Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. I
MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN ................................................................................................ 3
1.1 RONG BIỂN ............................................................................................................... 3
1.1.1 Phân loại rong biển .............................................................................................. 3
1.1.2 Thành phần hóa học của các loại rong biển ........................................................ 4
1.1.3 Rong lục ................................................................................................................ 6
1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN ......................................... 7
1.2.1 Tiềm năng rong biển để sản xuất ethanol ............................................................ 7
1.2.2 Quá trình xử lý sơ bộ nguyên liệu rong biển ........................................................ 9
1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển ............................................................................. 9
1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển .................................... 17
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU
RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM ........................................................... 24
1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển trên thế giới
..................................................................................................................................... 24
1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển ở Việt Nam
..................................................................................................................................... 27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 30
2.1 VẬT LIỆU ................................................................................................................. 30
2.1.1. Rong lục ............................................................................................................. 30
2.1.2 Chế phẩm Enzyme .............................................................................................. 30
2.1.3 Chế phẩm nấm men ............................................................................................ 30
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 31
2.2.1 Các phương pháp phân tích ............................................................................... 31
2.2.2 Phương pháp toán học ....................................................................................... 42
2.2.3 Thiết kế các nghiên cứu ...................................................................................... 43
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................... 51
3.1 LỰA CHỌN RONG LỤC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG LUC VIÊT NAM
......................................................................................................................................... 51

3.1.1 Lựa chọn các loài rong lục

Vi t Nam............................................................ 51
iii


3.1.2 Thành phần hóa học của các loài rong đư c chọn ............................................ 53
3.1.3 Nghiên cứu biến động thành phần hóa học của rong lục Chaetomorpha linum
Cladophora socialis theo chu k s ng ......................................................................... 56
3.1.4 Thành phần các loại đường của rong Chaetomorpha linum và Cladophora
socialis ......................................................................................................................... 61
3.2 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG CHAETOMORPHA LINUM64
3.2.1 Nghiên cứu xử lý nguyên liệu rong Chaetomorpha linum trước thủy phân ....... 64
3.2.2 Nghiên cứu quá trình thủy phân rong lục bằng axit........................................... 66
3.2.3 Nghiên cứu quá trình thủy phân rong lục bằng chế phẩm enzyme thương mại . 75
3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH THỦY PHÂN
RONG CH. LINUM ........................................................................................................ 88
3.3.1Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit ........ 88
3.3.2 Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm
enzyme ......................................................................................................................... 89
3.3.3 Các yếu t ảnh hưởng đến quá trình lên men của dịch thủy phân bằng axit và
enzyme bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol .............................................................. 91
3.3.4 T i ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi chế
phẩm nấm men Red Ethanol ........................................................................................ 96
3.4 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH ĐƢỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI (SSF) CỦA
DỊCH RONG LỤC SAU TIỀN XỬ LÝ ......................................................................... 102
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 105
4.1 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 105
4.2 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 106
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 108

PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 116

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong biển ....................................................................... 4
Bảng 1. 2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối ......................................... 7
Bảng 1. 3 Thành phần hóa học rong biển và đường tạo thành bởi thủy phân của các loài
rong biển ................................................................................................................................ 9
Bảng 1. 4 Vi sinh vật lên men ethanol/butanol từ sinh khối rong biển ............................... 21
Bảng 1. 5 Diện tích và sản lượng tại thời điểm khảo sát (2009) và dự kiến đến năm 2015 ....... 28
Bảng 3. 1 Lựa chọn các loài rong lục ở Việt Nam .............................................................. 51
Bảng 3. 2 Thành phần hóa học của các loài rong lục được chọn ........................................ 54
Bảng 3. 3 Biến động sinh lượng rong lục trong một vụ trồng vào mùa thuận lợi ............... 56
Bảng 3. 4 Năng suất thu hoạch của các đối tượng rong lục được nuôi trồng luân canh trong
ao đầm tại miền Trung ......................................................................................................... 57
Bảng 3. 5 Thành phần carbonhydrate của sinh khối rong Ch.linum ................................... 62
Bảng 3. 6 Thành phần các loại đường của rong Cladophora socialis ................................. 63
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của muối NaCl trong nguyên liệu đến quá trình thủy phân rong Ch.
linum .................................................................................................................................... 65
Bảng 3. 8 Ảnh hưởng của kích thước rong đến quá trình thủy phân rong Ch. linum ......... 66
Bảng 3. 9 Ảnh hưởng của tỷ lệ rong trong dung dịch đến quá trình thủy phân rong Ch.
linum .................................................................................................................................... 66
Bảng 3. 10 Khoảng xác định của các yếu tố như sau .......................................................... 69
Bảng 3. 11 Mức thí nghiệm ................................................................................................. 70
Bảng 3. 12 Ma trận thực nghiệm ......................................................................................... 70
Bảng 3. 13 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố ......................................... 71
Bảng 3. 14 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong theo Box-wilson ..................................... 71
Bảng 3. 15 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch.

linum bằng axit .................................................................................................................... 73
Bảng 3. 16 Thành phần dịch thủy phân rong lục bằng axit ................................................ 74
Bảng 3. 17 Ảnh hưởng của nồng độ axit đến quá trình tiền xử lý rong lục ........................ 75
Bảng 3. 18 Hoạt độ các loại enzyme trong chế phẩm enzyme Viscozyme L và Cellulase 76
Bảng 3. 19 Khả năng thủy phân rong Ch.limum thành đường bởi các chế phẩm enzyme
thương mại ........................................................................................................................... 77
Bảng 3. 20 Khoảng xác định của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng enzyme ............. 81
Bảng 3. 21 Mức thí nghiệm trong tối ưu thủy phân bằng enzyme ...................................... 81

v


Bảng 3. 22 Ma trận thực nghiệm trong tối ưu thủy phân bằng enzyme .............................. 82
Bảng 3. 23 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng
enzyme ................................................................................................................................. 82
Bảng 3. 24 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong Ch. linum bằng enzyme ......................... 83
Bảng 3. 25 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch.
linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L ....................................................................... 85
Bảng 3. 26 Thành phần dịch thủy phân rong Chaetomorha linum bằng chế phẩm enzyme86
Bảng 3. 27 Hiệu suất thủy phân rong Ch. linum bằng axit và bằng chế phẩm enzyme
Viscozyme L ........................................................................................................................ 87
Bảng 3. 28 Khả năng lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi các
chủng nấm men khác nhau .................................................................................................. 88
Bảng 3. 29 Kết quả lên men ethanol và hiệu suất của các chủng nấm men trong môi trường
dịch thủy phân rong lục bằng axit được xác định bằng HPLC ............................................ 89
Bảng 3. 30 Khả năng lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm
enzyme bởi các chủng nấm men khác nhau ........................................................................ 90
Bảng 3. 31 Kết quả lên men ethanol và hiệu suất của các chủng nấm men trong môi trường dịch
thủy phân rong Ch. linum bằng chế phẩm enzyme được xác định bằng HPLC ........................... 90
Bảng 3. 32 Ảnh hưởng của nguồn nito đến quá trình lên men dịch thủy phân rong lục ..... 91

Bảng 3. 33 Khoảng xác định của các yếu tố trong lên men dich thủy phân bằng axit ........ 96
Bảng 3. 34 Mức thí nghiệm trong lên men dich thủy phân bằng axit ................................. 96
Bảng 3. 35 Ma trận thực nghiệm trong lên men dịch thủy phân bằng axit ......................... 97
Bảng 3. 36 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong lên men dich thủy
phân bằng axit...................................................................................................................... 98
Bảng 3. 37 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong lục bằng axit theo Boxwilson .................................................................................................................................. 98
Bảng 3. 38 Hàm lượng các loại đường và ethanol biến đổi trong quá trình lên men từ dịch
thủy phân axit ...................................................................................................................... 99
Bảng 3. 39 Hàm lượng các loại đường và ethanol biến đổi trong quá trình lên men từ dịch
thủy phân rong lục bằng enzyme ....................................................................................... 100
Bảng 3. 40 Hiệu suất lên men ethanol của quá trình lên men từ dịch thủy phân rong lục
bằng axit và bằng chế phẩm enzyme ................................................................................. 101
Bảng 3. 41 Kết quả của quá trình đường hóa và lên men đồng thời tại các thời điểm đường
hóa ban đầu khác nhau....................................................................................................... 102

