PDF Ngày 1-Giới thiệu, phân tích kiểu gen, tính đa hình DNA v1

SINH HỌC PHÂN
TỬ TRONG LĨNH
VỰC SỨC KHỎE

TS. Nguyễn Hoàng Chương
1


Y HỌC PHÂN TỬ - MOLECULAR MEDICINE
Sinh học
Vật lí học

Bệnh người

Hóa học
Cấu trúc và cơ chế phân tử

Tốn học
Tin học
……

Chẩn đốn

Phịng ngừa

Điều trị

2


MỘT SỐ CỘT MỐC TRONG SỰ HÌNH THÀNH NGÀNH Y HỌC PHÂN TỬ

1949:
1956:
1977:
1977:
1980:
1980:
1986:

thiếu máu do hồng cầu hình liềm (Pauling, Itano)
di truyền, phòng ngừa và điều trị bệnh trên cơ bản phân tử (Williams)
tạo dòng các gen hemoglobin
thư viện bộ gen đầu tiên (Maniatis)
RFLP (Kan)
di truyền ngược ra đời (Botstein, White, Skolnick, Davis)
ý tưởng bộ gen người (Gilbert, Watson)

MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐẠT ĐƢỢC
-Xác định các bệnh di truyền đơn gen, bệnh liên kết với NST X
-Ung thư: proto-oncogene, tumor-supressor gene
-Các tác nhân gây bệnh: vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh
-Liệu pháp gen
-Y học dự phòng
-Y học cá thể
-……….
3


bất thường

không truyền thống lắm

Y học truyền thống: dựa trên triệu chứng lâm sàng của cơ thể, cơ quan, mô, tế bào
Cơ thể: các triệu chứng toàn thân của bệnh viêm gan
Cơ quan: bệnh mắt Basedow

Mô: bệnh ung thu vú
Tế bào: bệnh ung thư cổ tử cung

Y học phân tử: dựa trên các bất thường của các phân tử (NST, DNA, RNA, protein,
lipid, glucid…)
NST: hội chứng tam nhiễm, mất đoạn NST

3 NST 21 -> down

DNA: các bệnh đơn gen
RNA: vật liệu di truyền của virus, microRNA
Protein: các protein ngoại lai, các protein bất thường
4


“Kiểu gen quy định kiểu hình”

Trong cơ thể, bất cứ yếu tố bất thường nào diễn ra đều do sự mà hóa của DNA. Do đó, cho tới hiện nay kiểu gen quyết định kiểu hình. Một số người nói kiểu gen
cịn do tác động của mơi trường, tuy nhiên mơi trường tác động vào chính kiểu gen, từ đó làm thay đổi kiểu gen. Do đó, kiểu gen quyết định kiểu hình. Trước đây,
người ta xác định việc có hay khơng có 1 gen gây bệnh, nâng cấp lên 1 bước nữa, người ta xác định được việc có đột biến hay không, hiện nay người ta xác định
được epigenertic giống hay khơng giống nhau. (Giải thích epigenertic: Kiểu gen giữa 2 người có thể y chang nhau nhưng người bệnh, người không bệnh, là do
epigenertic khác nhau. Epigenertic chính là sự biểu hiện gen thơng qua cơ chế kiểm sốt gồm: methy hóa DNA, biến đổi protein histon, và RNA interferon, 3 yếu tố
này hồn tồn khơng làm ảnh hưởng tới trình tự nucleotid. Nhưng ảnh hưởng tới sự biểu hiện của gen). Do đó quyế định kiểu hình.

