Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------

ĐỖ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ
KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE
THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------

ĐỖ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ
KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE
THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số

: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS TRƢƠNG QUỐC PHONG
2. GS. TS NGUYỄN ĐĂNG HIỀN

HÀ NỘI – 2017


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự
khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố
trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần
còn lại chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

GVHD 1

GVHD 2

Nghiên cứu sinh

PGS. TS Trương Quốc Phong

GS. TS Nguyễn Đăng Hiền

Đỗ Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS Trương Quốc Phong –
giám đốc Trung tâm nghiên cứu và phát triển CNSH, trường Đại học Bách khoa Hà Nội và GS.
TS Nguyễn Đăng Hiền – giám đốc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế
(Bộ Y tế) đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này;
Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ và động viên từ PSG. TS Tô
Kim Anh, PGS. TS Khuất Hữu Thanh – Nguyên ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu - phát triển
CNSH cùng toàn thể bạn bè và đồng nghiệp. Tôi xin chân thành cảm sự giúp đỡ quý báu đó;
Tôi chân thành cảm ơn tập thể cán bộ một số phòng nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên
cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành nghiên cứu
của mình;
Với tất cả lòng kính yêu và biết ơn chân thành nhất, tôi xin dành cho gia đình bố, mẹ,
chồng và các con, những người thân yêu đã thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó
khăn cùng tôi trong suốt thời gian qua!

Đỗ Thị Thu Hà


MỤC LỤC ..................................................................................................................................... I
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................................. VI
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH................................................................................................ IX
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................................... X
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3
1.1

TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT
NAM ................................................................................................................................... 3

1.1.1

Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới ................................................................... 3

1.1.2

Tình hình nhiễm virus rota ở Việt Nam..................................................................... 3

1.2

ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA ..................................................................................... 4

1.2.1

Phân loại virus rota ...................................................................................................... 4

1.2.2

Đặc điểm cấu trúc của virus rota ................................................................................ 5

1.2.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus rota .................................................................. 8
1.3

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA ..................................................... 9

1.3.1

Quan sát bằng kính hiển vi điện tử .......................................................................... 10

1.3.2

Phƣơng pháp điện di .................................................................................................. 10

1.3.3

Phƣơng pháp Real time -PCR................................................................................... 11

1.3.4

Phƣơng pháp giải trình tự gen .................................................................................. 11

1.3.5

Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) .......................... 11

1.3.6

Phƣơng pháp ngƣng kết hạt nhựa (latex agglutination) ........................................ 12

1.3.7

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch ( immunochromatographic)......................................... 12

1.4

ĐẶC ĐIỂM PROTEIN VP6 VIRUS ROTA ................................................................. 12

1.4.1

Gen tổng hợp VP6 ...................................................................................................... 12

1.4.2

Đặc điểm protein VP6 ................................................................................................ 13

1.4.2.1

Cấu trúc protein .................................................................................................................................. 13

1.4.2.2

Đặc tính của VP6 ................................................................................................................................ 16

1.5

PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG ........................................................... 18

1.5.1

Protein VP6 tái tổ hợp ............................................................................................... 18

1.5.2

Sản xuất protein tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E. coli ............................................ 21

1.5.2.1

Đặc điểm E. coli .................................................................................................................................. 21

1.5.2.2

Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis...................................................................... 21

1.5.2.3

Các mã hiếm khi biểu hiện protein trên E.coli................................................................................. 22

1.5.3

Ứng dụng kháng thể kháng VP6 trong tạo kit thử chẩn đoán .............................. 25

1.6

MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP PROTEIN TÁI TỔ HỢP26
I


1.6.1

Ảnh hƣởng của chất cảm ứng ................................................................................... 26

1.6.2

Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................................................ 27

1.6.3

Ảnh hƣởng của thời gian cảm ứng ........................................................................... 27

1.6.4

Ảnh hƣởng của tối ƣu hóa các codons...................................................................... 28

1.7

TINH SẠCH PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP ................................................................. 29

1.7.1

Thu nhận và làm tan thể vùi ..................................................................................... 29

1.7.2

Tinh sạch VP6 bằng cột sắc ký ái lực AF-Chelate-650 resin gắn Ni2+ .................. 30

1.7.3

Tái cuộn gấp VP6 tái tổ hợp...................................................................................... 31

1.8

SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘNG VẬT ................................................ 31

1.8.1

Chọn lọc động vật....................................................................................................... 32

1.8.2

Quy trình gây miễn dịch và giám sát động vật ........................................................ 32

1.8.2.1

Chuẩn bị kháng nguyên...................................................................................................................... 32

1.8.2.2

Lựa chọn tá dược ................................................................................................................................ 33

1.8.2.3

Đường tiêm .......................................................................................................................................... 33

1.8.2.4

Liều lượng kháng nguyên, thể tích và số mũi tiêm .......................................................................... 33

1.8.2.5

Giám sát động vật ............................................................................................................................... 33

1.8.2.6

Lấy máu................................................................................................................................................ 34

1.8.2.7

Tinh sạch kháng thể ............................................................................................................................ 34

1.9

KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH ............................................................................... 34

1.9.1

Nguyên lý que thử ...................................................................................................... 34

1.9.2

Ðặc tính các thành phần que thử.............................................................................. 35

1.9.2.1

Hạt nano vàng (AuNPs) ..................................................................................................................... 35

1.9.2.2

Cộng hợp kháng thể VP6 - hạt nano vàng ....................................................................................... 36

1.9.2.3

Miếng cộng hợp................................................................................................................................... 37

1.9.2.4

Miếng thấm mẫu ................................................................................................................................. 37

1.9.2.5

Màng nitrocellulose ............................................................................................................................ 38

1.9.2.6

Miếng thấm hút (absorbent pad) ....................................................................................................... 38

1.10 CÁC KIT THƢƠNG MẠI CHO CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA ................................. 39
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU................................................... 41
2.1

ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THẾT BỊ ............................................... 41

2.1.1

Sơ đồ tổng thể nghiên cứu ......................................................................................... 41

2.1.2

Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................................ 41

2.1.3

Vật liệu ........................................................................................................................ 41

2.1.4

Các cặp mồi sử dụng .................................................................................................. 42

2.1.5

Các kháng thể sử dụng .............................................................................................. 43
II

2.1.5.1

Kháng thể cho tạo que thử ................................................................................................................. 43

2.1.5.2

Kháng thể cho Western Blot và ELISA............................................................................................. 43

2.1.6

Hóa chất và thiết bị máy móc.................................................................................... 44

2.1.6.1

Vật liệu, hóa chất................................................................................................................................. 44

2.1.6.2

Thiết bị máy móc cơ bản .................................................................................................................... 45

2.2

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................................. 45

2.2.1

Các phƣơng pháp vi sinh ........................................................................................... 45

2.2.1.1

Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ..................................................................................................... 45

2.2.1.2

Phương pháp giữ giống vi sinh vật ................................................................................................... 46

