Tổng hợp một số N-hydroxybutanamid/pentanamid mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

DƯƠNG TIẾN ANH
MÃ SINH VIÊN: 1201010

TỔNG HỢP MỘT SỐ
N-HYDROXYBUTANAMID/PENTANAMID
MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL)
METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG
TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

DƯƠNG TIẾN ANH
MÃ SINH VIÊN: 1201010

TỔNG HỢP MỘT SỐ
N-HYDROXYBUTANAMID/PENTANAMID
MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL)
METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG
TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
NCS. Đỗ Thị Mai Dung
PGS.TS. Phan Thị Phương Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày nội dung những phần thuộc đề tài của mình, tôi xin chân
thành gửi lời cảm ơn đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ động
viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình.
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những người thầy, người cô
đáng kính của tôi: GS.TS. Nguyễn Hải Nam, PGS.TS. Phan Thị Phương Dung,
DS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội. Thầy cô
đã không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã
luôn có những chỉ dẫn chính xác, kịp thời và động viên tôi những lúc khó khăn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật
viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học
Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm
nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, đặc biệt là anh Lê Văn Cường, anh Lê Xuân
Thiện, em Lê Công Trực, Cao Việt Phương, Phạm Nguyễn Khánh Linh và bạn
Đào An đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016
Sinh viên
Dương Tiến Anh

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)

2

1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)

2

1.1.2. Phân loại các HDAC

3

1.1.3. Cấu trúc enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa

3

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

5

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC

5

1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

6

1.2.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC

7

1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HƠP CÁC ACID

9

HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Thay đổi nhóm khóa hoạt động
1.3.2. Thay đổi cầu nối
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ

9
11
12

HÓA HỌC CLICK
1.4.1. Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic

12

1.4.2. Hóa học Click

14


CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

17

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

17

2.1.1. Hóa chất

17

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

17

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

18

2.2.1. Tổng hợp hóa học

18

2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

18

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

18

2.3.1. Tổng hợp hóa học

18

2.3.2. Thử tác dụng sinh học

19

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. HÓA HỌC

21
21

3.1.1. Tổng hợp hóa học

21

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết

34

3.1.3. Xác định cấu trúc

35

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

40

3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC

40

3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

41

3.3. BÀN LUẬN

42

3.3.1. Tổng hợp hóa học

42

3.3.2. Khẳng định cấu trúc

45

3.3.3. Thử hoạt tính sinh học

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

55

PHỤ LỤC

60


DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13

C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance)

A549

: Dòng tế bào ung thư phổi người

AcOH

: Acid acetic

ADN

: Acid desoxyribonucleic

AsPC-1

: Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người

CU

: Nhóm liên kết (Connecting unit)

d

: Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)

DCM

: Dicloromethan

dd

: Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (Doublet of doublet)

DMF

: Dimethylformamid

DMSO

: Dimethylsulfoxid

DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa
ESI

: Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FBS

: Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA

: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
(U.S. Food and Drug Administration)

H (%)

: Hiệu suất

HAT

: Histon acetyltransferase

HCT116

: Dòng tế bào ung thư ruột kết người

HDAC

: Histon deacetylase

HDACi

: Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors)

HepG2

: Dòng tế bào ung thư gan người

IC50

: Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

IR

: Hồng ngoại (Infrared)

J

: Hằng số ghép cặp trong phổ NMR.


KRIBB

: Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc
(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)

m

: Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NAD+

: Nicotinamid adenin dinucleotid

NST

: Nhiễm sắc thể

PC-3

: Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người

Rf

: Hệ số lưu giữ trong TLC

s

: Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)

SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG

: Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)

SW620

: Dòng tế bào ung thư đại tràng người

t

: Vạch ba trong phổ NMR (Triplet)

tºnc

: Nhiệt độ nóng chảy

THF

: Tetrahydrofuran

TLC

: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TMS

: Tetramethylsilan

TSA

: Trichostatin A

UV

: Tử ngoại (Ultraviolet)

ZBG

: Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)

δ (ppm)

: Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

ν

: Dao động hóa trị trong phổ IR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester.