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Thành phần carbohydrate của rong đỏ, rong nâu, rong lục .................................... 5
Hình 3. 1 Biến động hàm lượng protein theo chu kỳ sống của hai loài rong lục ................ 58
Hình 3. 2 Biến động hàm lượng tro theo chu kỳ sống của hai loài rong lục ....................... 59
Hình 3. 3 Biến động hàm lượng lipid theo chu kỳ sống của hai loài rong .......................... 60
Hình 3. 4 Biến động hàm lượng carbohydrate và tốc độ sinh trưởng theo chu kỳ sống của
hai loại rong lục ................................................................................................................... 60
Hình 3. 5 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Chaetomorpha linum. ............... 62
Hình 3. 6 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Cladophora socialis .................. 63
Hình 3. 7 Ảnh hưởng nồng độ axit sunfurit đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng
axit ....................................................................................................................................... 67
Hình 3. 8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit sunfurit. 68

Hình 3. 9 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit............................... 69
Hình 3. 10 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch.
linum bằng axit (A) .............................................................................................................. 72
Hình 3. 11 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng
enzyme ................................................................................................................................. 78
Hình 3. 12 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme ....... 79
Hình 3. 13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme 79
Hình 3. 14 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme ...................... 80
Hình 3. 15 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch.
linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L (A) ................................................................ 84
Hình 3. 16 Động thái nito tổng số trong quá trình lên men ................................................. 92
Hình 3. 17 Ảnh hưởng pH đến quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum .............. 93
Hình 3. 18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum ...... 94
Hình 3. 19 Động thái quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum ............................. 95

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

C

Nồng độ

Cs

Cộng sự

ĐLM

Đường lên men

ĐTP

Đường dịch thủy phân

EtOH

Ethanol

H

Hiệu suất

HaF

Lên men dịch thủy phân bằng axit

HeF

Lên men dịch thủy phân bằng enzyme

HLM

Hiệu suất lên men

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HTP

Hiệu suất thủy phân

SSF

Đường hóa và lên men đồng thời

Tb

Tế bào

tn

Thí nghiệm

V

Thể tích

v/v

Thể tích/ thể tích

VSV

Vi sinh vật

W

Khối lượng

w/v

Khối lượng/thể tích

τ

Thời gian

viii


MỞ ĐẦU
Khi nhu cầu năng lượng thế giới tiếp tục tăng và nguồn nhiên liệu hóa thạch đang giảm,
nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế thích hợp. Ethanol là sản phẩm nhiên liệu được sử
dụng phổ biến nhất và được nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu. Ethanol thường được sản
xuất từ tinh bột, đường mía và phụ phẩm nông nghiệp. Tuy nhiên việc sử dụng các sản phẩm
nông nghiệp làm nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol còn có hạn chế là chiếm một lượng lớn
đất nông nghiệp, cũng như nguồn nước, thời gian và công chăm sóc, canh tác… Hơn thế nữa
vấn đề này cũng đang đối mặt với những ý kiến chỉ trích cho rằng không thể sử dụng các sản
phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol trong khi mỗi ngày trên thế giới có hàng triệu người
chết đói vì thiếu lương thực.
Trước tình hình đó, hàng loạt các nghiên cứu nhằm tìm ra một nguồn nguyên liệu mới
trong việc sản xuất cồn sinh học được đẩy mạnh. Trong đó rong biển là một lựa chọn thích
hợp và đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Rong biển có sản lượng tự nhiên lớn,
vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ và nuôi trồng thu được sinh khối lớn.

Hàm lượng carbohydrate trong một số loài rong cao từ 40 - 79,4 %, rong có lignin thấp dễ
thủy phân, thành phần đường chủ yếu là đường 6 carbon nên dễ dàng lên men tạo ethanol.
Việt Nam có bờ biển dài hơn 3200 km có chứa sinh khối rong biển rất lớn, trong đó rong
lục là phổ biến nhất. Ước tính mỗi năm có khoảng 2 triệu tấn khô được tạo thành. Tuy nhiên
nguồn sinh khối này vẫn chưa được sử dụng hợp lý, chỉ có số ít loài được nghiên cứu chế
biến các sản phẩm sinh học, số còn lại tự phân hủy ngoài tự nhiên gây hiện tượng ô nhiễm. Vì
vậy nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong lục là một giải pháp thích hợp để tạo ra nhiên liệu
sạch, giải quyết ô nhiễm môi trường và gia tăng lợi ích kinh tế cho người dân ven biển.
Để sản xuất được ethanol nhiên liệu từ rong lục, cần phải tiến hành các bước: lựa chọn
đối tượng rong lục thích hợp, đảm bảo sinh khối ổn định bằng tiến hành nuôi trồng gia tăng
sinh khối, sử dụng các kỹ thuật xử lý nguyên liệu, tìm các phương pháp thích hợp để đường
hóa rong lục và lên men tạo ethanol. Về nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong lục tại
Việt Nam hiện nay mới được đề cập tuy vậy vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể. Do đó, chúng tôi
tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và
lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu” để đưa ra được một cách hoàn chỉnh
công nghệ lên men ethanol từ nguồn sinh khối rong lục.

1


Mục tiêu của đề tài
Chọn được rong lục thích hợp làm nguyên liệu cho lên men ethanol
Chọn được giải pháp công nghệ xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol
Chọn được giải pháp công nghệ lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục
Các nội dung nghiên cứu của đề tài
1. Nghiên cứu lựa chọn nguồn rong lục Việt Nam làm nguyên liệu cho lên men ethanol
2. Nghiên cứu chọn giải pháp xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol
3. Nghiên cứu chọn giải pháp lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục
Những đóng góp mới của luận án
- Nghiên cứu đầu tiên một cách có hệ thống về rong lục từ khảo sát lựa chọn nguồn rong lục

đến thủy phân và lên men ethanol
- Nghiên cứu nguồn rong biển Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất ethanol bằng phương pháp
thân thiện môi trường là hướng nghiên cứu phù hợp với xu thế của thế giới nhằm thay thế
nguồn nhiên liệu hóa thạch

2


CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 RONG BIỂN
1.1.1 Phân loại rong biển
Tảo được chia thành hai nhóm chính là microalgae và macroalgae, microalgae được gọi
là vi tảo hay tảo kích thước bé. Rong biển là macroalgae, được gọi là tảo kích thước lớn.
Rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản.
Quá trình phát triển của rong không qua giai đoạn phôi, có ba hình thức sinh sản: sinh sản
dinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng bào tử, sinh sản hữu tính bằng hình thức giao phối giữa
phối tử đực và cái. Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không
quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn. Rong biển chia thành ba ngành
chính: rong lục, rong đỏ và rong nâu [12,17].
Ngành rong lục: Nét đặc trưng nhất của các loài là có màu lục, sản phẩm quang hợp là
tinh bột. Về cấu tạo hình thái có nhiều dạng: dạng phiến, dang sợi, dạng ống. Rong lục có vỏ
bằng chất pectin hoặc xenluloza. Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ chứa sản
phấm của quá trình trao đổi chất. Thể sắc tố chủ yếu là chlorophyll và caroten, trong thể sắc
tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ và chứa tinh thể protein ở giữa. Trong dịch bào, sản
phẩm của quá trình trao đổi chất chủ yếu là đường, tanin, sunfat canxi và các chất có màu
antoxyan [12,17].
Ngành rong nâu: Hình thái đơn giản là dạng phiến, dạng sợi và hình thái phức tạp là
dạng cây có "gốc" "rễ" "thân" và "lá". Vỏ tế bào chia thành hai lớp, lớp trong là xelluloza,
lớp ngoài là keo fucoidin hay fucin. Thể sắc tố gồm chlorophyll a, c; xanthophyll, caroten và
fucoxanthyll - loại sắc tố có riêng trong rong nâu, có màu nâu, không tan trong nước. Sản

phẩm đồng hóa là mannitol, laminarin, glucoza..., đặc tính cùa rong nâu là có túi đường
fucoidan chứa đường fucoza [12,17].
Ngành rong đỏ: Rong có dạng trụ tròn, dẹp, phiến, chia nhánh hoặc không. Vỏ tế bào
gồm hai lớp, lớp trong là xenluloza, lớp ngoài là chất keo và pectin. Sắc tố của rong đỏ gồm
có : Sắc tố lục - chlorophyll, sắc tố vàng - xanthophyll, caroten, sắc tố đỏ - phycoerythrin, sắc
tố xanh lam - phycocyanin. Màu sắc của rong đỏ được quyết định bởi sự phối hợp và thành
phần của các sắc tố trên, vì vậy rong đỏ thường có màu đỏ (thẫm đến nhạt), màu hồng, màu
vàng lục nhạt, màu tím hay màu lam lục... Sản phẩm quang hợp của tế bào rong đỏ là một
loại đường đôi [12,17].