2.2.1.3

Phương pháp tạo tế bào khả biến ..................................................................................................... 46

2.2.2

Các phƣơng pháp sinh học phân tử ......................................................................... 46

2.2.2.1

Phương pháp tách chiết RNA tổng số (QIAgen RNA extract Kit)................................................ 46

2.2.2.2

Phương pháp RT – PCR .................................................................................................................... 47

2.2.2.3

Phương pháp tách chiết plasmid....................................................................................................... 48

2.2.2.4

Phương pháp ghép nối gen vào vector tách dòng ........................................................................... 48

2.2.2.5

Biến nạp vào tế bào E.coli.................................................................................................................. 49

2.2.2.6

Phương pháp cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn.................................................................. 49

2.2.2.7

Thiết kế vecter biểu hiện pET 22b(+) mang gen vp6 ...................................................................... 50

2.2.2.8

Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit ........................ 51

2.2.2.9

Điện di DNA trên gel agarose ........................................................................................................... 51

2.2.2.10 Phương pháp biểu hiện gen ............................................................................................................... 52
2.2.2.11 Phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide – SDS..................................................... 52
2.2.3

Phƣơng pháp hóa sinh ............................................................................................... 53

2.2.3.1

Phương pháp tách chiết protein tổng số........................................................................................... 53

2.2.3.2

Phương pháp tách chiết protein thể tan .......................................................................................... 53

2.2.3.3

Thu nhận và làm tan thể vùi............................................................................................................... 54

2.2.3.4

Phương pháp tinh sạch protein trên cột His-tag kết hợp tái cuộn gấp ......................................... 54

2.2.3.5

Phương pháp lọc tách hạt virus rotavà các tiểu thể thành phần ................................................... 55

2.2.3.6

Định lượng protein bằng phương pháp Bradford........................................................................... 55

2.2.3.7

Phương pháp Western Blot................................................................................................................ 56

2.2.3.8

Phương pháp ELISA........................................................................................................................... 56

2.2.4

Phƣơng pháp miễn dịch học...................................................................................... 57

2.2.4.1

Phương pháp sản xuất kháng thể ...................................................................................................... 57

2.2.4.2

Phương pháp tinh sạch IgG bằng cột sắc ký ái lực gắn protein A-Sepharose............................. 58

2.2.4.3

Phương pháp soi hiển vi miễn dịch ................................................................................................... 59
III


2.2.5

Phƣơng pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch............................................................. 59

2.2.5.1

Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng ............................................................ 59

2.2.5.2

Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng.................................................................. 60

2.2.5.3

Phương pháp cố định kháng thể lên màng....................................................................................... 60

2.2.5.4

Phương thức hoạt động que thử nhanh ............................................................................................ 60

2.2.5.5

Phương pháp phân tích mẫu bằng que thử...................................................................................... 61

2.2.5.6

Phương pháp tính độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử ................................................................. 61

2.2.6

Các phƣơng pháp tin sinh ......................................................................................... 61

2.2.6.1

Kiểm tra mồi bằng phần mềm FastPCR .......................................................................................... 61

2.2.6.2

Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen đích bằng phần mềm Nebcutter...................... 62

2.2.6.3

Phân tích trình tự gen bằng phần mềm NCBI (Blast,…)................................................................ 62

2.2.6.4

Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng ExPASy................................................... 62

2.2.6.5

Dự đoán cấu trúc VP6 bằng phần mềm RaptorX [121] ................................................................ 62

2.2.6.6

Dự đoán trình tự epitope trên chuỗi axit amin bằng phần mềm SNMTriP .................................. 63

2.2.6.7

Xác định độ sạch của protein VP6 sau khi tinh sạch bằng phần mềm Quanty-One 4.6.9 (Bio-

rad)

63

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................. 64
3.1

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6 TRONG E. COLI 64

3.1.1

Tách dòng gen vp6 kiểu dại....................................................................................... 64

3.1.1.1

Khuếch đại gen vp6............................................................................................................................. 64

3.1.1.2

Tách dòng gen vp6 trong vector pJET1.2 ....................................................................................... 65

3.1.2

Biểu hiện gen vp6 kiểu dại mã hóa protein VP6 ..................................................... 69

3.1.2.1

Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen kiểu dại mã hóa protein VP6 (VP6nat) ................. 69

3.1.2.2

Nghiên cứu biểu hiện gen vp6nat trong E. coli BL21(DE3) .......................................................... 71

3.1.2.3

Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen tối ưu mã hóa protein VP6 (VP6opt) ..................... 76

3.1.2.4

Nghiên cứu biểu hiện gen vp6 tối ưu trong E. coli BL21(DE3).................................................... 82

3.1.3

Đánh giá so sánh biểu hiện gen vp6nat và vp6opt ................................................... 87

3.2

THU NHẬN PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH ........................................... 88

3.2.1

Tách chiết protein VP6 .............................................................................................. 88

3.2.2

Tinh sạch protein VP6 tái tổ hợp và tái cuộn gấp ................................................... 89

3.2.2.1

Tinh sạch protein VP6 tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực gắn Ni2+....................................................... 89

3.2.2.2

Đánh giá khả năng tái cuộn gấp của protein VP6 tái tổ hợp sau tinh sạch ................................. 91

3.2.3

Đánh giá đặc tính protein VP6 tái tổ hợp sau tinh sạch ......................................... 92

3.3

TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG PROTEIN VP6 VIRUS ROTA TÁI TỔ HỢP ........... 94

3.3.1

Quy trình gây miễn dịch trên thỏ ............................................................................. 94
IV


3.3.2

Xác định hiệu giá kháng thể bằng phƣơng pháp ELISA ....................................... 94

3.3.3

Thu nhận và tinh sạch kháng thể kháng protein VP6 bằng sắc ký ái lực cột

protein A-Sepharose ................................................................................................................... 95
3.3.4

Xác định đặc tính kháng thể ..................................................................................... 97

3.4

TẠO QUE THỬ CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA .......................................................... 100

3.4.1

Nghiên cứu điều kiện cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuPNs ................ 101

3.4.2

Nghiên cứu cố định kháng thể trên màng nitrocellulose ...................................... 105

3.4.3

Tối ƣu dịch ly giải mẫu ............................................................................................ 106

3.4.4

Khảo sát đánh giá que thử ...................................................................................... 107

3.4.4.1

Khảo sát phản ứng chéo................................................................................................................... 109

3.4.4.2

Khảo sát ngưỡng phát hiện .............................................................................................................. 110

3.4.4.3

Khảo sát khả năng của que thử với các nhóm virus rota khác type ............................................ 111

3.4.4.4

Khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu trên mẫu bệnh phẩm................................................................ 113

3.4.4.5

Khảo sát thời gian bảo quản que thử.............................................................................................. 113