33

Bảng 3.2. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất VIa-d, X.

34

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d, X.

35

Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d, X.

36

Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-d, X.

37

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-d, X.

39

Bảng 3.7. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIa-d, X.

40

Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d, X.

41


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của nucleosom và vai trò của HAT, HDAC.

2

Hình 1.2. Bảng phân loại các HDAC.

3

Hình 1.3. Phức hợp HDAC-8 và acid hydroxamic.

4

Hình 1.4. Phân loại các chất ức chế HDAC.

6

Hình 1.5. Cấu trúc của SAHA tương ứng với cấu trúc chung của các chất ức

7

chế HDAC.
Hình 1.6. Cấu trúc apicidin và azumamid E.

7

Hình 1.7. Cấu trúc chung các acid hydroxamic mang khung benzothiazol.

9

Hình 1.8. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Feng T.

10

Hình 1.9. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Zhang Z.

11

Hình 1.10. Cấu trúc chung của một số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin.

11

Hình 1.11. Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H. và cộng sự.

11

Hình 3.1. Phổ khối lượng MS của dẫn chất VIb.

47

Hình 3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của dẫn chất VIc (giãn rộng)

49

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất VIc-d trên 51
các dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1.


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1. Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA.

12

Sơ đồ 1.2. Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic.

13

Sơ đồ 1.3. Phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyn và azid với xúc tác

14

Cu(I) (CuAAC).
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung.

21

Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất II.

22

Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất VIII.

22

Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất IVa.

23

Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp chất Va.

24

Sơ đồ 3.6. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa.

25

Sơ đồ 3.7. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIb.

26

Sơ đồ 3.8. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIc.

28

Sơ đồ 3.9. Quy trình tổng hợp dẫn chất VId.

30

Sơ đồ 3.10. Quy trình tổng hợp dẫn chất X.

32

Sơ đồ 3.11. Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d.

43

Sơ đồ 3.12. Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác Cu(I).

44

Sơ đồ 3.13. Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d, X.

45


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, cùng những thành tựu mang tính đột phá trong lĩnh
vực sinh học thì hiểu biết về chức năng và hoạt động của cơ thể sống ở mức độ tế
bào, mức độ phân tử ngày càng được làm rõ. Các thuốc chống ung thư mới ra đời hầu
hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính
so với các phương pháp cổ điển như hóa trị hay xạ trị. Một số đích tác dụng mà các
thuốc chống ung thư hiện nay đang hướng đến như các protein kinase, protein gây
ung thư Bcl-2, HAT, HDAC… trong đó đích HDAC đang mở ra nhiều triển vọng.
Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng
gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế

bào ung thư [15], [23]. Hiện nay, trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công
bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt trong đó điển hình là
SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên được FDA cấp phép lưu
hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) [6]. Sau đó là belinostat
(Beleodaq®), gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử
dụng trong điều trị một số bệnh ung thư.
Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học
Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn
xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [1],
[30], [31]. Một số bài báo gần đây của nhóm nghiên cứu đã cho kết quả rất khả quan
khi sử dụng khung benzothiazol hoặc khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol thay cho vòng
phenyl trong cấu trúc của SAHA để làm nhóm khóa hoạt động. Nhiều chất đã thể
hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn SAHA từ vài lần đến vài chục lần [31], [32].
Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp một số
N-hydroxybutanamid/pentanamid mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2on hướng tác dụng kháng ung thư” với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanamid và 4 dẫn chất.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được.
1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc của nhiễm sắc thể (NST) đóng một vai
trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen [4], [10]. NST là những phức hợp đại
phân tử được cấu tạo từ 3 thành phần chính là ADN, histon và protein không phải
histon [10]. Cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom, gồm một lõi protein octamer
hình đĩa của các histon (1 tetramer H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B) được quấn quanh
bởi 146 cặp nucleotid của một đoạn ADN [8], [20]. Các cặp histon có cấu trúc 2 phần
quan trọng: đầu C nằm bên trong lõi, đầu N nằm bên ngoài nucleosom với acid amin

kết thúc là lysin. Đầu N đặc biệt là ở H3, H4 là đích của nhiều biến đổi trong quá
trình phiên mã như acetyl/deacetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa.