3


1.1.2 Thành phần hóa học của các loại rong biển
Rong biển có thành phần hóa học biến đổi theo từng ngành rong và được tác giả Kim
miêu tả tóm lược trong bảng 1.1 [51]
Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong biển
Thành phần
hóa học (%)

rong biển
rong lục

rong đỏ

rong nâu

Tỷ lệ nƣớc

70-85

70-80

79-90

Chất tro

10-25

25-35

30-50

Carbohydrate

25-50

30-60

30-50

(thành phần)

(Cellulose,

(Agar,

(Alginate,

tinh bột)

Carrageenan)

Fucoidan)

10-15

7-15

7-15

1-2

1-5

2-5

Protein
Lipid

Thành phần hóa học của rong biển có bốn thành phần chính tro, lipid, protein và
carbohydrate. Sản xuất nhiên liệu sinh học chủ yếu sử dụng hai nguồn lipid và carbohyrate.
Trong rong biển carbohydrate chiếm tỷ trọng cao 25-60 %w thích hợp cho sản xuất nhiên liệu
hơn so với lipid có hàm lượng 1-5 %w.
Ở bảng 1.1 cũng cho thấy, thành phần polysaccharide khác nhau giữa các ngành rong biển:
rong nâu, lục, đỏ. Rong lục có thành phần polysaccharide như thực vật bậc cao, gồm tinh bột và
cellulose. Rong nâu và rong đỏ có thành phần polysaccharide dưới dạng agar, carrageenan,
alginate. Hàm lượng polysaccharide cao trong rong biển thì thích hợp để sản xuất ethanol sinh
học.
Rong biển có thành phần carbohydrate đa dạng, điều này được ghi nhận trong báo cáo

của Kim [51] và thể hiện trong hình 1.1

4


Hình 1.1 Thành phần carbohydrate của rong đỏ, rong nâu, rong lục
Theo số liệu hình 1.1 cho thấy carbohydrate trong rong đỏ gồm: agar, carrageenan,
xylane, mannan và một ít cellulose. Agar chiếm 50-70% trọng lượng khô là nguồn
carbohydrate chính, agar và carrageenan thủy phân tạo thành galactose, xylane thành xylose,
mannane thành mannose, và rất ít glucose từ cellulose, qua đó cho thấy hàm lượng glucose
được tạo ra từ rong đỏ sau thủy phân là rất thấp, nên rong đỏ không phải là nguyên liệu thích
hợp để sản xuất ethanol.
Trong rong nâu thành phần carbohydrate gồm alginate, fucoidan, laminaran, cellulose,
hàm lượng alginate cao 30-40% trọng lượng khô, là nguồn carbohydrate chính trong rong
nâu, và 5-6% cellulose, 7-10% fucoidan và laminaran. Alginate thủy phân thành Dmannuronic axit và M,D-glucuronic, fucoidan thủy phân thành L-fucose, galactose và ít
mannitol, cellulose thủy phân thành glucose, laminaran thủy phân thành glucose, mannitol.
Sản phẩm thủy phân cuối cùng của rong nâu có chứa nhiều loại đường và hàm lượng đường
glucose thấp, do vậy việc sản xuất ethanol từ rong nâu không hiệu quả.
Carbohydrate trong rong lục gồm cellulose, tinh bột, xylane, ulvan, paramylon, trong đó
cellulose và tinh bột là 2 thành phần chính, cellulose và tinh bột khoảng 40-50%. Do vậy khi
thủy phân rong lục sẽ thu được một lượng lớn glucose, ngoài ra glucose còn được thu nhận từ

5


thủy phân paramylon (β-1,3-glucan), tạo ra nguồn glucose dồi dào. Vì vậy trong rong biển,
rong lục rất thích hợp làm nguồn nguyên liệu để sản xuất ethanol.
1.1.3 Rong lục
Theo các mô tả của hai tác giả Nguyễn Hữu Dinh, Phạm Hoàng Hộ, Tsutsui cho đến
nay các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong ngành rong lục có trên dưới 360 chi và hơn 5700

loài, phần lớn là sống trong nước ngọt, còn nước mặn chủ yếu là những chi sau đây:
Monostroma, Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Rhizoclonium, Cladophora, Chaetomorpha,
Cladophoropsỉs, Boergesenm, Valonia, Valoniopsis, Struvea, Boodlea, Microdyction,
Caulerpa, Bryopsis, Codium, Acetabularia v.v... [12,17, 92]
Nét đặc trưng nhất của các loài trong ngành là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh
bột. Hình dạng một tế bào hoặc nhiều tế bào có dạng phiến, dạng sợi, chia nhánh hoặc
không; trừ một vài trường hợp rong chỉ là một tế bào trần không có vỏ, còn đại đa số đều có
vỏ cấu tạo pectin hoặc cellulose.
Nguyên sinh chất có thành mỏng, ngay sát thành là vỏ tế bào; ở giữa là một túi lớn chứa
đầy dịch bào. Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ chứa sản phấm của quá trình trao
đổi chất. Thành phần nguyên sinh chất: Thể sắc tố có nhiều dạng khác nhau: phiến, đai vành
móng ngựa, sao nhiều cạnh, xoắn lò xo, mắt lưới, hạt nhỏ v.v...; sắc tố chủ yếu là chlorophyll
và caroten, trong thể sắc tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ và chứa tinh thể protit ở
giữa, hạt tạo bột khi gặp dung dịch KI dễ bắt màu, nên trở thành một trong những tiêu chuẩn
phân loại. Nhân thường nằm ở giữa khoang túi dịch bào, hay sát bên thành lớp nguyên sinh,
thể nhiễm sắc hình que ngắn hay hạt nhỏ.Trong dịch bào, sản phẩm của quá trình trao đổi
chất chủ yếu là đường, tanin, sunfat canxi và các chất có màu antoxyan. Ở một vài loài, sản
phẩm quang hợp không phải là tinh bột mà là những giọt giống như chất bơ.
Sinh sản bằng nhiều hình thức khác nhau. Sinh sản dinh dưỡng: một tế bào mẹ cắt thành
hai tế bào mới; loại nhiều tế bào thì có thể một phần cơ thể đứt ra rồi phát triển thành cây
riêng khác. Sinh sản vô tính: tế bào dinh dưỡng phân chia thành nhiều bào tử, gặp điều kiện
thuận lợi hình thành vỏ tế bào và phát triển thành cá thể mới. Sinh sản hữu tính bằng sự thụ
tinh giữa phối tử đực với phối tử cái, phức tạp hơn là đã hình thành tinh tử và trứng gọi là
noãn phối. Sự hiểu biết chi tiết về sinh sản sẽ là tiền đề tạo ra sinh khối bền vững cho phát
triển nhiên liệu. [12,17, 92].
Rong Chaetomorpha linum (Ch.linum)
Hình dạng: Rong dạng sợi, hơi cứng, dai, dài 5-10cm hoặc hơn, không chia nhánh, có
màu xanh lục, phần nổi trên mặt nước hơi vàng, sợi rong óng mượt như tơ. Khi về già màu

6

xanh đậm hơn, sợi rong dày hơn, chiều ngang 100-150 µm, chiều dài các đốt không đều
nhau, chiều dài bằng chiều ngang hoặc dài gấp 1,5 lần chiều ngang.
Tế bào dinh dưỡng khi hình thành túi bào tử phình rộng ra 160-170 µm, có thể sắc tố
dạng lưới, nhiều hạt tạo bột.
Rong sống tự do thường đan kết vào nhau thành chùm và trộn lẫn với các loại rong khác
(Enteromopha, Caladophra, Rhizoclonium). Rong sống trong các đầm nước lợ và phát triển
mạnh vào tháng 3-9 hàng năm
Hình thức sinh sản: Sinh sản vô tính bằng bào tử động có bốn tiêm mao. Bào tử được
hình thành ở bất kì tế bào nào của sợi, mỗi tế bào hình thành nhiều bào tử và các bào tử thoát
ra ngoài bằng một lỗ chung. Sinh sản hữu tính bằng phối tử có hai tiên mao, kiểu
heterogamia, được hình thành giống như bào tử động.
1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN
1.2.1 Tiềm năng rong biển để sản xuất ethanol
Rong biển là nguồn sinh khối bền vững cho công nghiệp nhiên liệu xanh được thể hiện
qua các ưu thế sau: đã tạo ra nguồn sinh khối vô tận cho tự nhiên, tốc độ tăng trọng nhanh,
sinh khối rong biển chiếm ưu thế hơn so với các nguồn sinh khối khác, khả năng chuyển hóa
thành các dạng năng lượng từ rong biển tốt hơn các sinh khối khác [34, 99]. So với các loại
sinh khối trên cạn, sản lượng rong biển thu hoạch hàng năm gấp 3 so với sản lượng cây lương
thực và 60 lần so với cây lấy gỗ. Thời gian thu hoạch liên tục nhiều lần trong năm (4-6 lần
/năm). Rong biển dễ dàng canh tác nuôi trồng, sử dụng vùng biển rộng lớn, không sử dụng
vật liệu khó khăn như: thuỷ lợi, phân bón, đất,….[51,78]