Phân tích kiểu gen đóng vai trị quan trọng y

học phân tử

5


ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN TRONG Y HỌC PHÂN TỬ
hình rất dễ nhầm lần giữa bệnh này với bệnh kia, nhưng phân tích kiểu gen là biết bệnh là bênh gi.
-Kiểu gen đa dạng hơn kiểu hình Kiểu
Ví dụ: bệnh thuyên tắc phế quản do gen khác hẳn với COPD về bản chấn nhưng biểu hiện bệnh trên
kiểu hình rất giống nhau. Đều khó thở, thở khị khè... tuy nhiên cách điều trị lại hoàn toàn khác nhau. Do
đó phải xác định chính xác đang mắc bệnh gì.

là gen mang đột biến, gen theo thời gian có thể biểu hiện khác nhau. Thì bằng phân
-Gen thể hiện khác nhau theo thời gian Cũng
tích theo kiểu hình, chúng ta khơng thể xác định được điều này. Ví dụ bênh phenyl keto niệu,

-Hiện tượng Lyon hóa (bất hoạt NST X)

-Tính thấm của gen

phenyl ananlin bị tồn động, và cạnh tranh với aa khác đi lên não, dẫn đến đứa trẻ thiếu các
aa não khác nên dẫn đến trẻ bị chậm phát triển, teo não... bệnh do đột biến gen mã hóa
phenylalanin hydorydase, dẫn đến khơng chuyển hóa phenylalanin. Do đó nếu điều trị sớm
bằng cách giảm thức ăn chứa phenylalanin, thì đứa trẻ phát triển bình thường.

Là hiện tượng một số NST X ở nữ bị bất hoạt, và bất hoạt 1 gen ngẫu nhiên. Do đó phải
xác định NST đồ để xác định thể bar... mới nhận biết được bệnh.

VD bệnh đa tinh sản nội tiết, hình thành nên các khối u nhỏ

-Tính biểu hiện thay đổi của gen
bệnh máu không đông, biểu hiện là máu không đông do thiếu hụt yếu tố đơng máu. Có nhiều
-Bệnh khơng có triệu chứng rõ ràng Vítypedụkhác
nhau, VD hemopilin A là thiếu hụt nhân tố F8, B là do F9... như vậy chỉ nhìn vào kiểu hình
mình khơng xác định được type nào. Do đó biết được thơng tin chính xác để chọn phương pháp
điều trị tương ứng (type A thì bổ sung hemoplin A)....

-Bệnh do tác nhân ngoại lai

6


ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN
1. Thơng tin đa dạng
Bệnh máu khơng đơng

-Có nhiều loại hemophilia: A, B, C
-Các biểu hiện: chảy máu ngẫu nhiên, chảy
máu kéo dài sau chấn thương, phẫu thuật….
-Thiếu các yếu tố đông máu: VIII, IX, XI.
-Do đột biến trên các gen mã hóa các yếu tố
đơng máu khác nhau: F8, F9,
-Phương thức chẩn đốn khác nhau

-Phương thức điều trị khác nhau

7


ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN

2. Gen biểu hiện khác nhau về thời gian
Bệnh Phenylketone niệu

-Do đột biến trên gen PAH.
-Các biểu hiện: nhỏ đầu, suy giảm chức năng
não, co giật, giảm khả năng học tập… ở trẻ
em.
-không chuyển hóa phenylalanin  ứ đọng
phenylalanine  cạnh tranh vận chuyển với
các aa khác  chậm phát triển trí não.
-Trẻ mới sinh khơng có các triệu chứng.

-Khi lớn trẻ sẽ phát triển các triệu chứng trên
-Điều trị sớm sẽ giảm rất nhiều các hậu quả.
8


ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN
3. Gen chịu ảnh hưởng của hiện tượng Lyon hóa

-Hiện tượng 1 trong 2 NST X ở người phụ nữ
bị bất hoạt trong giai đoạn phát triển phôi thai.
-Hiện tượng bất hoạt là ngẫu nhiên, một số tế
bào có NST X từ mẹ bị bất hoạt, 1 số tế bào
khác có NST X từ cha bị bất hoạt.
-Sự bất hoạt được di truyền cho thế hệ tế bào
kế tiếp một cách vĩnh viễn.
-Cơ chế bất hoạt: cấu trúc heterochromatin

-Gây khó khăn trong biểu hiện kiểu hình ở

những bệnh liên kết giới tính.
-Chẩn đốn được thực hiện ở cả 2 NST X.
9


ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN
4. Gen chịu ảnh hưởng của tính thấm (penetrance)
Là số người số người mang kiểu gen biểu hiện ra kiểu hình. Nghĩa là một số người có kiểu gen mà khơng biểu hiện ra kiểu hình, một số lại có. Gọi là tính thấm.