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .............................................................................. 115
4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................................... 115
4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 116
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN .................................. 117
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 118
PHỤ LỤC .................................................................................................................................. 127
Phụ lục 1: Môi trƣờng và hóa chất ......................................................................................... 127
Phụ lục 2: Trình tự gen vp6 trên ngân hàng dữ liệu NCBI .................................................. 129
Phụ lục 3: Trình tự gen vp6 trên vector tách dòng pJET1.2 so sánh với trình tự gen
(GenBank: HQ392338.1) .......................................................................................................... 130
Phụ lục 4: Cây phân loại theo trình tự gen vp6 của virus rota ............................................ 132
Phụ lục 5: Cây phân loại theo trình tự axit amin VP6 của virus rota. ............................... 133
Phụ lục 6: Kết quả giải trình tự gen vp6nat trên vector pET22b+ ...................................... 134
Phụ lục 7: Kết quả giải trình tự gen vp6opt trên vector pET22b+ ...................................... 137
Phụ lục 8: Trình tự gen VP6opt trên pET22b(+) so sánh với trình từ gen VP6 tổng hợp
(Genscript)................................................................................................................................. 141
Phụ lục 9: Kết quả tín hiệu ELISA OD450nm .......................................................................... 143
Phụ lục 10: Tóm tắt quy trình xét nghiệm ............................................................................. 144
Phụ lục 11: Kết quả khảo sát thử nghiệm kit trên mẫu bệnh phẩm.................................... 146

V


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Amp

Ampicillin

Kháng sinh Ampicilline

AP

Alkaline phosphatase

Enzyme Alkaline phosphatase

Anti-VP6IgG

Anti VP6 protein-IgG

Kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp

AuNPs

Gold nanoparticle

Hạt nano vàng

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl

Muối 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate disodium salt

phosphate disodium

bp

Base pair

Cặp base

BSA

Bovine Albumine Serum

Albumine huyết thanh bò

CBB

Coomassie Brilliant Blue

Coomassie Brilliant Blue

CBD

Chitin-binding domain

Vùng gắn với chitin

Complementary

Chuỗi Axit Deoxyribonucleic acid bổ

Deoxyribonucleic acid

sung

CFU

Colony forming unit

Đơn vị hình thành huẩn lạc

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

Nucleotid Adenosine -A

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

Nucleotid Cytidine - C

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

Nucleotid Guanosine -G

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

Nucleotid Thymidine - T

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit Deoxyribonucleic

dNTPs

Deoxyribonucleoic Triphosphates

Chứa 4 nucleotid A,T,C và G

BCIP

cDNA

dsRNA
DTT

Double stranded Ribonucleic
Acid
1,4-Dithiothreitol
1-Ethyl-3-(3-

EDC

dimethylaminopropyl)
carbodiimide

EDTA

RNA sợi đôi
1,4-Dithiothreitol
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimide

Ethylene diamine tetraacetic acid

Ethylene diamine tetraacetic acid

Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết

Assay

enzyme

EtBr

Ethidium bromide

Ethidium bromide

FCA

Freund‟s Complete Adjuvant

Tá dược toàn phần

FIA

Freund‟s Incomplete Adjuvant

Tá dược không toàn phần

ELISA

VI


FPLC

HPLC

Fast protein liquid
chromatography
High-performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng nhanh
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HRP

Horseradish Peroxidase

Enzyme Horseradish Peroxidase

ID

Intradermal

Tiêm trong da

IM

Intramuscular

Tiêm bắp

IP

Intraperitoneal

Tiêm trong phúc mạc bụng

IV

Intravenous

Tiêm tĩnh mạch

Ig

Immunoglobulin/ globulin

Kháng thể

Intein Mediated Purification with

Tính năng tự cắt đoạn protein dung hợp

an Affinity Chitin-binding

gắn chitin trong quá trình tinh sạch

Isopropyl β -D – 1 –

Isopropyl β -D – 1 –

thiogalactopyranoside

thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

LB

Luria Bertani

Môi trường Luria Bertani

mAb

Monoclonal Antibody

Kháng thể đơn dòng

mRNA

Messenger Ribonucleic Acid

RNA thông tin

NBT

Nitro blue tetrazolium

Nitro blue tetrazolium

NHS

N-Hydroxysuccinimide

N-Hydroxysuccinimide

NSP

Non-Structural Protein

Protein phi cấu trúc

OD

Optical Density

Mật độ quang

pAb

Polyclonal Antibody

Kháng thể da dòng

IMPACT

IPTG

PAGE

Polyacrylamide Gel
Electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamide

PBS

Phosphate Buffered Saline

Dung dịch đệm muối phốt phát

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PEG

Polyethylene Glycol

Polyethylene Glycol

pET22(b)::vp6

pET22(b)::vp6

Vector pET22(b) mang gen vp6

Center for research and
Polyvac

production of vaccines and
biologicals

Primer F

Primer Forward

Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin
và sinh phẩm y tế
Mồi xuôi
VII


Primer R

Primer Reverese

Mồi ngược

VLPs

Virus-like particles

Tiểu thể giống virus

RNA

Ribonucleic Acid

Axít Ribonucleic

RNase

Ribonuclease

Enzyme Ribonuclease

rVP6

Recombinant VP6 protein

Protein VP6 tái tổ hợp

RV

Rotavirus

Virus rota

RT-PCR

Reverse Transcription PCR

PCR dùng enzyme phiêm mã ngược

SC

Subcutaneous

Tiêm dưới da

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SDS

Sodium dodecyl sulphase

Sodium dodecyl sulphase

SG

Subgroup

Dưới nhóm

Sol

Solution

Dung dịch

TAE

Tris – Acid Acetic – EDTA

Tris – Acid Acetic – EDTA

TMB

Tetramethylbenzidine

Tetramethylbenzidine

TTH

Recombinant

Tái tổ hợp

UV

Ultraviolet

Tia cực tím

v/v

Volume/Volume

Thể tích/Thể tích

v/w

Volume/Weight

Thể tích/Khối lượng

VP

Virus Protein

Protein cấu trúc virus

VP6nat

VP6nat - native

VP6 kiểu dại

VP6opt

VP6opt - optimum

VP6 tối ưu

WB

Western Blot

Western Blot

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

VIII

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Biểu đồ phân bố các chủng virus rota type G và P lưu hành tại Việt Nam 1998-2004 [1] .................. 4
Hình 1. 2: Cấu trúc virus rota............................................................................................................................................... 5
Hình 1. 3: Mẫu bệnh phẩm chứa virus rota quan sát dưới kính hiển vi điện tử......................................................... 9
Hình

4: Sự phân bố khác nhau của dsRNA của các chủng virus rota nh m A, B và C trên gel

polycrylamide [125]............................................................................................................................................................ 11
Hình 5: Vị trí và hình thái của lớp protein VP6 trong hạt virus rota [7 ............................................................ 13
Hình 6: Cấu tạo tiểu đơn vị VP6 .................................................................................................................................. 14
Hình

7: Xác định khu vực epitope dự đoán của VP6 bằng phương pháp trao đổi H/D kết hợp khối phổ