Hình 1.1. Cấu trúc của nucleosom và vai trò của HAT, HDAC.
Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua
nhau nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC).
Ở dạng acetyl hóa dưới xúc tác của HAT, điện tích dương nhóm ε-NH2 của lysin ở
đầu N của histon bị trung hòa, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã được xảy ra
[16]. Ngược lại, ở dạng deacetyl hóa dưới tác dụng của HDAC, histon tích điện dương

2


lớn ở đầu N, tương tác mạnh với ADN, đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã
[15] (xem hình 1.1).
1.1.2. Phân loại các HDAC
Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người
và chúng được chia thành 4 nhóm [7], [8], [29]:
- Nhóm I: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-8.
- Nhóm II: HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-9, HDAC-10.
- Nhóm III: Sirtuin 1-7.
- Nhóm IV: HDAC-11.

Hình 1.2. Bảng phân loại các HDAC.
Nhóm I, II và IV được coi là những HDAC “kinh điển” là những enzym phụ
thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những
enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid
hydroxamic. Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy
vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ [17].
1.1.3. Cấu trúc enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa

3


Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X, người ta xác định được
cấu trúc tinh thể của các HDAC khác nhau.

Hình 1.3. Phức hợp HDAC-8 và acid hydroxamic.
Nhìn chung, các cấu trúc của chúng đều tương tự nhau, bao gồm 2 phần chính
là ion Zn2+ và kênh enzym:
+ Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành
phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí. Trong
phân tử HDAC ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và 1 liên kết
phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của acetyl lysin ở đầu N của histon từ đó
xúc tác tách loại nhóm acetyl. Thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với
Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [36]. Như acid
hydroxamic, ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+ qua 2 nguyên
tử oxy của nó (xem hình 1.3).
+ Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất và tham gia liên
kết Van der Waals với cơ chất, được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là
các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His. Nó có cấu trúc khá linh động có
thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất. Miệng túi có một vài vòng xoắn
protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC. Đáy túi có một vài phân
tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tạo

4


liên kết hydro khi không có -OH của Tyr. Các hợp chất hydroxamic có chiều dài cầu
nối khoảng 5-6 liên kết carbon là tối ưu với chiều dài của kênh [36].
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ
bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, chu trình biệt
hóa, chu trình chết theo chương trình [16]. Do vậy, mục tiêu phân tử HDAC là một
hướng nghiên cứu đầy triển vọng của nhiều thuốc điều trị ung thư mới trong đó có
các chất ức chế HDAC.
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Dựa vào cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC được chia thành 6 nhóm: các
acid hydroxamic, các acid carboxylic mạch ngắn, các peptid vòng, các
aminobenzamid, các epoxyceton và các phân tử lai [34], [41] (xem hình 1.4). Mỗi
nhóm chất ức chế HDAC đều có những ưu nhược điểm riêng, trong đó nhóm acid
hydroxamic bị nhanh thải trừ, tác dụng ức chế HDAC không chọn lọc nhưng có ưu
điểm là ức chế ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản [8], [21].
Năm 1990, trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên thuộc nhóm acid hydroxamic
được tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC bởi Yosida và cộng sự [8]. Sau đó, SAHA
(vorinostat) với cấu trúc tương tự TSA là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA phê
duyệt cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) [12]. Cho đến nay, FDA đã cấp phép
lưu hành trên thị trường 3 thuốc có tác dụng ức chế HDAC trong điều trị ung thư bao
gồm: SAHA (2006), belinostat (2014) và panobinostat (2015).