Bệnh đa tân sản nội tiết
-Do đột biến trên gen MEN1
-Biểu hiện ra khối u ở tuyến nội tiết
-Chỉ có 7% người mang đột biến ở gen MEN1
ở độ tuổi 10 biểu hiện ra bệnh
-Ở độ tuổi 60, 100% người mang đột biến
biểu hiện bệnh.

10


ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN
5. Gen chịu ảnh hưởng của tính biểu hiện (expressivity) thay đổi
biểu hiện nhưng biệu hiện nặng nhẹ tùy mức

Hội chứng Marfan

-Chỉ xảy ra ở những gen có tính thấm hồn
tồn.
-Trong y học, tính biểu hiện thường được liên
hệ tới độ nặng của bệnh

-Hội chứng Marfan do đột biến trên gen FBN1
gây ra
-Tuy cùng kiểu đột biến, một số người biểu
hiện dạng nhẹ của bệnh như người gầy, cao,
các bàn tay thanh mảnh.
-Dạng nặng của bệnh có những biến chứng
nguy hiểm đến tính mạng liên quan đến tim và
hệ mạch máu

Do đó, nhìn vào kiểu hình cứ nghĩ là 2 bênh khác nhau, nhưng thực tế chỉ cùng 1 loại bệnh.

11


ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN
6. Bệnh khơng có triệu chứng rõ ràng
Bệnh Cystic Fibrosis dễ nhầm với suyễn COPD, viêm xoang, viêm mũi dị ứng.... Do đó dễ bị điều trị nhầm lẫn.
-Do đột biến trên gen CFTR gây ra.
-Protein CFTR từ gen đột biến bị thay đổi cấu
trúc  mất chức năng vận chuyển ion  gây
ra xơ hóa.
-Một biểu hiện là polyp mũi xoang với các
triệu chứng: tăng thơng khí, dày thành phế
quản, nút nhầy, giãn phế quản.
-Tuy nhiên, các triệu chứng thường trùng lắp
với các bệnh khác như suyễn, viêm mũi dị
ứng, viêm xoang nấm dị ứng, hội chứng bất
động lơng chuyển.
-Chẩn đốn bằng phân tích đột biến trên gen
12

ƢU THẾ CỦA PHÂN TÍCH KiỂU GEN
7. Bệnh do tác nhân ngoại lai
Bệnh ung thư gan HCC

Ung thư biểu mô tế bào gan.

-Sự gắn xen DNA HBV vào bộ gen người gây
ra ung thư
-Ức chế tumor supressor gene, kích thích
tumor promoting gene
-Ảnh hưởng đến con đường truyền tín hiệu
nội bào, trong đó có những gen chủ chốt liên
quan đến tăng trưởng và biệt hóa tế bào.
-Bệnh thường thầm lặng cho đến khi bục phát
các dấu hiệu lâm sàng của bệnh ung thư gan
Do đó thường khơng phát hiện được khi đã bộc phát

-Chẩn đoán sự sát nhập DNA HBV bằng các
kỹ thuật SHPT như lai tại chỗ... từ đó mình xác định sớm nhằm kiểm soát sự phát
sinh ung thư.

13


ra bệnh, đó chính là phân tích đa hình của DNA

PHÂN TÍCH KIỂU GEN  PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA

TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA LÀ GÌ?

14


PHÂN TÍCH KiỂU GEN  PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA

TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA LÀ GÌ?
 Sự khác biệt trong trình tự nucleotide giữa các DNA tƣơng đồng

15


PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA- Phân tích sự khác biệt trong trình tự nucleotide
giữa những DNA tương đồng

DNA tương đồng???
Bộ gen: bộ gen người A vs. bộ gen người B
Nhiễm sắc thể: NST số 1 người A vs. NST số 1 người B

Gen: gen F8 người A vs. gen F8 người B
Đoạn DNA: trình tự điều hịa gen F8 người A vs. trình tự điều
hịa gen F8 người B
Nucleotide: rs12979860 người A vs. rs12979860 người B
16


PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA- Phân tích sự khác biệt trong trình tự nucleotide
giữa những DNA tương đồng

Khác biệt trong trình tự nucleotide???
giữa các DNA tương đồng, nếu có sự khác biệt một số nucleotid thì sẽ sẽ được phát hiện thông qua số đoạn hoặc chiều dài của
DNA cắt giới hạn khác nhau

Từ bên trong: RFLP, VNTR (minisatellite, microsatellite), SNP
ngày xưa thôi, bây giờ sử dụng giải trình tự.