(Hydrogen–deuterium exchange mass spectroscopy)[14].......................................................................................... 15
Hình 1. 8: Chuột được gẫy nhiễm VP6, VP4 và VP7 tái tổ hợp với các đường nhiễm và tá dược khác nhau
[32].......................................................................................................................................................................................... 17
Hình 9: Đáp ứng miễn dịch của chuột với L lactis NZ9000/pCWA:VP6, NZ9000[54]................................ 18
Hình

: Sơ đồ vùng T-DNA của vector pILTAB 57-VP6 ................................................................................. 20

Hình 1.11: Cấu trúc vector pET 22b+ ............................................................................................................................. 22
Hình

: Sơ đồ tinh sạch protein VP6 trên cột sắc ký ái lực gắn Ni2+ ................................................................. 30

Hình 1. 13:Cấu tạo que thử phát hiện nhanh virus rota ................................................................................................ 35

Hình 1. 14:Một kháng thể được cộng hợp với hạt nano vàng đã gắn sẵn lớp PEG [169] .................................... 37
Hình 1. 15: Bộ kit SD bioline rotavirus (Hàn Quốc) .................................................................................................... 40
Hình 2. 1: Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo scientific) [173] .......................................................... 42
Hình 2. 2: Vùng tách dòng và biểu hiện trên vector pET22b(+) [172]..................................................................... 42
Hình

: Sơ đồ tạo cấu trúc tái tổ hợp mang gen vp6nat trên vector pET22b(+).................................................. 50

Hình 4: Sơ đồ tạo cấu trúc tái tổ hợp mang gen vp6opt trên vector pET22b(+)................................................. 50
Hình

: Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen vp6 trên gel agarose 0,8%............................................................ 64

Hình 3. 2: Phổ điện di sản phẩm PCR thu được từ 6 dòng với cặp mồi VP6nat đặc hiệu. ................................. 66
Hình 3.3: Kết quả chọn dòng bằng xử lý plasmid pJET::vp6 với enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI ................. 67
Hình 3. 4: Trình tự nucleotide với trình tự axit amin tương ứng suy diễn của gen tách dòng gen vp6 trên
pJET1.2/blunt ....................................................................................................................................................................... 69
Hình 3. 5: Kết quả xử lý 2 plasmid pET22b(+) và pJET1.2::vp6nat bằng BamHI/SalI....................................... 69
Hình 3.6: Kết quả chọn dòng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp bằng phương pháp PCR và cắt hạn chế. ............ 70
Hình 3.7: Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn trên vector biểu hiện pET22b(+) ......................................... 71
Hình 3.8: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen vp6nat trong E. coli BL21(DE3) /pET22::vp6.............................. 72
IX


Hình 3.9: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen vp6nat bằng WB sử dụng kháng thể đơn dòng kháng VP6 ....... 73
Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ cảm ứng tới biểu hiện gen vp6nat................................................................... 73
Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng tới biểu hiện gen vp6nat................................................................... 74
Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng tới biểu hiện gen vp6nat.................................................................. 75
Hình 3.13: Tối ưu mã di truyền gen vp6 của virus rota. ............................................................................................. 77
Hình 3.14: So sánh trình tự gen vp6 trước và sau khi tối ưu mã di truyền tương ứng trình tự axit amin suy

diễn. ........................................................................................................................................................................................ 78
Hình 3.15: Kết quả chọn dòng bằng xử lý enzyme cắt hạn chế BamHI/ SalI và PCR với cặp mồi VP6opt . . 79
Hình

6: Khung đọc mở dịch mã tổng hợp protein VP6 trong vector pET22b(+). ......................................... 80

Hình 3.17: Cấu trúc 3D của protein VP6 tái tổ hợp được dự đoán bằng phần mềm RaptorX. ........................... 81
Hình 3. 18:Ví trí các epitope dự đoán trên VP6 protein bằng phần mềm SVMtriP .............................................. 82
Hình 3. 19: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-VP6opt ở chủng E. coli BL2(DE3).................................. 83
Hình 3.20: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein VP6 với mAb kháng VP6 (Abcam). ..................................... 84
Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ cảm ứng tới biểu hiện gen vp6opt .................................................................. 85
Hình 3.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới biểu hiện gen vp6opt.................................................................................... 86
Hình 3.23: Ảnh hưởng của thời gian tới biểu hiện gen vp6opt .................................................................................. 87
Hình 3. 24: So sánh khả năng biểu hiện gen vp6 tự nhiên và tối ưu trên cùng hệ biểu hiện................................. 87
Hình 3.25: Kết quả xử lý và hòa tan protein bằng phương pháp ........................................................................... 89
Hình 3. 26: Kết quả tinh sạch protein VP6 TTH bằng sắc ký ái lực giữa His-tag và Ni2+.................................... 90
Hình 3. 27: Kết quả ELISA đánh giá khả năng tái cuộn gấp của protein VP6 TTH tinh sạch............................ 92
Hình 3. 28: Kết quả kiểm tra sự đặc hiệu của protein VP6 bằng phương pháp WB ........................................... 93
Hình 3.29: Kết quả ELISA đánh giá trạng thái cấu trúc VP6 TTH so với VP6 tự nhiên. ................................... 93
Hình 3. 30: Hiệu giá kháng thể kháng VP6 protein virus rota tại các thời điểm lấy máu .................................... 95
Hình 3. 31: Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ sử dụng cột protein A-Sapharose.................................. 96
Hình 3.32: Phổ điện di tinh sạch kháng thể thỏ kháng VP6 TTH virus rota .......................................................... 97
Hình 3. 33: Kết quả Western Blot kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể kháng protein VP6 TTH so với VP6 tự
nhiên ....................................................................................................................................................................................... 98
Hình 3. 34: Kết quả ELISA đánh giá khả năng nhận biết của anti-VP6IgG với kháng nguyên VP6 TTH và
VP6 tự nhiên......................................................................................................................................................................... 99
Hình

5: Đánh giá khả năng nhận biết của anti-VP6IgG với các vùng bộ lộ epiope của VP6 protein trên hạt

virus rota nguyên vẹn........................................................................................................................................................100
Hình 3. 36: Thử nghiệm thiết lập que thử với điều kiện ban đầu.............................................................................101
Hình 3.37: Ảnh hưởng nồng độ anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs. ................................................................102
Hình 3.38: Ảnh hưởng của nồng độ anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs tới tín hiệu vạch kiểm tra và kiểm
chứng trên que thử .............................................................................................................................................................102
X