Bảng 1. 2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối
Thực vật trên cạn
Đƣờng-Tinh bột

Thực vật biển

Gỗ

Rong biển

Gỗ mền và gỗ cứng

Các loài rong biển

1-2 lần/ năm

Ít nhất 8 năm

4-6 lần/ năm

Năng suất (tân tƣơi/ha)

180

9

565

Hấp thụ CO2 (tấn/ha)

5-10

4,6

36,7

Đơn giản

Phức tạp

Đơn giản

Nguyên liệu thô
Thời gian thu hoạch

Quá trình sản xuất

Mía đường, ngô,
các loại củ

Ánh sáng, CO2,
Điều kiện nuôi trồng

thuỷ lợi, đất, phân
bón

Ánh sáng, CO2, thuỷ Ánh sáng, CO2, nước
lợi, đất, phân bón

biển

7


Theo đánh giá của tác giả Bruton rong biển không phải là cây lương thực nên không
ảnh hưởng an ninh lương thực, nguồn nguyên liệu không cạnh tranh đất trồng nông nghiệp,

không cần sử dụng phân bón, không gây ô nhiễm môi trường, hấp thụ tốt CO2 và chất dinh
dưỡng cải tạo môi trường, khả năng sinh trưởng phát triển tốt, có sinh khối lớn, chu kỳ nuôi
trồng ngắn, nuôi trồng đạt năng suất cao, mang lại lợi nhuận cao cho người trồng rong, vì vậy
rong là nguồn nguyên liệu lý tưởng để sản xuất bioethanol [33,78].
Theo các tác giả Phạm Văn Ty và cs tế bào thực vật trên cạn có thành phần chính gồm
cellulose, hemicellulose, lignin; ba thành phần này liên kết chặt chẽ với nhau có sức bền cơ
học cao, trong đó lignin là cơ sở tạo ra các mô gỗ của cây, việc phân hủy tế bào hóa gỗ là vô
cùng phức tạp [18]. Do vậy nghiên cứu ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối gỗ
gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi công nghệ cao. Trong khi đó theo báo cáo của Kim vi tảo và
rong biển lại dễ bị phân hủy do chỉ chứa cellulose và các polysachrid hòa tan. Dưới tác động
của nhiệt, enzyme, axit các nhóm polysacchrid này bị thủy phân thành các dạng đường đơn.
Đây là nguồn cơ chất quan trọng cho vi sinh vật thực hiện quá trình lên men sản xuất nhiên
liệu sinh học, điều này cho thấy sinh khối rong, tảo từ biển được sử dụng dễ dàng hơn so với
sinh khối thực vật trên cạn [51].
Để sản xuất được nhiên liệu từ nguồn sinh khối thực vật trên cạn với quy mô công
nghiệp thông thường sử dụng phương pháp kỹ thuật phức tạp trải qua nhiều công đoạn xử lý,
những công nghệ này đòi hỏi đầu tư trang thiết bị hiện đại, vì vậy sẽ nâng giá thành sản phẩm
lên cao [18]. Ngược lại công nghệ cho sản xuất nhiên liệu từ nguồn sinh khối biển đơn giản
hơn. Các phương pháp xử lý nguyên liệu không yêu cầu kỹ thuật phức tạp, các công nghệ này
đầu tư trang thiết bị ít tốn kém, hiệu suất ổn định, chất lượng tinh sạch cao.
Theo báo cáo của John Rojan và Nigam nhiên liệu sinh học sản xuất từ rong biển là một
thay thế cho nhiên liệu hóa thạch. Các sản phẩm nhiên liệu từ sinh khối tảo thân thiện với môi
trường và chất lượng ổn định. Vì vậy nhiên liệu sinh học từ rong biển đang được khuyến
khích phát triển tại hầu hết các quốc gia trên thế giới. Các sản phẩm nhiên liệu sản xuất từ tảo:
dầu thực vật, dầu diesel sinh học, ethanol sinh học, biogasoline, biomethanol, butanol sinh
học và nhiên liệu khác [28,46, 68, 88].
Theo các tác giả Goh, Nahak và Jones quá trình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ rong
biển được thực hiện theo ba bước chính, bước 1 xử lý rong biển sau thu hoạch, bước 2 thủy
phân rong biển đã được xử lý, bước 3 tiến hành lên men dịch thủy phân rong biển [67; 38;
47].

8


1.2.2 Quá trình xử lý sơ bộ nguyên liệu rong biển
Theo báo cáo của Bruton và Roesijadi hầu hết các dạng rong biển sau thu hoạch phải
được tiền xử lý trước khi ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học. Bước đầu tiên của tiền xử lý
là rong biển tươi sau thu hoạch được loại tạp, loại muối bằng cách tách mảnh vụn như đá, cát,
ốc hoặc rác rồi rửa với nước, sau đó rong được sấy khô đến độ ẩm 10-15%, lưu giữ, chuẩn bị
cho quá trình thủy phân. Trước khi thủy phân rong được xử lý cơ học, xay nghiền bằng máy
nghiền búa nhằm làm nhỏ kích thước rong (0,5-5mm) giúp cho quá trình thủy phân diễn ra
dễ dàng [33, 79].
1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển
Sau khi tiền xử lý, rong biển được thủy phân, quá trình này chuyển hóa các dạng
polysaccharide thành monosaccharid, làm nguyên liệu cho quá trình lên men. Rong biển được
thủy phân bằng hai phương pháp, thủy phân bằng axit và thủy phân bằng enzyme.
Nghiên cứu của Jang cho thấy carbohydrate rong biển của cả ba loại rong (nâu, đỏ, và
lục) được thủy phân một cách hiệu quả để tạo ra monosacarid bởi axit sunfuric loãng ở nhiệt
độ cao [45]. Bốn yếu tố quan trọng tác động đến quá trình trình thủy phân bằng axit sulfuric
được xác định là (i) nhiệt độ phản ứng, (ii) thời gian phản ứng, (iii) nồng độ axit và (iv) khối
lượng rong biển.
Nghiên cứu của Kim chứng minh hiệu quả của việc kết hợp tiền xử lý bằng axit sau đó
thủy phân bằng enzyme trong quá trình đường hóa rong biển, tạo ra hàm lượng đường cao
0,566 g/g rong Gracilaria amansii và 0,376 g/g của rong Laminaria japonica [52]
Theo Wei N. thành phần hóa học của rong biển sau thủy phân được trình bày trong
bảng 1.3 [98].
Bảng 1. 3 Thành phần hóa học rong biển và đƣờng tạo thành bởi thủy phân của các loài
rong biển
Thành
phần loài

Ngành Thành phần
rong Polysaccharide

Gelidium
amansii

amansii
Gelidium
amansii

Rong đỏ

Gelidium

Đường
Carbohydrate
dịch thủy
tổng số
phân
(%w/w)
(%w/w)

Hiệu suất
thủy phân
(%)

75.2

34.6

46.01

77.2

56.6

73.32

83.6

67.5

80.74

Agar,
Carrageenan,

Các loại
đường
dịch thủy
phân

Glucose,

Cellulose

Galactose

9

Laminaria
Laminaran

japonica

japonica

Rong nâu

Laminaria

Sargassum

Alginate,

Ulva

72.45

59.5

34

57.14

39.6

9.6

24.24

54.3

19.4

35.73

65.2

59.6

91.41

Glucose,

Fucoidan,
Cellulose
Tinh bột,

Rong lục

lactuca

37.6

Mannitol,

fulvellum

Ulva

51.9

cellulose,
Ulvan

pertusa

Mannitol

Glucose

Bảng 1.3 cho thấy kết quả thủy phân các loại rong biển có nhiều sự khác biệt, có hiệu
suất thủy phân dao động 25-90%, kết quả thủy phân phụ thuộc vào thành phần đường của
từng đối tượng rong biển.
1.2.3.1 Thủy phân bằng axit
Theo tổng quan của Wei N., dưới tác động của axit các polysaccharide của rong biển sẽ
bị cắt nhỏ thành các oligo hoặc monosaccharid. Các ion H+ của axit tác động trực tiếp đến
polysaccharide tại các liên kết mắt xích nối các monosacchadid tạo ra các oligo hoặc
monosaccharid. Quá trình thủy phân rong của axit tạo ra hỗn hợp dung dịch đường cần cho
quá trình lên men ethanol [98].
Theo nghiên cứu của Kalpana rong Kappahycus alvarezii được thủy phân theo tỷ lệ 50 g
rong/l với axit sunfuric 0,9N tương đương 5% v/v trong 1 giờ tại 100 oC [49], theo nghiên cứu
của Wang thủy phân rong Gracilaria salicornia trong điều kiện thủy phân bằng axit sunfuric
2%, trong 30 phút ở nhiệt độ 120 oC, hiệu suất của quá trình thủy phân 4,3g glucose/kg rong
tươi [96], theo tác giả Karunakaran rong Eucheuma sp.và Hypnea sp. được thủy phân bởi axit
sunfuric 1% tại nhiệt độ 100 oC trong 3 giờ với nồng độ chất khô 20g/l, dung dịch đường sau
thủy phân thu được dịch đường có nồng độ 11,1 g/l. Theo nghiên cứu Michul Yoon đã sử
dụng kỹ thuật xử lý mẫu bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma đã mang lại hiệu quả tích cực

