T
T
T
A
T
T
T
T
A
T
C
A

C
T
C
C
A
C
T
C
C
A
C
T
C
C
A
C
T
C
C
A
C
T
C
T
T
T
A
T
C
A

C
T
C
C
A
C
T
C
T
T
T
A
T
Y
T
T
W
T
T
T
T
A
T
T
T
T
A
T
T
T

T
A
T
T
T
T
A
T
C
A
C
T
C
T
T
T
A
T
Y
T
T
T
C
T
T
T
A
T
T
T

T
A
T
Y
T
T
A
T
T
T
T
A
T
T
T
T
A
T
T
T
T
A
T
C
A
C
T
C

Mã số

Quốc gia

AB514853.1
AB207143.1
KC476171.1
AB514855.1
AB514857.1
KF425321.1
AB514847.1
AB207140.1
AB207141.1
KJ689325.1
LC076147.1
AB211238.1
AB385611.1
AB514861.1
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này

Nghiên cứu này
Nghiên cứu này
Nghiên cứu này

Thailand
Indonesia
Bangladesh
Zambia
Vietnam
Egypt
Uruguay
Australia
Ireland
Peru
Egypt
Korea
Vietnam
China
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam

Vietnam
Vietnam
Vietnam
Vietnam

So sánh tương đồng nucleotide của đoạn giao gen ITS1 cho thấy, hầu hết các
chủng SLGL trong nghiên cứu này sai khác không quá 2 nucleotide so với SLGL F.
gigantica trên ngân hàng gen. Tuy nhiên, riêng 2 mẫu 10B-HN1.9 và 15Tr-DT2
có 5 vị trí nucleotide có sai khác với F. gigantica. Các sai khác này biến đổi theo
hướng phù hợp với F. hepatica và Fasciola sp.
3.2.2.4. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử đoạn giao gen ITS-2
Kết quả phân tích chỉ ra rằng, ngoại trừ các cá thể 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2,
các các thể SLGL trong nghiên cứu này đều có tỷ lệ tương đồng với F. gigantica


18

(KF543340.1, China) đạt trên 99.7%. Riêng 2 cá thể 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2
tương đồng với F. gigantica chỉ 98,3% nhưng với F. hepatica là 100%.

Hình 3.20. Minh họa các vị trị có sai khác nucleotide trên đoạn giao gen ITS2
của SLGL ở Việt Nam so với SLGL thế giới
Hình trên cho thấy, một số vị trí của 2 cá thể 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2 biến
đổi theo hướng giống với F. hepatica như vị trí 207 và 231 C chuyển thành T, vị
trí 270 và 276 T chuyển thành C, vị trí 334 A thành G. Ngoài ra 10B-HN1.9 và
15Tr-ĐT2 có nu T được chèn thêm vào ở vị trí 327 làm cho vị trí này giống với F.
hepatica. Trong khi các mẫu khác và ở sán F. gigantica không có vị trí này.
Bảng 3.30. Các vị trí sai khác nucleotide của đoạn giao gen ITS2 giữa SLGL Việt
Loài/Chủng
SLGL

F. gigantica
Fasciola sp.
F. hepatica
09B-TN1.1
14B-CT2
09B-QN1.1
10B-HN1.8
10B-HN1.9
SLGL-N
15Tr-NA5
15Tr-DT1
15Tr-DT2
15Tr-VP1
16D-NT2
16c-NT1
16c-NT2

Nam và thế giới
Vị trí có sai khác về nucleotide
207 218 231 270 276 327 334

C
T
T
C
C
C
C
T
C

C
C
T
C
C
C
C

T
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
C
C
C
C

C
T
T
C
C

C
C
T
C
C
C
T
C
C
C
C

T
C
C
T
T
T
T
C
T
T
T
C
T
T
T
T

T

C
C
T
T
T
T
C
T
T
T
C
T
T
T
T

T
T
T
T
-

A
G
G
A
A
A
A
G

A
A
A
G
A
A
A
A

Mã số

Quốc gia

KF543340.1
Trung Quốc
KF543341.1
Trung Quốc
AB973396.1
Ireland
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam

Nghiên cứu này Việt Nam
Nghiên cứu này Việt Nam

Bảng trên cho thấy, có 7 vị trí xuất hiện sai khác trên đoạn ITS-2 của các chủng
SLGL Việt Nam so với F. gigantica (KF543340.1, China). Các chủng 10B-HN1.9
và 15Tr-DT2 có 6 sai khác, các sai khác này theo hướng biến đổi giống với
Fasciola sp. và F. hepatica. Các chủng còn lại không có sai khác so với F.
gigantica (KF543340.1, China).