Hình 3.39: Ảnh hưởng của pH cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs. ................................................103
Hình 3.40: Ảnh hưởng nồng độ EDC/NHS tới cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs. ...................104
Hình 3.41: Ảnh hưởng nhiệt độ cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs................................................104
Hình 3.42: Ảnh hưởng thời gian cộng hợp anti-VP6IgGt với phức PEG-AuNPs. ............................................105
Hình 3.43: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ vạch kiểm chứng (control line) ảnh hưởng đến tín hiệu của que
thử .........................................................................................................................................................................................106
Hình 3.44: Ảnh hưởng của dịch ly giải mẫu tới tín hiệu của que thử......................................................................106
Hình 3. 45: Ảnh chụp TEM mẫu virus rota trên màng lọc 100kDa ......................................................................107
Hình 3. 46: Ảnh chụp TEM các tiểu thể của virus rota dưới màng lọc 100kDa ..................................................108
Hình 3. 47: Ảnh chụp TEM mẫu bệnh phẩm..............................................................................................................108
Hình 3. 48: Kết quả đánh giá khả năng phát hiện của que thử. ................................................................................108
Hình 3.49: Kiểm tra phản ứng chéo của que thử với 14 tác nhân gây bệnh tiêu chảy.........................................109
Hình 3. 50: Kiểm tra ngưỡng phát hiện của que thử...................................................................................................110
Hình 3.51: Kết quả que thử với các type virus rota.....................................................................................................112
Hình 3. 52: Kết quả bảo quản que thử trong 7 tháng và 9 tháng bảo quản ở điều kiện (40C và nhiệt độ
phòng) ..................................................................................................................................................................................113
Hình 3. 53: Thử nghiệm que thử trên mẫu bệnh phẩm dương tính với virus rota................................................147
Hình 3. 54: Thử nghiệm que thử trên mẫu bệnh phẩm âm tính với virus rota......................................................149

XI

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1: Gen tổng hợp protein của virus rota, vị trí và chức năng............................................................................ 6
Bảng

: Phân tích các mã sử dụng của E coli cho gen vp6 tự nhiên và gen vp6 tối ưu các codon [

Bảng

: Đánh giá so sánh biểu hiện VP6nat và VP6opt trên cùng 1 hệ biểu hiện........................................... 88

.... 23

Bảng 3. 2: Các số liệu thu hồi và tinh sạch protein VP6 .............................................................................................. 91
Bảng 3. 3: Kết quả hiệu giá kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp ...................................................................... 94
Bảng 4: Điều kiện tạo kit thử nghiệm ........................................................................................................................110
Bảng 3. 5: Kết quả tổng hợp khảo sát thử nghiệm kit trên mẫu bệnh phẩm..........................................................113

X


ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus rota là nguyên nhân gây tử vong do tiêu chảy cao nhất ở trẻ em dưới 5 tuổi.
Hàng năm virus này đã làm cho khoảng 25 triệu trẻ mắc bệnh trong đ c
viện và đã gây tử vong hơn 6

trẻ, trong số này hơn 8

triệu trẻ phải nhập

là ở các nước đang phát triển

[119]. Theo số liệu thống kê tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virus rota chiếm
trên 50% trong tổng số trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy [6]. Bệnh tiêu chảy do virus rota gây
ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của trẻ và là gánh nặng kinh tế đối với toàn xã hội, mỗi
năm chi phí để điều trị tiêu chảy do loài virus này ở nước ta lên tới 5,3 triệu đô la Mỹ, trong
đ

, triệu cho chi phí y tế trực tiếp, khoảng 685.000 cho chi phí không thuộc lĩnh vực y tế

và 1,5 triệu khác cho chi phí gián tiếp [35, 45, 103].
Việc sử dụng vắc xin đã ngăn ngừa được 74% trẻ nhỏ không bị nhiễm virus rota [113]
Nhưng thực tế, giá thành của vắc xin rota là một trở ngại đối với các nước đang phát triển
Do đ , hiện nay còn một t lệ lớn trẻ dưới 5 tuổi chưa được chủng ngừa bằng vắc xin nên t lệ
trẻ nhiễm virus rota là rất cao, chiếm 5

số trẻ tiêu chảy phải nhập viện [3]. Không giống

như nhiễm khuẩn, bệnh tiêu chảy do virus rota không thể sử dụng kháng sinh, vì vậy việc
chẩn đoán nhanh, xác định chính xác được căn nguyên gây bệnh để c phương án điều trị hợp
lý là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán virus rota được Tổ chức y tế thế giới (WHO)
khuyến cáo bao gồm: (1) nhận diện virus rota bằng kính hiển vi điện tử; (2) phát hiện vật liệu
di truyền của virus; (3) phát hiện kháng nguyên virus bằng một số kỹ thuật miễn dịch. Mỗi
phương pháp đều có những ưu, nhược điểm điểm như điều kiện thực hiện, giá thành phép thử,
thời gian thực hiện. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kháng nguyên (ELISA, ngưng kết hạt
nhựa - latex agglutination và sắc ký miễn dịch) được đánh giá c ưu thế hơn bởi một số ưu
điểm như nhanh, đơn giản, chính xác, giá thành hợp lý có thể áp dụng trên quy mô mẫu bệnh
lớn. Các phương pháp như quan sát hình thái và phát hiện vật liệu di truyền (PCR, Real timePCR) thường ch phù hợp dùng trong các phòng nghiên cứu, trung tâm giám sát dịch tễ. Hiện
nay, các bệnh viện và cơ sở y tế chủ yếu dùng kit nhanh dạng que thử để phát hiện virus rota
trong mẫu phân bệnh nhân. Tuy nhiên, các kit này đều phải nhập khẩu, giá thành cao và
không chủ động nguồn sinh phẩm.

Cấu trúc virus rota gồm có 3 lớp capsit; lớp ngoài là do protein VP7, VP4 tạo thành,
lớp trong do VP2 và protein capsit nằm ở giữa của virus rota là VP6 tạo thành. Virus rota
được chia thành 7 nhóm (A, B, C, D, E, F và G) phụ thuộc vào kháng nguyên của các protein
capsit ngoài, ch có nhóm A, B và C gây bệnh cho người và động vật [107]. Protein VP6
chiếm hơn 5

khối lượng hạt virus và có tính bảo thủ cao với độ tương đồng khoảng 92%

về trình tự axit amin giữa các chủng virus rota nhóm A [68, 129]. Protein VP6 được coi là
1


kháng nguyên chung cho tất cả virus thuộc nhóm A [75], nhóm được coi là nguyên nhân
chính (chiếm 90%) gây tiêu chảy thể nặng ở người, đặc biệt là trẻ dưới 5 tuổi [16]. Do có tính
bảo thủ cho các chủng virus rota thuộc nhóm A nên protein VP6 được coi như là một dấu ch
sinh học xác định virus rota [56, 109, 160]. Đã c một số nghiên cứu ứng dụng protein VP6
để phát triển vắc xin tiểu phần [130], sử dụng làm kháng nguyên tạo kháng thể đặc hiệu cho
phục vụ cho chẩn đoán virus rota bằng phương pháp ELISA hoặc sắc ký miễn dịch [98, 170]
Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài: " Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng
phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota"
Với các mục tiêu:
-

Tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp của virus rota

-

Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 virus rota

-

Thử nghiệm ứng dụng cho phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota dựa vào
nguyên lý sắc ký miễn dịch

Nội dung nghiên cứu:
-

Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein VP6 tái tổ hợp, tạo chủng
E.coli BL21(DE3) mang pET22(b)::vp6 và nghiên cứu điều kiện biểu hiện VP6
tái tổ hợp từ gen dạng dại và tối ưu h a gen tổng hợp.