5


Hình 1.4. Phân loại các chất ức chế HDAC.
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Dựa trên cấu trúc của SAHA, các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần
chính [13] (xem hình 1.5):
- Nhóm nhận diện bề mặt hay còn gọi là nhóm khóa hoạt động (Capping group
- SRG): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện
với bề mặt amino acid của enzym.
- Vùng cầu nối (Linker): thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocarbon

thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết Van
der Waals với kênh enzym, tạo nên tương tác với các thành phần nằm trên kênh và
giúp cho cơ chất cố định trong kênh.
- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): có thể là acid
hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton... Nhóm
kết thúc gắn với kẽm tham gia tạo tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của
các HDAC.

6


Hình 1.5. Cấu trúc của SAHA tương ứng với cấu trúc chung của các HDACi.
1.2.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC
1.2.3.1. Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt
Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt có ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của
các chất ức chế HDAC. Những phân tử không có nhóm nhận diện bề mặt kị nước thì
có hoạt tính yếu [37].
Trong một nghiên cứu vào năm 2006 của nhóm tác giả Juvale [22] cho thấy, sự
có mặt của nhóm phenyl hay thêm một nhóm thế trên cầu nối ở vị trí sát với nhóm
phenyl trong nhóm nhận diện bề mặt sẽ góp phần làm tăng hoạt tính. Ngược lại, khi
có nhóm thế sát nhóm acid hydroxamic thì gây bất lợi cho hoạt tính. Tương tự nhóm
phenyl, các nhóm chức và cấu trúc giàu mật độ electron ở nhóm nhận diện bề mặt
đều góp phần làm tăng hoạt tính.
Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt và sự tương ứng cấu trúc miệng túi enzym
HDAC còn tạo nên tính chọn lọc của các chất ức chế HDAC. Trong nghiên cứu của
nhóm tác giả Di Micco S. đã giải thích sự ức chế chọn lọc của các hợp chất
cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn (azumamid E và apicidi) trên HDAC nhóm I
(xem hình 1.6) [9].
O

O
O
O

N

OH

HN
NH HN

NH HN

O

O

O

O

NH HN

O
O
Azumamid E

N
Apicidin

O

Hình 1.6. Cấu trúc apicidin và azumamid E.
7


Nhóm đã chứng minh rằng các hợp chất mang vòng lớn như cyclopeptid cần
không gian lớn trong kênh enzym để tương tác. Với kích thước đường kính miệng túi
là 11 Å, các HDAC nhóm I dễ dàng cho nhóm nhận diện bề mặt cồng kềnh của các
cyclopeptid vào, tương tác tạo liên kết bền vững giữa các chất ức chế HDAC với kênh
enzym. Còn với các HDAC nhóm II, do bề mặt enzym lại chứa các phân tử cồng
kềnh, khó tạo liên kết với các hợp chất vòng lớn [9].
1.2.3.2. Ảnh hưởng của cầu nối
Trung tâm hoạt động của các HDAC là dạng túi kỵ nước, có chiều dài từ miệng
túi đến ion Zn2+ ở đáy túi là 4-6 C, do vậy các chất ức chế HDAC có vùng cấu nối
dài tương ứng sẽ cho hoạt tính tốt hơn [17]. Trong một nghiên cứu của công ty
TopoTarget (Anh), khi thiết kế và tổng hợp gần 40 dẫn chất amid ngược (AH8) của
SAHA cũng đã chỉ ra khi cầu nối 5-6 C thì hoạt tính của chúng đạt được là tối ưu [2].
1.2.3.3. Ảnh hưởng cúa nhóm kết thúc gắn kẽm (ZBG)
- Cấu trúc ZBG
Năm 2005, khi nghiên cứu cấu trúc của vùng chứa ion Zn2+ trong HDAC,
Vanommeslaeghe K. và cộng sự thấy rằng, vùng này chứa 1 gốc Tyr và 2 nhóm HisAsp [39]. Từ đó, tác giả đã đưa ra cấu trúc của nhóm kết thúc gắn với kẽm trong phân
tử chất ức chế HDAC gồm 5 phần:
+ Phần A: mang đôi electron không liên kết, có khả năng tạo liên kết hydro với
H trong nhóm OH của tyrosin, đồng thời tạo liên kết chelat với ion Zn2+. Tuy nhiên
A cũng có thể chứa hydro (để nhận điện tử từ oxy trong nhóm phenol của tyrosin tạo
liên kết hydro).
+ Phần B: nối ZBG với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ít nhất 3 liên kết.
+ Phần C: chứa hydro linh động, tạo liên kết hydro với His132.
+ Phần D: là nhóm cho proton cho His131, tạo liên kết tĩnh điện với His131 và