19

Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. Về kết quả xác định một số chỉ số hình thái và phân loài sán lá gan lớn dựa
vào hình thái
4.1.1. Về kết quả xác định và phân tích một số chỉ số hình thái
Về kết quả xác định một số chỉ số hình thái của sán lá gan lớn ở Việt Nam
Trong nghiên cứu này, các chỉ số hình thái được xác định, đo đạc theo phương
pháp của Periago và CS (2006, 2008).
Về hình thái chung, hầu hết các mẫu SLGL có dạng thon dài, vai hẹp phù hợp
với hình thái của F. gigantica. Tuy vậy, cũng có không ít cá thể có kích thước
ngắn, bầu, vai rộng và hình dạng rất giống với hình thái của F. hepatica (ví dụ
mẫu Điện Biên-Hình 3.2a). Trong số này, nhiều cá thể không quan sát thấy trứng
ở trong tử cung. Đối với SLGL phân lập từ động vật, BL dao động từ 13,00 đến
46,00 mm (trung bình 27,47 ± 5,27 mm), BW dao động từ 5,00 đến 15,00 mm
(trung bình 9,43 ± 1,43 mm), tỷ số BL/BW dao động từ 1,58 đến 6,57 (trung bình
2,97 ± 0,68) và VS-P dao động từ 12 đến 43,5 mm (trung bình 24,61 ± 5,18).
Đối với mẫu SLGL ở người, các chỉ số BL, BW, BL/BW và VS-P có giá trị lần
lượt là 30,50 mm, 9,50 mm, 3,21 và 26,50 mm. Nhìn hình dạng ngoài, mẫu SLGL
ở người này có hình dáng ngoài khá điển hình của loài F. gigantica và chiều dày

cơ thể mỏng hơn các mẫu SLGL thu từ động vật. Ngoài ra, quan sát trong tử cung
không thấy có trứng sán. Điều này có thể do mẫu SLGL ở người thu từ vị trí lạc
chỗ nên chưa trưởng thành hoàn toàn, trong khi mẫu SLGL thu từ động vật được
lấy từ đường dẫn mật nên là các cá thể đã trường thành.
Phân tích, so sánh các chỉ số hình thái của sán lá gan lớn Việt Nam với sán
lá gan lớn thế giới và khu vực
Khi so sánh kích thước chiều dài của SLGL trong nghiên cứu này với F.
hepatica và F. gigantica tại Iran (quần thể SLGL đã được định danh) thấy rằng,
chiều dài SLGL ở cả 4 vật chủ trong nghiên cứu này lớn hơn của F. hepatica
nhưng ngắn hơn của F. gigantica (p < 0,05). Phân tích chiều dài SLGL ở Iran cho
thấy, chiều dài của F. hepatica và F. gigantica thuần chủng ở Iran hầu như không
có các khoảng gối lên nhau, chiều dài của F. hepatica ngắn hơn rõ rệt so với F.
gigantica (11,47 - 30,02 mm và 29,97 - 62,39 mm). Nếu lấy các chỉ số này để
tham chiếu thì chiều dài SLGL ở Việt Nam có kích thước trung gian giữa F.
hepatica và F. gigantica. Các kết quả so sánh chỉ số VS-P tương tự như kết quả
khi so sánh chiều dài.
Chỉ số BL/BW ở nghiên cứu này dao động từ 1,58 - 6,57, trung bình 2,97 ±
0,68. So sánh với các quần thể SLGL thuần chủng ở Iran, chỉ số này lớn hơn của
F. hepatica (2,97 ± 0,68 so với 2,24 ± 0,03; p < 0,05) nhưng nhỏ hơn của F.
gigantica (2,97 ± 0,68 so với 5,74 ± 0,07; p < 0,05). Kết quả này cũng tương tự
khi so sánh chỉ số BL/BW ở nghiên cứu này với chỉ số BL/BW ở một số quần thể
F. hepatica và F. gigantica thuần chủng trong nghiên cứu của Periago và CS
(2006, 2008). Riêng mẫu SLGL ở người trong nghiên cứu này, mặc dù hình thái