-

Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tinh sạch kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và đặc
tính kháng nguyên VP6.

-

Nghiên cứu gây miễn dịch thu kháng thể đặc hiệu kháng VP6 tái tổ hợp, xác
định tính đặc hiệu kháng thể.

-

Ứng dụng kháng thể kháng VP6 tái tổ hợp tạo que thử phát hiện nhanh rota vius.

Những đóng góp mới của luận án :
-

Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa protein VP6 của virus rota phân lập

tại Việt Nam Trên cơ sở đã tối ưu h a trình tự gen vp6 để tăng hiệu suất biểu
hiện protein VP6 trong E. coli đạt 0,24 mg/ ml dịch nuôi

-

Tạo được nguồn kháng nguyên VP6 tái tổ hợp c đặc tính tương tự kháng
nguyên VP6 tự nhiên của virus rota và kháng thể đa dòng kháng VP6 tái tổ hợp.

-

Bước đầu thử nghiệm ứng dụng kháng thể kháng protein VP6 tạo que thử nhanh
dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch cho phát hiện nhanh virus rota đạt được
kết quả tốt trong phạm vi thử nghiệm C ý nghĩa ứng dụng thực tiễn cao.

2


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1

TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT
NAM

1.1.1 Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới
Năm 97 , Bishop et al., quan sát dưới kính hiển vi điện tử mảnh sinh thiết niêm mạc
ruột của một em bé chết vì tiêu chảy cấp đã phát hiện ra một loại virus c đường kính hơn 7
nm, thuộc giống Reovirus. Theo thống kê bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên nhân gây
bệnh và tử vong cho trẻ em ở các nước đang phát triển, người ta ước tính trên thế giới hàng
năm c 5

triệu trẻ em dưới năm tuổi mắc ít nhất một đợt tiêu chảy và 4 triệu trẻ em dưới 5

tuổi hàng năm chết vì bệnh tiêu chảy. Tiêu chảy là nguyên nhân thứ hai gây tử vong cho trẻ
em sau nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính, 80% tử vong do tiêu chảy xảy ra ở trẻ dưới 2 tuổi. Một
phần ba số trẻ em tử vong dưới 5 tuổi có liên quan tới tiêu chảy cấp, trong đ virus rota là căn
nguyên hàng đầu. Virus rota có phạm vi lưu hành trên khắp các châu lục [157, 162]
Tỷ lệ phát hiện virus rota tuy khác nhau giữa các nước nhưng bệnh vẫn tập trung chủ
yếu ở trẻ em dưới 5 tuổi và thường vào mùa khô lạnh. Ước tính đến tháng 4 năm

6, tổ

chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính trên toàn cầu trung bình có 215.000 trẻ dưới 5 tuổi tử
vong do tiêu chảy bởi virus rota. Số lượng trẻ chết nhiều nhất là Ấn Độ (47.100 trẻ em) chiếm
22 %, 4 quốc gia Ấn Độ, Nigeria, Pakistan và Cộng hòa Fdân chủ Congo chiếm khoảng một
nửa (49 %) của tất cả các ước tính trường hợp tử vong do virus rota vào năm

[177].

1.1.2 Tình hình nhiễm virus rota ở Việt Nam
Ở Việt Nam, năm 98 mới nghiên cứu và xác định virus này là nguyên nhân chính
gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em, theo thống kê dịch tễ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh tiêu chảy cấp do
virus rota chiếm trên 50% trong tổng số trẻ mắc tiêu chảy cấp phải nhập viện hàng năm, số
trẻ chết do virus rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻ dưới 5 tuổi bị chết vì mọi nguyên
nhân [4]. Bình quân ở nước ta, 1 trẻ dưới 5 tuổi mỗi năm mắc từ 0,8 - , đợt tiêu chảy [6,
103]. Tiêu chảy là nguyên nhân hàng đầu gây suy dinh dưỡng, ảnh hưởng tới sự tăng trưởng
của trẻ. Bệnh tiêu chảy ở trẻ em và người lớn có những căn nguyên cũng như biểu hiện tương
đối giống nhau Tuy nhiên do chưa hoàn ch nh về hệ miễn dịch nên trẻ em là đối tượng nhạy
cảm hơn với nguồn bệnh và khối lượng nước ở trẻ em (70 - 8

) cao hơn so với người lớn

(50 - 60%) dẫn đến nguy cơ mất nước lớn gây nên việc trẻ tiêu chảy dễ đối mặt với nguy cơ
tử vong cao hơn Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy do virus rota tại các bệnh viện chính
của Việt Nam từ 998 đến 2004 (Hình 1.1) cho thấy rằng chủng virus rota lưu hành tại nước
ta chiếm phần lớn là type G P(8), đây cũng là type gây bệnh phổ biến trên toàn thế giới.
3


6%

9%

7%
38%

13%

14%

7%

10%
1%

G1

4%

G2

68%

23%

G3

G4

G9

G-hh

G-kxd

P8

P6

P4

P-kxd

Phh

Hình 1.1: Biểu đồ phân bố các chủng virus rota type G và P lưu hành tại Việt Nam 1998-2004
[1]
(hh: hỗn hợp. kxd: không xác định)
Hiện nay, ở Việt Nam bằng kỹ thuật ELISA phát hiện tỷ lệ virus rota là nguyên nhân
gây tiêu chảy cấp là tương đối cao. Các nghiên cứu về virus rota ở Việt Nam chủ yếu tập

trung vào các vấn đề như giám sát dịch tễ, nghiên cứu đặc điểm miễn dịch học của virus và
nghiên cứu sản xuất vắc xin [3, 5, 7-8]. Việc giám sát dịch tễ được WHO hỗ trợ để theo dõi
diễn biến của bệnh dịch, tỷ lệ mắc bệnh, sự phân bố cũng như lưu hành của các type virus.
Vấn đề này trong những năm qua đã được thực hiện tại PTN của Trung tâm Nghiên cứu sản
xuất vắc-xin và sinh phẩm y tế, Viện Pasteur Hồ Chí Minh và tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung
ương

1.2

ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA

1.2.1 Phân loại virus rota
Virus rota gây bệnh ở người và động vật được chia thành 7 nhóm A, B, C, D, E, F và
G, ch có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và động vật Trong đ , nh m A hay gặp nhất,
gây ra hầu hết các ca dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em. Nhóm B là nhóm duy nhất gây tiêu chảy ở
người lớn và ch được phát hiện ở một số nước Châu Á Nh m C cũng gây bệnh ở trẻ em
nhưng rất hiếm gặp. Nhóm D, E, F, G ch thấy ở động vật [107, 132].
Virus rota được phân loại nhóm dựa vào tính kháng nguyên của các protein capsit lớp
ngoài Capsit trong (VP6) mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsit ngoài (VP4, VP7) mang
kháng nguyên đặc hiệu type. Type huyết thanh G đại diện cho VP7 và type P đại diện cho
VP4 Cho đến nay có 23 type G đã được xác định bằng ELISA và 11 trong số đ được phân
lập từ người, trong khi đ ch 12 trong 32 type P đã xác định được phân lập từ người [107],
[134]. Các type huyết thanh phổ biến gây bệnh cho người là G1P(8), G2P(9), G3P(8), và
G4P(8) và một tỷ lệ nhỏ G5, G8 và G9 [105, 134] Trước năm