liên kết chelat mạnh với Zn2+.
+ Phần L: vùng cầu nối.
1.2.3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố khác
- Năng lượng solvat hóa của phân tử tăng, hoạt tính ức chế HDAC giảm [41].
8


- Các phân tử thân dầu thường có hoạt tính tốt, tuy nhiên kích thước phân tử quá
lớn sẽ bất lợi với hoạt tính [22]. Khi phân tử thuốc quá thân dầu hoặc chứa quá nhiều
vòng 6 cạnh sẽ tạo hiệu ứng không gian, do vậy hoạt tính của chất sẽ giảm [5]. Những
chất có tính thân dầu - thân nước cân bằng thường có lợi cho hoạt tính của các chất
ức chế HDAC-6 [26].
- Phân tử có xu hướng cầu hóa sẽ làm thu nhỏ vùng cho dung môi thâm nhập
do các nhóm thân nước bị che khuất. Cấu trúc phân tử càng có xu hướng “mở”, hoạt
tính ức chế HDAC sẽ tăng [40].
- Phân tử ở dạng gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho tác dụng ức chế chọn lọc
HD1-A (tương đồng HDAC nhóm II). Ngược lại, khi phân tử ở dạng thẳng lại cho
tác dụng ức chế chọn lọc trên HD1-B (tương đồng HDAC nhóm I) [33].
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HƠP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Thay đổi nhóm khóa hoạt động
Năm 2011, với việc sử dụng SAHA như là một chất dẫn đường, NCS Đào Thị
Kim Oanh và cộng sự [1] đã nghiên cứu dãy chất mang nhóm khóa hoạt động
benzothiazol với cầu nối là từ 2-6 nhóm methylen. Kết quả cho thấy, việc thay nhóm
phenyl của SAHA bằng nhóm benzothiazol tạo ra các chất có hoạt tính khá tốt, thậm
chí chất với cầu nối 6C còn có hoạt tính mạnh hơn cả SAHA (xem hình 1.7).

Hình 1.7. Cấu trúc chung các acid hydroxamic mang khung benzothiazol.
Trên thế giới, năm 2013, Feng T. và cộng sự [14] đã nghiên cứu các chất ức chế
HDAC dẫn xuất N-hydroxyfurylacrylamid có mạch nhánh ở nhóm khoá hoạt động.

Các hợp chất này được thử hoạt tính kháng ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung
thư tuyến tiền liệt (PC-3), tế bào ung thư ruột kết (HCT116), tế bào ung thư phổi
(A549), tế bào ung thư gan (HepG2) và khả năng ức chế chọn lọc các enzym HDAC-

9


1, HDAC-4, HDAC-6. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất 3a, 3b, 3c, 3d cho tác
dụng chọn lọc tốt nhất trên HDAC-6 đồng thời 3a, 3b, 3c còn có khả năng ức chế
HDAC-1. Qua nghiên cứu docking, tác giả giải thích tác dụng chọn lọc HDAC-6 của
3b là do mạch nhánh cồng kềnh ở nhóm khoá hoạt động có kích thước đủ lớn, vừa
khít với rãnh trên bề mặt HDAC-6, nhưng không khít với rãnh trên bề mặt HDAC-1
và HDAC-4 [14] (xem hình 1.8).