cho công nghệ sản xuất cồn. Thành phần loài được sử dụng trong nghiên cứu này là Undaria
sp., đây là loài có sinh khối vô cùng lớn được nuôi trồng và khai thác tự nhiên tại Hàn Quốc.
Mẫu rong biển sau khi thu hoạch ngoài tự nhiên sẽ được xử lý với tia Gamma với liều chiếu 0,
10, 50, 100, 200 và 500 kGy, sau đó thủy phân trong axit sunfuric 1% w/v ở nhiệt độ 121 oC

10


trong 3 giờ. Sau quá trình thủy phân hỗn hợp rong sẽ được trung hòa với CaCO3 rồi lên men
với nấm men. Hàm lượng glucose thu được vào khoảng 72- 204 g/kg đường tổng số [62].
Theo nghiên cứu của Mohammad loại gỗ mền cây Vân Sam theo tỷ lệ gỗ phối trộn 1/3
rồi thủy phân bằng axit sunfuric có nồng độ 10g/l ở nhiệt độ 228 oC trong 11 phút, sau đó lọc
thu dịch đường. Tuy nhiên hỗn dịch này chứa 5,7g/l furfural và 7,3 g/l HMF (5hydroxylmethyl furfural) làm cho quá trình lên men khó diễn ra [63]. Theo Lynd gỗ được xay
nhỏ về kích thước 10 mm sau đó được thủy phân trong axit 75% v/v tại nhiệt độ 50 oC, rồi
pha loãng nồng độ axit xuống 20-30% v/v và tiếp tục thủy phân trong 1 giờ để tạo ra hỗn hợp
đường glucose và xylose và bã gỗ, sau đó thu hồi đường và tiếp tục thủy phân bã lần hai.
Trong quá trình thủy phân này các loại đường tạo thành là 70% glucose và 30% xylose
[57].Theo nghiên cứu của Pattana Laopaiboon bã mía được thủy phân bằng axit sunfuric
3%v/v trong 2 giờ ở 120 oC để tạo ra dịch đường sử dụng cho lên men axit lactic [73].
Như vậy từ các nghiên cứu trên cho thấy, các sinh khối khác nhau điều kiện thủy phân
khác nhau, với đối tượng rong biển thường được thủy phân bằng axit sunfuric có nồng độ 15%v/v, nhiệt độ 100 - 120 oC thời gian từ 1-3 giờ. Vì vậy trong nghiên cứu này để thủy phân
được nguyên liệu rong lục chúng tôi khảo sát nồng độ axit sunfuric từ 1-4% v/v, nhiệt độ 90130 oC, thời gian 20-90 phút.
1.2.3.2 Thủy phân bằng enzyme
Hiện nay quá trình thủy phân sinh khối bằng enzyme được nhiều tác giả quan tâm
nghiên cứu, để thực hiện được quá trình này sinh khối cần được tiền xử lý rồi bố sung chế
phẩm enzyme thực hiện đường hóa. Trong đó phương pháp tiền xử lý và đường hóa của mỗi
loại sinh khối là khác nhau.
Nhóm nghiên cứu đề tài Biomass do Phan Đình Tuấn trường đại học Bách Khoa
TP.HCM phụ trách đã nghiên cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp
như rơm, rạ, trấu.... nhằm sản xuất ethanol. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, quá trình

thủy phân nguyên liệu theo phương pháp nổ hơi rồi thủy phân với enzyme cellulase ở nhiệt
độ 50 oC, pH 4.8 thu được 200g glucose từ 1 kg rơm rạ [19].
Theo tác giả Nguyễn Thị Minh Phương đã tiến hành nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ để
nâng cao hiệu suất thủy phân bằng enzyme cho sản xuất etanol sinh học. Nguyên liệu được
tiền xử lý NaOH 5% w/w rơm khô và gia nhiệt 100 oC trong 2 giờ, sau đó thu được 56% bã
cellulose được thủy phân bằng tổ hợp enzyme (Cellic® CTec2 và Cellic® HTec tỷ lệ 4:1) với
hoạt độ sử dụng 16,25 U/g. Thực hiện quá trình thủy phân trong 94,2 giờ, quá trình này thu
được lượng đường khử (có hàm lượng glucose 33,3%; xylose 13,4%, galactose 4% và
arabinose 1,3%) đạt 49,2% so với rơm rạ[15].
11


Cùng hướng sản xuất bioethanol từ bã thải nông nghiệp, nhóm nghiên cứu của tác giả
Vũ Nguyên Thành đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu công nghệ và hệ thống thiết bị sản xuất
cồn nhiên liệu từ phụ phẩm nông nghiệp (BIOMASS). Kết quả đề tài đã thu được một số kết
quả khả quan về enzyme thủy phân hemicellulose, giống nấm men có khả năng lên men các
loại đường từ quá trình thủy phân. Nguyên liệu mà tác giả nghiên cứu là bã mía đã được xay
nhỏ về kích thước 6 mm, tiền xử lý với sunfuric 0,75%, nhiệt độ 121 oC trong 1 giờ và tiếp
tục xử lý với NaOH 1,5% trong 1 giờ thu được 88,9% cellulose tương đương 55 g
cellulose/100g bã mía. Sau đó cellulose vô định hình được đường hóa và lên men đồng thời ở
nồng độ chất khô 15% [23].
Một nghiên cứu khác của tác giả Tô Kim Anh đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu tạo
enzyme tái tổ hợp thủy phânlignocelluloses phục vụ sản xuất cồn nhiên liệu. Nguyên liệu
lignocelluloses sử dụng cho nghiên cứu này được thu nhận từ bã mía. Bã mía có kích thước <
5mm, độ ẩm 5%, cellulose 47%. Nguyên liệu được tiền xử lý NaOH 0,1g/1g bã mía, và gia
nhiệt 121 oC trong 1 giờ, sau đó thu cellulose mang thủy phân bằng tổ hợp enzyme nồng độ
5U endoglucanase, 10U CMCase exoglucanase, 30U betaglucosidase theo tỷ lệ chất khô
1/15. Thực hiện quá trình thủy phân tại pH 4,8, nhiệt độ 50 oC trong 48h, khuấy 150 v/phút.
Kết thúc thủy phân sử dụng enzyme laccase với tỉ lệ 70 U/g bã mía phá hủy phenol. Kết quả
nghiên cứu này thu được 330g glucose/kg bã mía, rồi lên men thu được 120 g ethanol/kg bã

mía
Theo tác giả Nguyễn Minh Hải đã nghiên cứu tối ưu hóa tiền xử lý bã rong
Chaetomorpha sp. bằng sunfuric để sử dụng trong sản xuấtethanol sinh học. Trong nghiên
cứu này tác giả sử dụng bã thải rong Chaetomorpha sp..Rong Chaetomorpha sp. được chiết
trong NaOH 0,75% w/v, tỷ lệ rong 1/20, chiết ở 50 oC trong 1 giờ sau đó ly tâm thu dịch nổi
protein, phần bã được sấy khô sử dụng lên men ethanol. Bã được sấy về độ ẩm 4% sau đó bã
rong được được phối trộn tỷ lệ 1/10 rồi xử lý với axit 1,75% w/v tại nhiệt độ 120 oC trong 34
phút, sau đó trung hòa với Ca(OH)2 lúc này hàm lượng đường thu được là 20,7 g/l rồi bổ
sung enzyme Cellic Ctec2 nồng độ 20 FPU/g và Novozyme 188 nồng độ 4 CBU/g và nấm
men tiến hành đường hóa và lên men đồng thời thu được hàm lượng cồn 1,94 % v/v [13].
Quá trình thủy phân sinh khối rong biển bằng enzyme như sinh khối lignocellulose gồm
hai bước tiền xử lý và đường hóa. Tiền xử lý rong nhằm đảm bảo khả năng tiếp cận của
enzyme đến các liên kết của các polysaccharide. Quá trình tiền xử lý sinh khối rong biển phụ
thuộc vào cấu trúc sinh học của mỗi loại rong. Quá trình tiền xử lý được sử dụng trong nghiên
cứu của tác giả Leilei và cs đã tiền xử lý bã rong nâu Laminaria japonica trong điều kiện axit
sufurid nồng độ 0,1 % w/v, 121 oC, thời gian 1 giờ [37]. Theo nghiên cứu của Isa và cs rong
12