Đột biến: thêm-mất, thay thế, đảo, chuyển đoạn nucleotide

17


TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA- Restriction Fragment Length Polymorphism

Định nghĩa: sự khác biệt trong trình tự nucleotide giữa các DNA tương đồng
được thể hiện bằng sự khác biệt trong số lượng và kích thước các đoạn DNA cắt
giới hạn từ các DNA tương đồng.
RFLP được xác định dựa trên 2 kỹ thuật: Southern blot và PCR.
Hiện nay, phân tích tính đa hình DNA bằng RFLP được thay thế bằng kỹ thuật giải
trình tự.
Nguyên tắc phát hiện: khác biệt trong trình tự nucleotide của các DNA tương
đồng  khác biệt trong trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn  khác
biệt trong số lượng và kích thước các đoạn cắt giới hạn  phân biệt các DNA
tương đồng với nhau.
RFLP thường được sử dụng như một genetic marker khi lập bản đồ di truyền
người.
18


VÍ DỤ VỀ RFLP

MstII: CC/TNAGG

19


TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA- Restriction Fragment Length Polymorphism

chỗ chứa đa hình

khơng căt được

cắt được

VỊ TRÍ ĐA HÌNH

PCR xong rồi xử lý bở ez cắt giới hạn rồi mới
điện di

20


TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA - Variable Number Tandem Repeats

Là 1 điểm, 1 vị trí trên bộ gen, có thể là 1 nu, 1 đoạn DNA, hay 1 gen

Định nghĩa: là một locus trên bộ gen nơi chứa một số lượng lặp lại biến thiên của một trình
tự nucleotide ngắn. VD ng A lặp lại 10 lần, B 20 lần.
Bao gồm minisatellite và microsatellite

21


TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA - Minisatellite
Minisatellite: Trình tự nucleotide ngắn này thường có kích thước từ 30-300 bp,
thường có chung một motif trung tâm với kích thước 11-16 bp là
GGAGGTGGGCAGGA[A/G]G
Số lượng lặp lại của trình tự nucleotide ngắn có thể lên đến 1000 lần.
VNTR được phân bố trên khắp các NST trừ các NST giới tính X và Y.

Có tính đa hình cao: số lần lập lại rất khác nhau tại mỗi locus
dấu vân tay di truyền, trong xác định huyết thống. Bên pháp y xài 24 locus khác nhau để giúp xác định tương đồng cha con

Ứng dụng : dấu vân tay (finger printing), chỉ thị di truyền trong di truyền liên kết

22


TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA - Minisatellite

Cha

6 lần

13 lần

Mẹ
9 lần

23

TÍNH ĐA HÌNH CỦA DNA - Microsatellite
Microsatellite: Trình tự nucleotide cực ngắn
từ 2-6 bp, lặp lại 3-100 lần.
Các tên gọi khác: STR, SSR
Nguồn gốc: đột biến do slippage trong sao
trượt
chép DNA của tế bào.
Phân bố trên bộ gen với tần suất: 1
microsatellite trên vài ngàn nucleotide.
Kiểu thường gặp là (CA)n
Được phát hiện nhờ kỹ thuật PCR kết hợp với
điện di trên gel có độ phân giải cao.

24


CƠ CHẾ REPLICATION SLIPPAGE
Cơ chế trượt gây microsatellite

khi sao chéo trên vùng có trình tự lặp lại rất là cao, thì DNA polymerase có hiện tượng tách khỏi vùng sao chép. Sau 1 thời gian bắt ngược lại,
khi bắt xảy ra 2 trường hợp. 1 là bắt nhầm, vd vị trí số 4 khơng bắt thì bắt vào vị trí số 3. Do đó hoặc là nó tăng microsatellite trên mạch mới hoặc
giảm

25