Hình 1.8. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Feng T.
Năm 2016, Zhang Z. và cộng sự [42] đã thiết kế, tổng hợp và thử hoạt tính in
vitro các acid hydroxamic mà trong nhóm khóa bề mặt có chứa khung
dimethylisoxazol. Kết quả nghiên cứu chỉ ra các dẫn chất có hoạt tính tương đối tốt,
ví dụ như chất 4 dưới đây có tác dụng ức chế mạnh HDAC-1 với IC50 = 0,15 μM
(xem hình 1.9).

Hình 1.9. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Zhang Z.
1.3.2. Thay đổi cầu nối
Bên cạnh hướng thay đổi nhóm khóa hoạt động, một số nhà khoa học lại tập
trung vào việc thay đổi cầu nối như thay đổi nhóm thế, thay đổi mạch carbon no bằng
các mạch chứa liên kết đôi, vòng thơm hay dị vòng nhằm tăng tác dụng ức chế HDAC
cũng như tăng tính chọn lọc của các thuốc mới sau này.

10

Cũng trong nghiên cứu của mình năm 2011, cùng với việc thay nhóm khóa hoạt
động là benzothiazol, tác giả Đào Thị Kim Oanh còn thay đổi chiều dài cầu nối từ 2
đến 6C. Kết quả thử hoạt tính sinh học trên các HDAC-3,4 của cầu nối 6C được cải
thiện đồng thời ức chế 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trung bình là 0,81 µg/ml
[1], [32].
Gần đây nhất, NCS Đỗ Thị Mai Dung và cộng sự [11] đã thiết kế nghiên cứu và
tổng hợp các hydroxamic mang khung 2-oxoindolin có nhóm thế ở vị trí số 3. Kết
quả nghiên cứu cho thấy, hầu hết các chất trong dãy đều có hoạt tính khá tốt trên các
dòng tế bào thử nghiệm (chất 5a, 5b) (xem hình 1.10).

Hình 1.10. Cấu trúc chung của một số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin.
Nghiên cứu cấu trúc không gian của các HDAC, các nhà khoa học phát hiện
rằng trung tâm hoạt động của HDAC-1 nhỏ hơn trung tâm hoạt động của HDAC-6
[3]. Do vậy, nhằm tăng tác dụng chọn lọc vào HDAC-6, nhóm nghiên cứu của Lee
J.H. và cộng sự đã thay thế cầu nối mạch thẳng của SAHA bằng các cầu nối cồng
kềnh hơn về không gian. Kết quả cho thấy hợp chất N-hydroxy-4-(2-[(2hydroxyethyl)(phenyl)amino]-2-oxoethyl)benzamid (HPOB) 6 cho hoạt tính ức chế
chọn lọc HDAC-6 in vitro và in vivo [27] (xem hình 1.11).

Hình 1.11. Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H. và cộng sự.
11


1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ HÓA HỌC
CLICK
1.4.1. Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic
Acid hydroxamic là sản phẩm thu được của phản ứng giữa các dẫn chất của acid
carboxylic như ester, clorid acid, anhydrid… với hydroxylamin. Dưới đây, khóa luận
xin trình bày một số phương pháp phổ biến tổng hợp acid hydroxamic đi từ nguyên
liệu ester và acid carboxylic cho tác dụng với hydroxylamin.

1.4.1.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester
Đây là phương pháp được nhiều nhóm nghiên cứu áp dụng để tổng hợp các
acid hydroxamic, ví dụ như Andrianov và cộng sự (năm 2008) [2] hay Hanessian và
cộng sự (năm 2007) [18]. Các nhóm nghiên cứu trên đều tổng hợp acid hydroxamic
từ methyl ester phản ứng với hydroxylamin trong dung môi MeOH ở môi trường
kiềm NaOH. Phản ứng xảy ra ở điều kiện từ 0-25°C với hiệu suất khá cao (xem sơ
đồ 1.1).