lục Ulva sp. được tiền xử lý ở nhiệt độ 121 oC trong 20 phút [44], theo tác giả Nadja và cs
rong lục Chaetomorpha linum được tiền xử lý theo nhiều phương pháp, như tiền xử lý nhiệt
cao 190-200 oC trong 5 phút, nổ hơi ở áp suất 1,9 Mpa và chiếu plasma trong 48 giờ.
Sau quá trình tiền xử lý, rong biển được thủy phân bởi nhóm enzyme hydrolase là phức
hệ enzyme cellulase, laminariase, galactase được thu nhận từ vi sinh vật. Trong số những vi
sinh vật có khả năng thủy phân sinh khối rong biển, nấm mốc Trichoderma reesei được quan
tâm nhiều hơn cả. Nấm mốc Trichoderma reesei có khả năng sinh một loạt các enzyme phân
hủy cellulose, laminaran, caragenan, agar thành đường và các cấu thành khác [98]. Theo Kim
và cs nhóm phức hệ enzyme này tác động đặc hiệu đến các polysaccharide rong biển và cắt tại
các vị trí đặc hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid và các monosaccharid (glucose,
manose, lanimarin, rhamnose…). Đây là các loại đường đơn cần cho quá trình lên men

ethanol của vi sinh vật [52]. Một số enzyme được sử dụng thủy phân rong biển như nghiên
cứu của Yanagisawa và cs sử dụng enzyme Meicelase do Nhật sản xuất từ Trichoderma
viride, có hoạt tính cellulase là 73,3U/g và cellobiase 227 U/g, enzyme này thủy phân tinh
bột, cellulose, cellobiose, beta glucan trong rong Ulva pertusa. Theo nghiên cứu của Nitin và
cs sử dụng các enzyme Viscozyme L, Cellulase 22086 và 22128 của công ty Novolzyme để
thủy phân các polysacchrid của rong Ulva fasciata, kết quả thủy phân thu được 88,2% đường
[69]. Theo nghiên cứu của Nadja và cs sử dụng enzyme Cellulast 1,5L của công ty
Novozyme, để thủy phân các polysacchrid của rong Chaetomorpha linum. Như vậy các
nghiên cứu thủy phân rong lục chủ yếu sử dụng enzyme có hoạt tính cellulase dùng cho thủy
phân.
Hiện nay trên thị trường có nhiều loại chế phẩm enzyme sử dụng cho nghiên cứu thủy
phân sinh khối lignocellulose. Theo nghiên cứu Phan Đình Tuấn thủy phân rơm rạ bằng chế
phẩm Cellusoft L của hãng Novozyme; theo nghiên cứu của Vũ Nguyên Thành thủy phân
rơm rạ bằng chế phẩm cellulast 1,5 L của hãng Novozyme; theo nghiên cứu của Samsuiri
thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Meicellase của hãng Meijii, Seika; theo nghiên cứu của
Geddes thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Biocellulase W của hãng Novozyme; theo nghiên
cứu của Nguyễn Thị Minh Phương thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Cellic® CTec2 và
Cellic® HTec2 của hãng Novozyme; Nguyễn Minh Hải thủy phân bã rong Chaetomorpha
sp.sử dụng chế phẩm Cellic® CTec2 và Novozyme 188 [13]. Bản chất các chế phẩm này
chứa các loại enzyme endoglucanse, exoglucanase, beta glucosidase, xylanase thủy phân
cellulose, hemicellulose, xylan. Trong nghiên cứu thủy phân rong Ch.linum, chúng tôi chọn
chế phẩm Viscozyme L của công ty Novozyme và Cellulase mã số C2605-50ml của công ty
Sigma. Trong đó chế phẩm Cellulase chứa các loại enzyme tương tự như các chế phẩm nêu
13


trên và Viscozyme L có chứa hệ enzyme rộng hơn như cellulase, glucanase, xylanase,
glucoamylase, galactosidase.
1.2.3.3 Ảnh hƣ ng các yếu tố đến quá trình thủy phân
a. Ảnh hƣởng của nồng độ axit và nồng độ enzyme

Trong quá trình thủy phân rong biển bằng axit, hàm lượng axit bổ sung có vai trò rất
quan trọng. Hàm lượng axit quá bé quá trình thủy phân cho hiệu suất thấp, thời gian thủy phân
kéo dài, tiêu tốn nhiều nhiên liệu phục vụ cho thủy phân. Ngược hàm lượng axit lớn, thời gian
thủy phân nhanh, hiệu suất thủy phân cao, nhưng mau hỏng thiết bị, tiêu tốn nhiều hóa chất
trung hòa hoặc vận hành và thiết bị tách axit, ngoài ra còn tạo nhiều sản phẩm phụ ức chế quá
trình lên men.
Các dạng axit sử dụng thủy phân sinh khối rong có tính oxi hóa mạnh (HCl, H2SO4,
HCHO….) nhưng đa phần trong các nghiên cứu thủy phân sinh khối rong biển theo tổng quan
của Wei. N thường sử dụng axit sunfuric [98]
Enzyme là sản phẩm sinh học có khả năng thủy phân các loại cơ chất mang tính đặc
hiệu. Trong nghiên cứu này rong biển là nguồn cơ chất cần được thủy phân, các loại
polysaccharide rong biển có tính đa dạng, thành phần polysaccharide gồm có agar, ulvan,
agilnate, fucoidan, cellulose, tinh bột…. mỗi loại polyme chịu tác động trực tiếp của các
enzyme như cellulase, beta-glucanase, glucosidase, alginatase, fucoidanase, ulvanase…trong
đó nồng độ các enzyme sử dụng thủy phân luôn luôn được nghiên cứu chi tiết. Nồng độ
enzyme thủy phân cao quá trình thủy phân diễn ra nhanh và hiệu suất cao và ngược lại, nhưng
để quá trình thủy phân diễn ra hiệu quả cần phải bổ sung enzyme một cách hợp lý để tránh dư
thừa gây lãng phí enyme. Nồng độ enzyme trong các nghiên cứu thủy phân rong biển thường
sử dụng nồng độ từ 15-50 U/g cơ chất [98,100]. Trong đó nồng độ enzyme thủy phân rong lục
của các nghiên cứu khác nhau, theo nghiên cứu Isa 2009 rong Ulva sp. thủy phân với enzyme
cellulase có tên thương phẩm Acerimonium hoạt độ 322 U/g, nồng độ enzyme sử dụng là 12% w/w rong nguyên liệu [44]. Theo nghiên cứu của Nitin rong Ulva fasiata thủy phân với
enzyme Viscozyme L và cellulase, nồng độ enzyme sử dụng là 0,4 ml enzyme/g rong nguyên
liệu [69]. Theo nghiên cứu của Yanagisawa rong Ulva pertusa thủy phân với enzyme
Micelase, nồng độ enzyme sử dụng là 1ml enzyme/ 20g rong nguyên liệu [100].
b. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nguồn sinh khối rong biển chứa nhiều polysaccharide có cấu tạo phức tạp, vì vậy để
chuyển hóa các polyme này thành phân tử đơn giản đòi hỏi cần xúc tác nhiệt trong quá trình
thủy phân. Trong đó nhiệt độ thủy phân cao thời gian thủy phân ngắn, và ngược lại. Trong
quá trình thủy phân rong biển, rong đỏ và rong nâu dễ bị thủy phân hơn rong lục, vì hàm
14