20

ngoài rất điển hình của F. gigantica nhưng chỉ số BL/BW là 3,21 nằm ở vị trí
trung gian giữa F. hepatica và F. gigantica. Tuy nhiên, do mẫu SLGL thu từ
người là cá thể lạc chỗ ký sinh, chưa trưởng thành nên các so sánh hay phân nhóm

mẫu sán này có phần chưa thực sự chính xác.
Từ các kết quả phân tích ở trên đã chỉ ra rằng, một số chỉ số kích thước
SLGL ở Việt Nam nằm ở khoảng giao thoa của 2 loài F. hepatica và F.
gigantica. Mặc dù các quần thể SLGL đem so sánh không tương đồng về địa lý
và vật chủ thu thập nhưng các đặc điểm hình thái của nhiều cá thể không điển
hình, giống với cả F. hepatica và F. gigantica rõ ràng đã gợi ý về giả thuyết tồn
tại dạng trung gian và/hoặc cả 2 loài SLGL ở Việt Nam.
4.1.2. Về kết quả phân loại sán lá gan lớn dựa vào hình thái
Về kết quả phân loại sán lá gan lớn
Dựa trên các kết quả về chỉ số chiều dài, SLGL đã được phân làm 3 nhóm nhỏ,
trung bình và lớn dựa theo công bố trước đó của Srimuzipo P. và CS (2000). Theo
cách phân nhóm này, SLGL ở Việt Nam chủ yếu thuộc nhóm có kích thước nhỏ
(29,43 %) và trung bình (62,34 %). Nhóm có kích thước lớn chỉ chiếm 8,23 %.
Các nhóm hình thài đều thấy ở các vùng miền và các vật chủ khác nhau. Riêng
mẫu SLGL ở người, kích thước chiều dài thuộc nhóm trung bình. Tỷ lệ các nhóm
nhỏ, trung bình và lớn trong nghiên cứu này có sự khác biệt so với của Wannasan
A và CS (2014) nghiên cứu trên quần thể SLGL ở Thái Lan. Sự khác biệt này có
thể do việc thu thập mẫu trên các vật chủ và ở các vùng địa lý khác nhau. Mặt
khác, cả 2 nghiên cứu chưa khảo sát hình thái trên các yếu tố tác động khác như
dạng nhị bội hay tam bội, dinh dưỡng vật chủ, tuổi vật chủ…
SLGL còn được phân loại thành 3 nhóm: giống với F. hepatica (F. hepaticalike), giống Fasciola sp. (Fasciola sp.-like) và giống với F. gigantica (F. giganticalike), dựa vào chỉ số chiều dài/chiều rộng theo Periago và CS (2008). Theo cách
phân loại này, nhóm F. hepatica-like chiếm tỷ lệ cao nhất với 44,30 %, nhóm
Fasciola sp.-like (dạng trung gian) chiếm tỷ lệ 38,61 % và nhóm F. gigantica-like
chiếm tỷ lệ thấp nhất với 17,09 %. Theo các phân loại này, các nhóm hình thái
cũng gặp ở tất cả các vùng miền và các vật chủ. Tuy nhiên, theo một số tác giả,
phân loại SLGL theo theo phương pháp của Periago và CS (2006, 2008) không
thực sự chính xác, nhất là ở các khu vực tồn tại các cá thể lai hoặc với sán ở vùng
giao thoa, nơi cả 2 loài Fasciola cùng tồn tại song song. Nghiên cứu của Ghavami
và CS (2009) tại Iran là một dẫn chứng.
Phân tích, so sánh hình thái học của sán lá gan lớn trong nghiên cứu với một

số nghiên cứu trƣớc đó tại Việt Nam
Một số nghiên cứu khác ở Việt Nam cũng cho thấy có sự đa hình về hình thái ở
SLGL. Kết quả giám định loài bằng sinh học phân tử phát hiện sự tồn tại của dạng
trung gian Fasciola sp., thể tam bội trong các nghiên cứu trước đó đã góp phần giải
thích tính đa dạng hình thái của SLGL tại Việt Nam. Điều này cũng một lần nữa
chứng minh rằng ở những nơi tồn tại các cá thể SLGL dạng trung gian thì việc phân
loại SLGL bằng hình thái gặp rất nhiều khó khăn. Ngoài ra, kích thước SLGL còn