Sơ đồ 1.1. Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA.
Tuy nhiên, ở một số trường hợp, điều kiện phản ứng và dung môi phản ứng có
thể thay đổi phụ thuộc vào bản chất của ester tham gia. Ví dụ, trong nghiên cứu tổng
hợp các acid hydroxamic mang cầu nối chứa vòng triazol giữa methyl ester với
hydroxylamin của Chen và cộng sự [6], dung môi phản ứng lại là hỗn hợp KCN:THF
(1:1) ở nhiệt độ phòng. Hiệu suất phản ứng vẫn đạt trên 80%.
1.4.1.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic
Ngoài phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester, người ta có thể đi từ
acid carboxylic nếu phản ứng trực tiếp giữa methyl ester và hydroxylamin khó xảy
ra. Khi đó, trong một số trường hợp cần sử dụng tác nhân hoạt hóa acid carboxylic
và sử dụng hydroxylamin có nhóm bảo vệ -OH [1].
12


Năm 2008, trong nghiên cứu tổng hợp acid phenylthiazol hydroxamic,
Kozikowski và cộng sự [26] đã sử dụng tác nhân isobutyl cloroformat để hoạt hóa
acid carboxylic trong điều kiện 0°C tạo thành anhydrid ngay trong phản ứng. Tuy
nhiên hiệu suất của phương pháp này không cao, chỉ khoảng 26-30% (xem sơ đồ 1.2).

Sơ đồ 1.2. Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic.
Như vậy, trong hai phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ 2 nguồn ester và
acid carboxylic, phương pháp đi từ ester có điều kiện phản ứng đơn giản hơn và cho

hiệu suất cao hơn. Tuy nhiên, phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu và sản phẩm, các
nhà hóa học có thể chọn phương pháp và các tác nhân hoạt hóa phù hợp.
1.4.2. Hóa học Click
Khái niệm “hóa học Click’’ lần đầu tiên được đưa ra vào năm 2001 bởi ba nhà
khoa học Kolb H. C., Finn M. G. và Sharpless K. B. mô tả quá trình tổng hợp một
chất mới bằng cách kết nối những phân tử cấu trúc nhỏ lại với nhau thông qua liên
kết dị tố.
Theo Sharpless và cộng sự, phản ứng Click là “những phản ứng lưỡng cực,
phạm vi rộng, hiệu suất cao, cho các sản phẩm phụ không độc hại, có thể được loại
bỏ bằng những phương pháp đơn giản như kết tinh hoặc chưng cất và có tính chọn
lọc lập thể” [24], [25].
1.4.2.1. Đặc điểm của phản ứng Click
Phản ứng Click có một số đặc điểm: điều kiện đơn giản (phản ứng không nhạy
cảm với oxy và nước), nguyên liệu và tác nhân sẵn có, không sử dụng dung môi hoặc
nếu sử dụng thì chỉ dùng các dung môi dễ kiếm, dễ tách loại và tinh chế sản phẩm.
Quá trình tinh chế có thể sử dụng các phương pháp đơn giản như kết tinh hoặc chưng
cất. Sản phẩm thu được bền vững trong điều kiện thường [24].
13