lượng cellulose trong rong nâu và đỏ thấp hơn nhiều so với cellulose của rong lục. Trong
nghiên cứu của Wang nhiệt độ thủy phân rong đỏ Gracilaria salicornia là 121 oC trong 30
phút [96], và theo nghiên cứu của Minchul Yoon nhiệt độ thủy phân rong nâu Laminaria
japonica là 121 oC trong 3 giờ [62] là thủy phân hoàn toàn. Nhưng đối với rong lục, theo
nghiên cứu của Isa ở nhiệt độ 121 oC trong thời gian 20 phút chỉ mới tiền xử lý nguyên liệu
cho thủy phân bằng enzyme, nghiên cứu của Nitin 2013 cũng chỉ ra ở nhiệt độ 121 oC trong
thời gian 1 giờ cho tiền xử lý rong Ulva fasiata, đối với rong Ch. linum tiền xử lý ở nhiệt cao
180-200 oC trong 10 phút [65]. Vì vậy để thủy phân rong lục hiệu quả ở nhiệt độ thích hợp
cần khảo sát hai yếu tố ảnh hưởng là nồng độ axit và thời gian thủy phân.
Trong thủy phân bằng enzyme nhiệt độ thủy phân đóng vai trò quan trọng, nếu thủy
phân cơ chất trong điều kiện nhiệt độ thấp hiệu suất thủy phân kém, nguyên nhân các loại
polysaccharide luôn có độ nhớt cao, tại nhiệt độ thấp độ nhớt tăng quá trình khuấy đảo khó,
enzyme khó tiếp cận với cơ chất dẫn đến hoạt độ enzyme hoạt động không như mong muốn,
vì vậy cần có điều chỉnh nhiệt hợp lý để enzyme thuận lợi trong tiếp cận cơ chất và sử dụng
các loại enzyme chịu nhiệt để có thể nâng cao hiệu suất thủy phân toàn diện. Nhưng cũng cần
phải chú ý tránh nâng nhiệt độ quá cao sẽ gây ra hiện tượng phá hủy enzyme và lúc này cơ
chất chịu tác động thủy phân bởi nhiệt chứ không phải enzyme gây ra hao phí enzyme, hao
phí nhiệt mà hiệu suất lại không cao. Quá trình sử dụng nhiệt trong các nghiên cứu thủy phân
rong biển bằng enzyme, theo nghiên cứu của Nitin thủy phân rong Ulav faciata là 45 oC [69],
theo nghiên cứu của Nadja thủy phân rong Ch.linum là 50 oC [65], và theo các nghiên cứu
khác, nhiệt độ thủy phân nguyên liệu cellulose từ gỗ mền, rơm rạ, bã mía trong khoảng 3040oC [20,23,60]
c. Ảnh hƣờng của thời gian thủy phân
Thời gian cũng góp phần quan trọng trong quá trình thủy phân, thời gian thủy phân
ngắn khi điều kiện thủy phân có nồng độ axit cao và nhiệt độ cao, thời gian dài khi điều kiện
thủy phân có nồng độ axit thấp và nhiệt độ thấp. Ba yếu tố này có quan hệ ràng buộc, thường
trong nghiên cứu và sản xuất các tác giả thường cố rút ngắn thời gian thủy phân để tránh hao
tốn nhiên liệu vận hành thiết bị, giảm thiểu tạo sản phẩm phụ và gây hỏng thiết bị. Theo các
tác giả Wei N. và Wang thời gian thủy phân sinh khối rong biển bằng axit thường diễn ra 2060 phút. [98,96]

Thời gian thủy phân bằng enzyme kéo dài hơn thủy phân bằng axit vì enzyme tiếp xúc
cơ chất và cắt các liên kết một cách chậm rãi. Thời gian thủy phân sinh khối rong biển theo
nghiên cứu của nhiều tác giả thường 30-48 giờ. Khoảng thời gian này là dài nên khả năng
nhiễm tạp là rất cao, vì vậy khi thủy phân bằng enzyme cần phải thực hiện các thao tác chuẩn,
15


và tiến hành các khảo sát đường hóa lên men đồng thời để thu được các sản phẩm như mong
muốn [60,62,100,75].
d. Ảnh hƣởng của nồng độ nguyên liệu
Khối lượng nguyên liệu bổ sung trong quá trình thủy phân có ảnh hưởng nhiều đến hiệu
suất thủy phân. Trong nghiên cứu thủy phân rong biển, nồng độ rong biển khi sử dụng cho
thủy phân thường không cao vì các polysaccharide của rong biển có độ trương nở lớn ảnh
hưởng đến hoạt động của axit và enzyme. Theo nghiên cứu của Nitin nồng độ rong lục Ulva
faciata sử dụng thủy phân là 50 g/lit [69]. Theo nghiên cứu của Nadja nồng độ rong lục Ch.
linum sử dụng thủy phân là 100 g/lit [65]. Theo nghiên cứu của Isa nồng độ rong lục Ch.
linum sử dụng thủy phân là 50 g/lit
e. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình thủy phân
Trong thủy phân bằng axit pH phụ thuộc nhiều vào nồng độ axit bổ sung ban đầu vì vậy
tất cả các đặc tính của yếu tố pH tương tự như của yếu tố nồng độ axit, còn đối với thủy phân
bằng enzyme pH là yếu tố quan trọng quyết định đến thủy phân. Yếu tố này chịu ảnh hưởng
của quá trình tiền xử lý và đệm bổ sung, hai quá trình này giúp ổn định pH trong quá trình
thủy phân. Theo nghiên cứu của Wang thủy phân rong Gracilaria salicornia bằng enzyme
cellulase (MP Biomedicals, LLC) có pH 5.0 [96], theo Nitin thủy phân rong Ulva faciata
bằng enzyme Viscozyme L và Cellulase 22086 của Sigma có pH 4.8 [69], theo Nadja thủy
phân rong Ch.linum được thủy phân bằng enzyme Cellulast 1,5L của công ty Novolzyme có
pH 4.8 [65], và theo các nghiên cứu khác, pH thủy phân nguyên liệu cellulose từ gỗ mền, rơm
rạ, bã mía trong khoảng 4.5-6 [20,23,60].
Điều kiện thủy phân của một số đối tƣợng rong biển
Sinh khối rong đỏ Gracilaria salicornia được tiền xử lý trong axit sunfuricloãng 2% ở

nhiệt độ 120 oC trong 30 phút sau đó được đường hóa và lên men nhờ enzyme thủy phân và vi
sinh vật [96].
Sinh khối rong nâu Laminaria japonica và Sargassum fulvellum được tiền xử lý trong
axit sunfuric0,1-0,3 N ở nhiệt độ 120 oC trong 20 phút, sau đó được thủy phân trong các loại
enzyme Celluclast 1.5L, Viscozyme L, Novoprime 959. [50]
Sinh khối rong lục có kết cấu vỏ tế bào bền vững hơn rong nâu và rong đỏ, nguyên nhân
sản phẩm cellulose được tổng hợp từ rong lục cao hơn các loại rong khác, do vậy quá trình
tiền xử lý cho thủy phân bằng enzyme phức tạp hơn.
Rong lục Ch. linum được tiền xử lý bằng nhiều phương pháp như là xử lý ở nhiệt độ cao
180, 190, 200 oC trong 10 phút; phương pháp thứ hai rong Ch. linum được gây nổ bởi áp suất

16


hơi (1,9 Mpa) ở nhiệt độ 200-210 oC trong 10 phút; phương pháp thứ ba rong xử lý với bước
sóng plasma trong thời gian (20-60 phút), điều kiện bước sóng (ø: 7 cm, length: 2 cm) [65]
Sinh khối rong lục chứa nhiều dạng polysacchrid ( cellulose, tinh bột, ulvan, agar…). Vì
vậy quá trình thủy phân sinh khối rong lục bằng enzyme tương đối phức tạp. Một giống vi
sinh vật thường chỉ có khả năng sinh một hoặc một vài loại enzyme thủy phân polysaccharide,
do vậy để có thể thu nhận enzyme đặc hiệu thủy phân sinh khối rong lục là điều rất khó. Cho
nên phương pháp kết hợp dùng nhiều giống vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme là điều kiện rất
khả quan để thủy phân sinh khối này. Nhóm phức hệ enzyme này tác động đặc hiệu đến các
polysaccharide bao gồm (celluose, hemicellulose, xylan, ulvan, agar, tinh bột), các
polysaccharide này sẽ bị enzyme cắt tại các vị trí đặt hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid
và các monosaccharid (glucose, rhamnose, xylose, galactose). Đây là các loại đường đơn cần
cho quá trình lên men ethanol của vi sinh vật.
Vì vậy cần tiến hành nghiên cứu để tìm ra điều kiện thủy phân thích hợp với từng đối
tượng rong cụ thể.
1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển
Các loại sinh khối sau khi được thủy phân bằng axit hoặc chế phẩm enzyme sẽ thu