6 chủng G1P(8) chiếm tỷ lệ

cao nhất, chủng G3 ch chiếm 3,3% các chủng phân lập được trên thế giới cũng như ở Việt
nam. Từ năm

6, chủng G3P(8) là chủng lưu hành rộng rãi ở phía Bắc nước ta. Chủng này
4


có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản. Trên thế giới tần suất phát hiện chủng G tăng dần
vào những năm

4 [45]. Việc xuất hiện đột ngột và chiếm ưu thế của các chủng G3 cho

thấy sự cần thiết phải liên tục giám sát các chủng virus lưu hành đặc biệt là sau khi vắc xin
phòng virus rota được sử dụng.
Virus rota gây nhiễm động vật đã vượt qua hàng rào ngăn cản loài để gây nhiễm cho
người do chúng đã trải qua quá trình tổ hợp và sắp xếp lại hệ gen giữa các đồng chủng
(homologous) và dị chủng (heterologous) dựa vào hệ gen phân đoạn của mình [12, 55, 96].
Bên cạnh khả năng sắp xếp và tái tổ hợp lại hệ gen, những đột biến điểm và sự tích lũy các
đột biến điểm cũng được nghiên cứu [134]. Hiện tại đã c

cụm kiểu gen P(8) (gọi là P(8)-1,

P(8)-2, và P(8)- ) trong đ chủng vắc xin Rotarix thuộc nhóm P(8)-1 còn các chủng P(8) lưu
hành tại thời điểm 2006-2009 lại thuộc nhóm P(8)-2, và P(8)-

Như vậy nguồn gen virus rota

gây nhiễm cho người ngày càng tăng do sự tái tổ hợp khác nhau của các type huyết thanh P và
G, của các đơn type khác nhau trong cùng một kiểu huyết thanh. Do vậy, việc phát triển một
loại vắc xin có hiệu lực đối với tất cả các dạng virus rota cần quan tâm đến yếu tố này. Tuy
nhiên điều may mắn là một type huyết thanh virus rota cũng c thể gây ra miễn dịch bảo vệ
đối với type khác [50, 96].
1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của virus rota

Virus rota có dạng khối cầu 20 mặt, đường kính ~74nm. Chuỗi nuleocapsit của virus
hình thành bởi 3 vòng gấp đồng tâm do

đoạn RNA kép tạo thành. Capsit của virus đối

xứng 20 mặt, do 132 capsomer sắp xếp đối xứng gấp.

Hình 1. 2: Cấu trúc virus rota
(vwww.reoviridae.or).
Virus rota có dạng khối cầu 20 mặt, được cấu tạo nên bởi 6 protein cấu trúc (VP1-VP7)

5


và 6 protein phi cấu trúc (NSP1-NSP6) do 11 mảnh gen mã hóa. Protein VP2 và VP6 tạo nên
các hạt hai lớp được phủ bởi lớp protein VP7, VP4 dimer tạo nên lớp mạng nhện nhô ra phía
ngoài.
Vật liệu di truyền của virus rotalà RNA sợi đôi Hệ gen của virus rota phân mảnh, gồm
đoạn RNA c kích thước 660-3300 bp mã hóa cho 12 protein: 6 protein cấu trúc VP1 (125
kDa), VP2( 94 kDa), VP3 (88 kDa), VP4 (88 kDa), VP6 (44 kDa), VP7 (38 kDa) và 6 protein
phi cấu trúc NSP1(53 kDa), NSP2 (34 kDa), NSP3 (35 kDa), NSP4 (28 kDa), NSP5 (26
kDa), NSP6 (


kDa) Đoạn gen 11 mã hóa cho 2 protein NSP5, NSP6 [58].

Đặc điểm gen tổng hợp protein của virus rota
Bảng 1. 1: Gen tổng hợp protein của virus rota, vị trí và chức năng

R

N
A

Kích
thước
(bp)

1

3302

Sản phẩm
protein
Tên
(kDa)
b

VP1

125,0

Biến đổi sau dịch
mã (protein trưởng
thành)
-

%
trọng
lượng
so với

hạt
2

Vị trí và chức nănga

Protein

lõi

trong;

RNA

polymerase, liên kết RNA,
tương tác với VP2 và VP3
2

2687

VP2

102,4

Myristylation
(nhóm

15
axit

Protein lõi trong; gắn với

RNA; kẹp leucine (axit amin

myristic liên kết

536 tới 559 và 665 tới 686)

hóa trị với amide,
kỵ nước và liên kết
màng)
3

2591

VP3

98,1

-

0,5

Protein lõi trong; chuyển hoá
guanylyl; mathalyse

4

2362

VP4

86,7

xen giữa bởi 2 vị
trí
VP5*

trypsin
(529)

VP8*(247)

của
+

1,5

Protein bề mặt (dimer)
Glycoprotein kháng nguyên
(hemagglutinin)
Trung

hòa

(serotype

kháng
đặc

nguyên
hiệu)

protein tổng hợp màng tế bào
C độc lực và có khả năng gây
bệnh
5

1581

NSP1

58,6

Phi cấu trúc

Liên kết với RNA, zinc fingers
- protein liên kết với các Zn2+
6


mục đích tạo nếp gấp ổn định
6

1356

VP6

44,8

Myristylation

51

Protein lõi trong, trimer, kỵ
nước,

phân

nhóm

kháng

nguyên, cần thiết cho quá trình
phiên mã
7

1104

NSP2

34,6

Quan trọng đối với sự sao chép

Phi cấu trúc

của

hệ

gen

virus,

thành phần chính của thể vùi,
NTPase, liên kết với RNA,
tương tác với NSP5
8

1059

NSP3

36,6

Quan trọng đối với sự sao chép

Phi cấu trúc

của

hệ

gen

virus

và

là thành phần của thể vùi
9

1062

VP7

34,3

Chứa tín hiệu cắt.