21

phụ thuộc vào sán ở thể lưỡng bội, tam bội hay hỗn hợp, trong khi vấn đề này chưa
phân tích nên các kết quả có những giới hạn nhất định. Mặc dù vậy, các kết quả này
đã cung cấp những dữ liệu quan trọng về hình thái và cũng cho thấy hình thái
SLGL ở Việt Nam có tính đa hình.
4.2. Kết quả xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử
của sán lá gan lớn ở Việt Nam
4.2.1. Về kết quả xác định thành phần loài sán lá gan lớn ở Việt Nam
Để xác định loài SLGL, chúng tôi sử dụng PCR-RFLP trên cả hệ gen nhân
(đoạn giao gen ITS1) và hệ gen ty thể (1 đoạn của gen cox1).
Dựa trên chỉ thị gen cox1, toàn bộ 225 cá thể SLGL thuộc nhóm F. gigantica.
Tuy nhiên, kết quả cắt giới hạn bằng RsaI có 10 chủng SLGL ở động vật không
phù hợp với lý thuyết của F. gigantica (không bị cắt giới hạn làm 2 mảnh). Điều
này được giải thích khi kết quả giải trình tự cho thấy trên đoạn ADN của gen cox1
được phân tích, tại vị trí nhận dạng cắt giới hạn của enzyme RsaI (GT/AC) đã có
1 nu bị biến đổi, A chuyển thành G. Chính sự thay đổi này đã làm cho enzyme
RsaI không nhận diện được vị trí cắt nên sản phẩm PCR không bị cắt giới hạn và
điều này cũng cho thấy gen cox1 của SLGL ở Việt Nam có tính đa hình di truyền.
Dựa trên chỉ thị ITS1, phương pháp PCR-RFLP đã chỉ ra có 41 cá thể thuộc dạng
trung gian, 184 mẫu là F. gigantica. Như vậy, bằng phương pháp PCR-RFLP dựa

trên phân tích các chỉ thị gen nhân (ITS1) và gen ty thể (cox1), nghiên cứu này đã
xác định được 2 kiểu gen của SLGL ở Việt Nam là F. gigantica và dạng trung
gian (Fasciola sp.).
4.2.2. Về một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam
4.2.2.1. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen ty thể cox1
Toàn bộ 17 trình tự chứa đoạn gen cox1 đều phù hợp với F. gigantia. Kết quả
so sánh trình tự phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP. Dựa vào số nucleotide
sai khác với F. gigantica (KF543342.1, Trung Quốc), SLGL ở Việt Nam có 11
điểm đa hình với tổng số nucleotide sai khác tối đa là 6 và có 5 kiểu gen đơn bội
(haplotype). Cụ thể: 11 trình tự thuộc nhóm H8-CO1.FgVN là 15Tr-HN1, 15TrVP1, 15Tr-DT2, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 10B-NA1.2, 16D-NT1, 16D-NT2,
16C-NT1, 16C-NT2 và SLGL-N; mỗi nhóm H4-CO1.FgVN, H5-CO1.FgVN, H9CO1.FgVN có 1 trình tự, tương ứng là 15Tr-NA5, 09B-TN1.1, 15Tr-KH1; và có
3 trình tự nhóm H3-CO1.FgVN là 15Tr-DT1, 14B-CT2 và 09B-QN1.1.
4.2.2.2. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen ty thể nad1
Đoạn gen nad1 được phân tích có kích thước 535 bp. Toàn bộ 8 trình tự được
so sánh đều phù hợp với F. gigantica. Các chủng SLGL-N, 15Tr-VP1, 15Tr-HN1,
10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16D-NT1, 16C-NT1 có các vị trí sai khác giống nhau so
với F. gigantica (AB385616.1, Việt Nam) được xếp vào nhóm haplotype H1ND1.FgVN, trong khi kiểu sai khác của chủng 15Tr-NA5 khác các chủng còn lại
nên được xếp vào nhóm H2-ND1.FgVN. Như vậy, dựa vào trình tự đoạn gen
nad1 này, ghi nhận có 2 haplotype ở SLGL Việt Nam. Các phân tích về gen nad1
chỉ ra rằng, SLGL Việt Nam có quan hệ gần gũi với F. gigantica ở Châu Á hơn so