được dịch thủy phân, sau đó dịch thủy phân được lên men ethanol với các nấm men khác
nhau. Quá trình lên men này phụ thuộc vào thành phần của dịch lên men và chất lượng của
các chủng nấm men.
Theo nghiên cứu của Phan Đình Tuấn 1kg rơm rạ được đường hóa lên men đồng thời
sẽ thu được 110 g ethanol. Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Minh Phương dịch thủy phân rơm rạ
có hàm lượng glucose 33,3%, xylose 13,4%, galactose 4% và arabinose 1,3% lên men thu
được 165 g ethanol/kg rơm khô [15]. Theo Vũ Nguyên Thành đường hóa lên men đồng thời
cellulose vô định hình từ bã mía ở nồng độ chất khô 15% để tạo ra độ cồn 5-6% tương đương
39 - 47 g ethanol [23]. Theo Tô Kim Anh thực hiện quá trình lên men từ 330g glucose/kg bã
mía, thu được 120 g ethanol/kg bã mía [20]. Theo Nguyễn Minh Hải và cs đã nghiên cứu bã
rong Chaetomorpha sp. sau khi sử lý được thực hiện đường hóa và lên men đồng thời ở nồng
độ cơ chất 10% w/v, nhiệt độ 35 oC, pH 5,0 trong 48 giờ với chế phẩm nấm men Lallemand
của Đan Mạch chứa chủng Saccharomyces cerevisiae, kết quả thu được ethanol 1,94% v/v,
đạt hiệu suất lên men 80% tương ứng 153g ethanol/kg bã Chaetomorpha sp.[13].
Quá trình lên men dịch thủy phân từ rong biển cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu,
theo nghiên cứu của Wang sản xuất cồn sinh học từ loài Gracilaria salicornia, dịch thủy phân
được lên men với Escherichia coli, đây là loại vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng lên men nguồn
cơ chất galactose, cho hiệu suất lên men 79,1gethanol/kg rong khô [96].Một nghiên cứu khác
17


của Ge Le sản xuất cồn từ bã thải rong Laminaria japonica sau khi sản xuất aginate, bã thải
được đường hóa rồi lên men bằng chủng Saccharose cerevisiae. Kết quả thu được sau thủy
phân 277,5 g glucose/kg bã thải khô và lên men thu được 122 g ethanol/ kg bã thãi. [37].
Theo nghiên cứu của Horn sản xuất ethanol từ hai loài rong Laminaria hyperborea và
Ascophyllum nodosum, rong được thủy phân bằng enzyme sau đó lên men với hai chủng
Zymobacter palmae, Pichia angophorae, kết quả lên men thu được 430g ethanol/kg đường
laminaran [41]. Theo nhóm nghiên cứu của tác giả Nag-Jong Kim thuộc trung tâm hóa học và
kỹ thuật sinh học phân tử đã tái tổ hợp gene mã hóa vào chủng E. coli tạo ra chủng giống có
tên khoa học E.coli K11 để tổng hợp ethanol từ nhiều loại đường glucose, mannose, galactose

và mannitol. Chủng vi sinh vật này đã được tiến hành lên men thử nghiệm với nguồn cơ chất
là hỗn hợp dung dịch đường được thủy phân bằng enzyme từ nguồn sinh khối của các loại
rong Ulva lactuca, Gelidium amansii, Laminaria japonica và Sargassum fulvellum. Trong đó
hiệu suất lên men sinh ethanol với nguồn cơ chất từ rong Laminaria japonica là cho hiệu suất
cao nhất, hàm lượng ethanol được xác định 400g ethanol/kg đường laminaran [66]. Ngoài ra,
theo nghiên cứu của Lee S.M. sử dụng dịch thủy phân rong Laminariajaponica chứa đường
manitol, laminaran được lên men với bốn chủng vi sinh vật gồm: Enterobacter sp., Panotoea
agglomerans, Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae. Trong đó chủng Candida lasitancae
lên men cho hàm lượng ethanol 30g/kg rong [55].
Theo tác giả Isa đã chọn rong Ulva sp. cho sản xuất ethanol, rong Ulva sp. thủy phân với
chế phẩm enzyme rồi lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae IR-2 thu được 150 g
ethanol/ kg rong [44].
Đầu năm 2011 nhóm nghiên cứu của Yanagisawa đã thủy phân rong Ulva pertusa rồi
lên men với Saccharomyces cerevisiae IAM 4178 thu được 185 g ethanol /kg rong[100].
Một nhóm nghiên cứu của phòng công nghệ sinh học thuộc trường cao đẳng
Vivekanandha, đã nghiên cứu sản xuất cồn từ rong Eucheuma sp. và Hypnea sp. Mẫu rong
được thủy phân bởi axit sunfuric sau đó lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae. Kết
quả sau lên men thu được 200 g ethanol/ kg rong [50].
Theo nghiên cứu của tác giả Kalpana, nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong Kappahycus
alvarezii. Rong Kappahycus alvarezii sau khi được thủy phân với axit sunfuric được lên men
với nấm men Saccharomyces cerevisiae (NCIM 3523), kết quả thu được 218 g ethanol/kg
rong[49]..
Theo nghiên cứu của Nadja đã tiến hành tiền xử lý rong Chaetomorpha linum ở nhiệt độ
cao 190-200 oC, nổ hơi ở áp suất cao và chiếu plasma trong. Sau đó đường hóa và lên men

18


đồng thời trong 200 giờ. Kết quả của nghiên cứu này đã thu được 180 g ethanol/kg rong khô
[65].

Trong quá trình lên men rong biển và các sinh khối khác, các tác giả sử dụng các hướng
nghiên cứu khác nhau gồm có lên men từ dịch thủy phân bằng axit, lên men dịch thủy phân
bằng enzyme và quá trình đường hóa lên men đồng thời. Có sự khác nhau của quá trình
đường hóa và lên men đồng thời (SSF) với quá trình lên men dịch thủy phân bằng enzyme
(HeF) và dịch thủy phân bằng axit (HaF). Quá trình SSF cần có thời gian đường hóa ban đầu
để trong dịch có một lượng dinh dưỡng nhất định đủ đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát
triển của nấm men trong giai đoạn ban đầu của quá trình lên men và sau đó quá trình đường
hóa và lên men điễn ra đồng thời. Mỗi phương pháp lên men thích hợp với từng nguyên liệu
khác nhau, trong đó nguyên liệu rong đỏ, rong nâu thường được đường hóa bằng axit rồi lên
men [37,50,96], nguyên liệu rong lục và rơm rạ, bã mía, gỗ mền được đường hóa bằng
enzyme rồi lên men hoặc đường hóa và lên men đồng thời [15,23,58, 100,65]. Như vậy có thể
thấy các nguyên liệu giàu cellulose, các tác giả thường tiếp cận theo hai phương pháp đường
hóa bằng enzyme rồi lên men hoặc đường hóa và lên men đồng thời.
1.2.4.1 Nấm men
Rong biển giàu carbohydrate nên được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học. Theo
nghiên cứu của Kim và Adam, quá trình thủy phân chuyển đổi carbohydrate của rong biển
thành đường lên men giúp cho vi sinh vật dễ dàng sử dụng để sản xuất ethanol. Trong các
nhóm vi sinh vật sinh ethanol, nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) vẫn là vi
sinh vật có ứng dụng rộng rãi nhất. Nấm men S. cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn
như glucose, galactose, manose, đường đôi như sucrose, maltose. S. cerevisiae là một loại
nấm men sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình lên men ethanol, đã được trình bày trong
nhiều nghiên cứu trước đây cho sản xuất ethanol sinh học từ sinh khối rong biển [25,52].
Nghiên cứu của Adam sử dụng enzyme laminarinase để thủy phân laminaran trong rong
Saccharina latissima thành glucose, rồi lên men để sản xuất ethanol từ S. cerevisiae[24].
Nghiên cứu của tác giả Kim đã sản xuất 7,0-9,8 g/l ethanol từ 50 g/l dịch đường được thủy
phân bằng axit của rong Laminaria japonica và lên men với nấm men S. cerevisiae, hàm
lượng ethanol tạo thành là tương đối thấp vì S. cerevisiae không thể lên men đường mannitol,
trong khi đó dịch thủy phân của rong này chứa đến 81 % manitol [52]. Theo nghiên cứu của
Horn, mannitol khó lên men và chỉ có một vài sinh vật có thể sử dụng nó, chủng Zymobacter
palmae đã được phát hiện là có khả năng phát triển trong môi trường mannitol trong điều

kiện oxy thấp và sản xuất ethanol với hàm lượng 0,38g ethanol/g manitol [42]. Một nghiên
cứu khác phát hiện ra chủng Pichia angophorae có thể lên men ethanol đồng thời mannitol
19