30

glycoprotein màng với ER

glycosyl hoá gắn

(mạng lưới nội chất), protein

nhóm

gắn với tế bào, trung hòa

mannose

mức cao

kháng

nguyên,

hai

vùng NH2- đầu cuối kỵ nước,
vùng gắn Ca2+ (axit amin 127
tới 157)
10

751

NSP4

20,2

Phi cấu trúc

glycoprotein xuyên màng liên

Tín hiệu dẫn không

kết với ER, có vai trò trong

cắt, glycosyl hoá

hình thái, chứa độc tố ruột

gắn nhóm mannose
mức cao
11

a

667

NSP5

21,7

Phi cấu trúc

Thành phần của thể vùi, tương

Phosphoryl hoá, O-

tác với NSP2, gắn RNA,

glycosyl hóa

protein kinase

Một số các chức năng được biết tham khảo của Estes., et al, 2001 [55] và Pesavento., et al,

2006 [122]
b

Trọng lượng phân tử xác định bởi phương pháp SDS-page


Các protein phi cấu trúc:
Protein NSP được mã hóa bởi đoạn gen 5, là độc tố của virus rota đối với chuột

nhưng lại không độc đối với lợn hay thỏ. Một nghiên cứu gần đây cho rằng NSP1 phá vỡ đáp

7


ứng miễn dịch tự nhiên bằng cách phân hủy yếu tố điều hòa interferon 3 (IRF3) [19]. Protein
NSP được mã hóa bởi đoạn gen 7 là một oligo NTPase có hoạt tính phá vỡ sự bền vững của
cấu trúc gấp và có thể protein này cũng c vai trò trong quá trình đ ng g i RNA và độc tính
của virus Protein NSP được mã hóa bởi đoạn gen 8, liên kết với eIF4G (protein liên quan
đến quá trình phiên mã) và ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào qua đ tăng cường
quá trình dịch mã trên mRNA của virus [156]. Chức năng cụ thể của 2 protein NSP5 và NSP6
vẫn chưa được rõ, tuy nhiên dựa vào khả năng liên kết của chúng với RNA cho thấy có thể
chức năng của chúng là vận chuyển các protein khác của virus từ nơi tổng hợp vào khu vực
virus lắp ráp trong tế bào chất, hoặc tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đ ng g i RNA, hoặc
tham gia vào quá trình di chuyển các hạt virus từ tế bào chất vào mạng lưới nội chất [120].
Protein NSP4 được mã hóa bởi đoạn gen 10 có chức năng định hình virus, mang hoạt tính như
thụ thể đối với hạt 2 lớp nhờ đ các hạt virus này đi vào trong khoang của mạng lưới nội chất
nhờ hình thức nảy chồi NSP4 cũng là một độc tố ruột quan trọng tham gia vào quá trình phát
sinh bệnh [17].
1.2.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus rota
Sự xâm nhiễm, nhân lên, đ ng g i và giải phóng virus gồm các bước cơ bản sau: (1)
Giai đoạn hấp phụ qua trung gian VP4 và VP7. (2) Thâm nhập vào tế bào và cởi vỏ. (3) Tổng
hợp vật liệu di truyền và dịch mã tổng hợp protein virus và (4) Lắp ráp và giải phóng các hạt
virus
 Giai đoạn hấp phụ
Virus rota thường gây nhiễm tế bào nhung mao trưởng thành ở ruột non, với cấu tạo
có ba lớp protein capsit giúp virus vượt qua điều kiện pH thấp và các enzyme tiêu hóa trong
đường ruột. Một số chủng virus rota gây nhiễm trên động vật cần axit silic trên bề mặt tế bào
để quá trình hấp phụ thành công trong khi đ virus rota gây nhiễm trên người thì không phụ
thuộc axit silic [78-79, 128].
 Thâm nhập vào tế bào và cởi vỏ
Sau khi gây nhiễm, protein VP4 đ ng vai trò là thụ thể, cho phép virus thâm nhập vào

tế bào VP4 được cắt bởi trypsin thành VP8 và VP5 giúp cho việc thâm nhập tế bào dễ dàng
hơn Khi đã ở trong tế bào, transcriptase của virus được hoạt h a để phiên mã vật liệu di
truyền Quá trình này được kích thích bởi giai đoạn cởi áo virus và quá trình protein VP4 và
VP7 tách ra khỏi cấu trúc 3 lớp của virus. Quá trình tách vỏ VP4 và VP7 có thể do ảnh hưởng
của nồng độ Ca2+ trong nội bào [44].

8


 Tổng hợp vật liệu di truyền và dịch mã tổng hợp protein virus
Sau khi hoàn thành quá trình cởi vỏ, hoạt tính RNA polymerase của phức hợp VP1VP được hoạt hóa trong cấu trúc 2 lớp của virus dẫn đến quá trình phiên mã và nhô ra của 11
sợi mRNA từ cấu trúc 2 lớp này. Sợi RNA thông tin chịu trách nhiệm cho cả quá trình giải mã
và tổng hợp sợi RNA âm tính để tạo sợi RNA kép Lõi trung gian được hình thành, mRNAs
dịch mã trong polysomes tạo 12 protein virus (6 protein cấu trúc và 6 protein phi cấu trúc). Cả
sợi RNA dương và âm đều có thể tìm thấy sau 3 giờ nhiễm virus Quá trình phiên mã đạt đ nh
cao trong khoảng 9-12 giờ sau khi nhiễm [146].
 Lắp ráp và giải phóng các hạt virus
Quá trình này xảy ở mạng lưới nội chất của tế bào (ER), cấu trúc không hoàn ch nh
của hạt virus được lắp ráp trong tế bào chất sau đ qua lưới nội chất cùng với protein VP7 và
NSP4 tạo nên hạt virus có vỏ. NSP4 và có thể cả VP4 có hoạt tính làm tan màng cùng với
nồng độ Ca2+ cao trong dịch của ER giúp cho việc loại bỏ vỏ lipid tạm thời. Nhiều nghiên cứu
đã ch rằng, việc tích lũy cao nồng độ Ca2+ trong mạng lưới nội chất giúp cho việc ổn định
việc hình thành các hạt virus hoàn ch nh [128]. Sự tăng cao nồng độ Ca2+ trong tế bào dẫn đến
việc thay đổi tính thấm của màng plasma do việc bù Ca2+ từ ngoại bào vào bên trong tế bào,
kết quả là tế bào bị mất nước trong quá trình thải virus qua phân ra ngoài môi trường.
Quá trình này là đ nh điểm của việc nhiễm virus rota, bệnh phẩm có thể lên tới 109 1010 hạt virus/ ml [74]. Trong bệnh phẩm ngoài có các hạt virus nguyên vẹn, còn chứa các tiểu
thể, thành phần hạt đ ng g i chưa hoàn toàn và một số hạt đang ở giai đoạn suy thoái (Hình
1.3) [126].
Hạt nguyên vẹn

Hạt trong giai
đoạn suy thoái

Hạt đóng gói chưa
hoàn toàn

100nm

Hình 1. 3: Mẫu bệnh phẩm chứa virus rota quan sát dưới kính hiển vi điện tử
1.3

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA
Khi các tác nhân gây tiêu chảy xâm nhập vào đường tiêu hóa sẽ sản xuất ra các độc tố

ruột (enterotoxin) kích thích bài tiết các chất điện giải, xâm lấn trực tiếp và phá hủy tế bào
biểu mô niêm mạc ruột gây tổn thương tại ruột và toàn thân. Các nguyên nhân tiêu chảy như
9