22

với F. gigantica ở Châu Âu, Châu Phi và xa hơn nữa so với F. hepatica. Một mặt
cũng cho thấy tính đa hình di truyền trên gen nad1 của SLGL ở Việt Nam.
4.2.2.3. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen nhân ITS1
Một số nghiên cứu cho rằng trên đoạn 680 bp được khuếch đại bởi cặp mồi
ITS1-F, ITS1-R có 6 điểm khác biệt giữa F. gigantica và F. hepatica. Đối với
SLGL ở Việt Nam, cũng với đoạn gen 680 bp này, 2 các thể 10B-HN1.9 và 15TrDT2 (trong số 16 cá thể được giải trình tự) có đoạn ITS1 tương đồng hoàn toàn

với F. hepatica thuộc haplotype H1 (KF982049.1, Iran), Fasciola sp.
(AB385611.1, Việt Nam; AB207145.1, Nhật Bản). Điều đáng nói là, 2 cá thể này
lại có hệ gen ty thể phù hợp với F. gigantica. Như vậy, 2 cá thể này có gen nhân
thuộc về F. hepatica còn gen ty thể thuộc về F. gigantica. Theo một số nghiên
cứu, các cá thể này là các cá thể lai, kết quả lai giữa F. gigantica (dòng mẹ) và F.
hepatica (dòng bố). Các cá thể dạng này đã từng được xác nhận ở SLGL tại Việt
Nam và một số nước trong khu vực như Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, cũng như
trên thế giới.
Ngoài phân tích toàn bộ đoạn dài 680 bp, phần trình tự 432 bp hoàn chỉnh của
đoạn ITS1 cũng được phân tích. Kết quả so sánh cho thấy, có không quá 5 vị trí
nu sai khác giữa SLGL Việt Nam so với SLGL thế giới. Các sai khác này cũng
nằm ở các vị trị số 24, 114, 208, 286 và 306 giống như Mas-Coma S. và CS
(2014) đã thông báo. Có 5 kiểu gen đơn bội từ H0-ITS1FgVN đến H5ITS1FgVN, với 11 cá thể thuộc nhóm H0-ITS1.FgVN, 1 cá thể thuộc nhóm H1ITS1.FgVN, 1 cá thể thuộc nhóm H2-ITS1.FgVN, 1 cá thể thuộc nhóm H3ITS1.FgVN và 2 cá thể thuộc nhóm H5-ITS1.FgVN.
4.2.2.4. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen nhân ITS2
Đoạn ITS2 ở SLGL của Việt Nam và Thế giới được chia ra làm 2 nhóm, nhóm
dài 361 bp (F. gigantica) và nhóm 362 bp (F. hepatica). So sánh trình tự của 2
nhóm thấy có 7 vị trí xuất hiện sai khác tại các nu số 207 (C/T), 218 (T/C), 231
(C/T), 270 (T/C), 276 (T/C), 327(-/T) và 334 (A/G). Đáng lưu ý, ở ví trí số 327 ở
nhóm 361 bp là 1 vị trí khuyết, còn ở nhóm 362 bp là “T”. Theo một số tác giả,
đặc điểm khác biệt nu trên đoạn giao gen ITS2 cũng như sự khác biết ở ví trí 327
trên đoạn gen này có tính quyết định phân biệt F. gigantica và F. hepatica. Đặc
điểm này cũng đã được một số tác giả sử dụng để xác định các cá thể lai ngoại
loài hay lai chéo ngược trong quần thể SLGL.
Trình tự ITS2 của SLGL ở Việt Nam có 3 kiểu gen đơn bội là H0-ITS2.FgVN,
H1-ITS2.FgVN và H6-ITS2.FgVN. Trong số 13 trình tự ITS2 được phân tích, có
2 trình tự thuộc nhóm H6-ITS2.FgVN là 10B-HN1.9 (Hà Nội) và 15Tr-DT2
(Đồng Tháp) có kích thước 362 bp, 11 trình tự ITS2 còn lại 361 bp (H0ITS2.FgVN và H1-ITS2.FgVN). Kết quả so sánh trình tự cho thấy, nhóm H0ITS2.FgVN và H1-ITS2.FgVN phù hợp với SLGL F. gigantica, nhóm H6ITS2.FgVN phù hợp với F. hepatica. Trên cây phả hệ, nhóm H0-ITS2.FgVN và
H1-ITS2.FgVN thuộc nhánh của F. gigantica, còn nhóm H6-ITS2.FgVN thuộc
nhánh của F. hepatica. Điều này một lần nữa cho thấy 2 cá thể SLGL là 10B-