1.4.2.2. Một số phản ứng Click thường gặp
Các phản ứng Click hay được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ bao gồm [24]:
- Phản ứng cộng đóng vòng các hợp chất không no, đặc biệt là phản ứng đóng
vòng 1,3-lưỡng cực bao gồm cả phản ứng Diels-Alder. Trong đó, phản ứng giữa azid
và alkyn tạo vòng 1,2,3-triazol có tính ứng dụng cao của hóa học Click.
- Phản ứng mở vòng ái nhân, đặc biệt là các dị vòng ái điện tử như epoxid,
aziridin.
- Phản ứng không aldol hóa của nhóm carbonyl như sự hình thành ure, thioure,
dị vòng thơm, oxim ether, hydrazon, amid.
- Phản ứng cộng vào liên kết bội carbon-carbon, đặc biệt là các phản ứng oxy

hóa như epoxid hóa, dihydroxyl hóa, aziridin hóa, phản ứng cộng sulfenyl halogenid,
phản ứng cộng Micheal của các hợp chất Nu-H.
 Phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác Cu(I) (CuAAC)
Cả alkyn và azid đều là những nhóm chất nhiều năng lượng nhưng khả năng
phản ứng kém. Trong tự nhiên, phản ứng giữa hai nhóm chất này xảy ra chậm, cần
điều kiện nhiệt độ cao và không chọn lọc, thường tạo hai đồng phân cấu tạo có nhóm
thế ở vị trí 1,4 và 1,5 với tỉ lệ ngang nhau.
Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Fokin và Sharpless [35], Meldal và cộng sự
[38] đã độc lập công bố về ảnh hưởng của xúc tác Cu(I) đến tốc độ phản ứng Huisgen.
Với quy trình mới này phản ứng xảy ra nhanh, hoàn toàn và chọn lọc cho ra sản phẩm
chính là sản phẩm thế 1,4-1,2,3-triazol.

Sơ đồ 1.3. Phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyn và azid với xúc tác Cu(I).
14


Một số nhóm xúc tác thường dùng trong phản ứng CuAAC:
- Các hợp chất Cu(I) (CuBr hoặc CuOAc) với các phối tử (ligand) base hoặc
amin và một tác nhân khử (thường dùng natri ascorbat) để ức chế quá trình oxy hóa
hiếu khí cho Cu(II).
- Muối Cu(II) (thường dùng CuSO4) cùng với một chất khử (natri ascorbat) để
tạo thành hợp chất Cu(I).
- Một số muối Cu(II) hoặc phức chất như Cu(OAc)2 được sử dụng luôn làm xúc
tác mà không cần thêm chất khử vì chúng là những chất oxy hóa mạnh dễ dàng bị
alkyn khử hóa thành Cu(I).
- Kim loại Cu được oxy hóa thành Cu(I).
Hiện nay, các chất xúc tác cho phản ứng CuAAC vẫn đang tiếp tục được tìm
kiếm nhằm nâng cao hiệu quả phản ứng. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Lipshutz và
cộng sự [29] đã sử dụng chất xúc tác Cu trong than hoạt tính (Copper-in-charcoal),
là chất xúc tác dị thể đơn giản, không tốn kém và hiệu quả cao. Nó có thể kết hợp

được trong nhiều loại dung môi, loại được dễ dàng bằng phương pháp lọc và tái sử
dụng được ít nhất trong hai vòng phản ứng mà không bị mất hoạt tính.
Một số dung môi thường dùng trong phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác
Cu(I) theo Meldal và Tornøe [19]:
- Dung môi không phân cực: toluen, cloroform, dicloromethan.
- Dung môi phân cực yếu: tetrahydrofuran, pyridin, dioxan.
- Dung môi phân cực: aceton, MeCN, DMF, DMSO, alcol.
Ngoài ra, người ta còn có thể sử dụng hỗn hợp nước và các dung môi aceton,
THF, MeCN, DMSO, đi kèm theo đó là các nhóm xúc tác Cu(0) hoặc CuSO4 kèm
chất khử như natri ascorbat. Ngược lại, với nhóm dung môi không chứa nước thường
được sử dụng với nhóm xúc tác Cu(I).
Như vậy, với xúc tác Cu(I) trong dung môi phù hợp, phản ứng đóng vòng
Huisgen xảy ra nhanh, hiệu suất cao, chọn lọc cho ra sản phẩm thế 1,4 của vòng 1,2,3triazol.

15