23

HN1.9 (Hà Nội) và 15Tr-ĐT2 (Đồng Tháp) có gen nhân ITS2 phù hợp với F.
hepatica giống như ở ITS1. Còn lại 3 trình tự không được phân tích kiểu gen đơn
bội do xuất hiện lỗi từ vị trí 435. Theo Wannasan A và CS (2014), đây chính là
hiện tượng pha trộn kiểu gen giữa 2 loài F. gigantica và F. hepatica.
Riêng chủng SLGL duy nhất phân lập từ người có cả gen nhân và gen ty thể
phù hợp với F. gigantica. Kết quả giám định loài cá thể sán này bằng PCR-RFLP
dựa trên các chỉ thị cox1, ITS1 phù hợp với kết quả so sánh trình tự với ngân hàng
gen. Từ kết các quả phân tích này cho thấy cá thể SLGL phân lập từ người là F.
gigantica thuần chủng.
KẾT LUẬN
1. Về hình thái và phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam theo hình thái học
Sán lá gan lớn ở Việt Nam có chiều dài dao động từ 13,00 đến 46,00 mm (trung
bình 27,47 ± 5,27 mm), chiều rộng 5,00 - 15,00 mm (trung bình 9,43 ± 1,43 mm),
tỷ số chiều dài/chiều rộng 1,58 - 6,57 (trung bình 2,97 ± 0,68), khoảng cách từ giác
bụng đến cuối thân 12,00 - 43,50 (trung bình 24,61 ± 5,18 mm). Có sự đa hình về
hình thái của sán lá gan lớn ở Việt Nam. Dựa theo chiều dài cơ thể, đa số sán lá
gan lớn thuộc 2 nhóm nhỏ (29,43 %) và nhóm trung bình (62,34 %); nhóm kích
thước lớn chỉ chiếm 8,23 %. Các kiểu hình thái đều gặp ở các khu vực địa lý và
các vật chủ khác nhau.
2. Về thành phần loài và một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn
ở Việt Nam
2.1. Về thành phần loài
Trong số 225 cá thể SLGL ở Việt Nam trong nghiên cứu này, có 81,78 % cá thể
là F. gigantica và 18,22 % là các cá thể dạng trung gian Fasciola sp. (không xếp
loại là F. gigantica hay F. hepatica). Cả F. gigantica và Fasciola sp. đều xuất hiện
tại các vùng địa lý và ở các vật chủ khác nhau (trâu, bò, dê, cừu, người).
2.2. Về đặc điểm phân tử

Nghiên cứu của chúng tôi bước đầu cho thấy:
- SLGL ở Việt Nam có tính đa hình về di truyền, bao gồm 2 loại:
+ F. gigantica chiếm 81,78 %: những cá thể này có cả gen ty thể và gen nhân
phù hợp với F. gigantica thuần chủng trên ngân hàng gen.
+ Dạng trung gian Fasciola sp. (không xếp loại là F. gigantica hay F.
hepatica) chiếm 18,22 %, các cá thể này được chia làm 2 nhóm:
. Nhóm các cá thể có kiểu gen nhân hỗn hợp của 2 loài sán F. gigantica và F.
hepatica;
. Nhóm các cá thể lai với gen ty thể phù hợp với F. gigantica còn hệ gen nhân
phù hợp với F. hepatica.
- Đối với đoạn gen cox1: Đoạn nucleotide chứa 1 phần gen cox1 của tất cả các
mẫu SLGL được phân tích phù hợp với F. gigantica. Trên đoạn nucleotide kích