Nghiên cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan hồ điệp (phalaenopsis amabilis) và ứng dụng trong nhân giống (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRỊNH THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH TẾ BÀO ĐƠN CÂY
LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS)
VÀ ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Mã số: 62 42 30 05

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh năm 2016


Công trình được hoàn thành tại: .......................................................
..........................................................................................................
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Dương Tấn Nhựt
2. PGS. TS. Võ Thị Bạch Mai

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳnh
Phản biện 2: TS. Bùi Minh Trí
Phản biện 3: PGS.TS. Lê Thị Thủy Tiên
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Đặng Văn Đông
Phản biện độc lập 2: TS. Đoàn Thị Phương Thùy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại ........
..........................................................................................................

..........................................................................................................
vào lúc

giờ

ngày

tháng

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
-

Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

-

Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

năm


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 1
1.1. NUÔI CẤY MÔ SẸO ................................................................................ 1
1.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO......................................................... 1
1.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN ....................................................................... 2
1.4. NUÔI CẤY PHÔI ..................................................................................... 2
1.5. SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI
SOMA ....................................................................................................... 3

1.6. QUÁ TRÌNH TÁI SINH ........................................................................... 4
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................... 4
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI
2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ....................................................................... 4
2.2.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy .................................................................. 4
2.2.2. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm ..................................................... 5
2.3. MÔI TRƯỜNG, ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP
THU NHẬN KẾT QUẢ......................................................................... 5
2.3.1. Môi trường thí nghiệm tạo mô sẹo, phôi, PLB, tế bào đơn, ra cây ......... 5
2.3.2. Thiết kế thí nghiệm nuôi cấy lỏng lắc .................................................... 5
2.3.3. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 5
2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................. 5
2.3.3.2. Điều kiện ở vườn ươm ......................................................................... 5
2.3.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào, sinh khối (trọng lượng mô
sẹo, sinh khối huyền phù, phôi, PLB và cây con) .................................. 5
2.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM............................................................... 6
2.4.1. Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn .............. 6
2.4.1.1. Qui trình tạo mẫu in vitro .................................................................... 6
2.4.1.2. Nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu ....................................... 6
2.4.1.3. Khảo sát các môi trường nhân nhanh PLB .......................................... 6
2.4.1.4. Khảo sát các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm
nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào ........................................... 6
2.4.2. Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn ................. 6
2.4.2.1. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên
khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong huyền
phù tế bào ............................................................................................... 6
2.4.2.2. Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn lan Hồ
điệp ......................................................................................................... 6

i


2.4.2.3. Thí nghiệm 4.4. Xác định đường cong tăng trưởng của huyền
phù tế bào lan Hồ điệp ........................................................................... 7
2.4.3. Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn ........................................... 7
2.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose
lên sự tái sinh ......................................................................................... 7
2.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi)
lên sự phát sinh phôi .............................................................................. 8
2.4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc
tự nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp ...................................... 8
2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa cây con in vitro .............................. 9
2.4.5. Nội dung 5: Chuyển cây nuôi cấy mô ra vườn ươm, trồng thử
nghiệm, theo dõi sự sinh trưởng ............................................................. 9
2.4.6. Hình thái giải phẫu ............................................................................... 10
2.4.7. Đo cường độ hô hấp.............................................................................. 10
2.4.8. Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh ............... 10
2.4.9. Thống kê và xử lý số liệu ..................................................................... 10
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 10
3.1. NỘI DUNG 1: TẠO NGUỒN MẪU BAN ĐẦU CHO NUÔI CẤY
TẾ BÀO ĐƠN ...................................................................................... 10
3.1.1. Kết quả nuôi cấy phát hoa và nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB
ban đầu ................................................................................................ 10
3.1.2. Xác định các môi trường nhân nhanh PLB có nguồn gốc từ mẫu
cấy lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa lan Hồ điệp ............................. 10
3.1.2.1. Thí nghiệm 1.1. Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các
mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy ...................... 10
3.2.2.2. Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ
các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy................ 11

3.1.2.3. Thí nghiệm 1.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng
tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12
tuần nuôi cấy ........................................................................................ 11
3.1.3. Xác định các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm
nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào ......................................... 12
3.1.3.1. Thí nghiệm 2.1. Ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ
lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy............ 12
3.1.3.2. Thí nghiệm 2.2. Ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo có
khả năng sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy...... 12
3.2. NỘI DUNG 2: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO THU NHẬN
TẾ BÀO ĐƠN ...................................................................................... 13

ii


3.2.1. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng
phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong nuôi cấy huyền
phù tế bào mô sẹo có khả năng sinh phôi sau 14 tuần nuôi cấy ........... 13
3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo dòng tế bào có khả năng hình thành
tế bào đơn ............................................................................................. 14
3.2.2.1. Thí nghiệm 4.1. Ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế
bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày
nuôi cấy
3.2.2.2. Thí nghiệm 4.2. Ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình thành
tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16
ngày nuôi cấy ....................................................................................... 14
3.2.2.3. Thí nghiệm 4.3. Ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên
khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế
bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy........................................................ 15
3.2.2.4. Thí nghiệm 4.4. Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào

đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp................................ 15
3.3. NỘI DUNG 3: NGHIÊN CỨU TÁI SINH TẾ BÀO ĐƠN ..................... 15
3.3.1. Ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên sự tái
sinh ....................................................................................................... 15
3.3.1.1. Thí nghiệm 5.1. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo
và phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi
cấy ........................................................................................................ 15
3.3.1.2. Thí nghiệm 5.2. Ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá trình
phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần
nuôi cấy ................................................................................................ 16
3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên sự phát
sinh phôi lan Hồ điệp ........................................................................... 17
3.3.2.1. Thí nghiệm 6.1. Ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi
từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy .................. 17
3.3.2.2. Thí nghiệm 6.2. Ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh phôi
từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy .................. 17
3.2.2.3. Thí nghiệm 6.3. Ảnh hưởng của sucrose thí nghiệm (TN) lên sự
phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần
nuôi cấy ................................................................................................ 17
3.2.2.4. Thí nghiệm 6.4. Ảnh hưởng của sucrose công nghiệp (CN) lên sự
phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần
nuôi cấy ................................................................................................ 18
3.3.3. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên
lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp .................................................. 18

iii


3.3.3.1. Thí nghiệm 7.1. Ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát
sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần

nuôi cấy ................................................................................................ 18
3.3.3.2. Thí nghiệm 7.2. Ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh
hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi
cấy ........................................................................................................ 18
3.3.3.3. Thí nghiệm 7.3. Ảnh hưởng của Khoai tây nghiền lên sự phát
sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần
nuôi cấy ................................................................................................ 19
3.4. NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA CÂY CON IN
VITRO .................................................................................................. 19
3.4.1. Thí nghiệm 8.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng và hàm lượng
nước dừa lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế
bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy ............................................................... 19
3.4.2. Thí nghiệm 8.2. Ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả
năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12
tuần nuôi cấy ........................................................................................ 20
3.4.3. Thí nghiệm 8.3. Ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc từ
tế bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng sau 12
tuần nuôi cấy ........................................................................................ 20
3.4.4. Thí nghiệm 8.4. Ảnh hưởng của tuổi cây con khi cấy chuyền lên sự
sinh trưởng của chúng trong điều kiện in vitro sau 12 tuần nuôi
cấy ........................................................................................................ 20
3.5. KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẪU CÁC GIAI
ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI, PLB VÀ RỄ ................................ 21
3.6. CHUYỂN CÂY NUÔI CẤY MÔ RA VƯỜN ƯƠM, TRỒNG THỬ
NGHIỆM, THEO DÕI SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN ........ 21
3.6.1. Thí nghiệm 9.1. Ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng
sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần ở
vườn ươm........................................................................................... 21
3.6.2. Thí nghiệm 9.2. Ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc từ
tế bào đơn lên khả năng sinh trưởng của chúng sau 20 tuần ở

vườn ươm........................................................................................... 21
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ ................................................... 23
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 23
4.2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 24

iv


MỞ ĐẦU
Mặc dù thị trường xuất khẩu phong lan trên thế giới có nhiều triển
vọng song để có thể đáp ứng nhu cầu nội địa, tiến vào thị trường thế giới,
ngành công nghiệp hoa lan của Việt Nam còn phải quan tâm rất nhiều đến
vấn đề tạo giống, công nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch,
đóng gói, kiểm dịch và đầu tư mở rộng cơ sở hạ tầng. Hàng năm Việt Nam
vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng giềng cho
nhu cầu nội địa.
Hiện nay, đối với việc nhân giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis) đã
có nhiều triển vọng. Tuy nhiên, hầu hết các giống lan rất dễ xảy ra biến dị
vì vậy việc nuôi cấy hạt không thể tạo được cây con đồng nhất (Arditti,
1992). Do vậy, để tạo cây con đồng nhất cần phải áp dụng phương pháp
nhân giống vô tính. Khó khăn lớn nhất trong nhân giống vô tính lan Hồ
điệp là nguồn mẫu rất hạn chế do chúng là lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh
để nuôi cấy như nhiều loài lan khác sẽ làm tổn thương cây mẹ (Intuwong và
Sagawa, 1974). Hơn nữa, lan Hồ điệp thường tiết nhiều hợp chất phenol từ
bề mặt vết cắt ra môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu (Fast, 1979). Đối
với lan Hồ điệp các quy trình tái sinh có tần số cao chưa xác định được
(Takuhara và Mii, 2001).
Trong các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật thì nuôi cấy tế bào
đơn có nhiều ưu điểm vượt trội. Để tạo được dòng tế bào đơn thì trong nuôi
cấy huyền phù tế bào, việc loại bỏ các cụm tế bào lớn, sau đó ly tâm sẽ giúp

thu được huyền phù tế bào lý tưởng chỉ chứa các tế bào đơn. Tế bào đơn là
một đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua đó
có thể thu nhận tế bào trần. Do tế bào có tính toàn năng nên từ một tế bào
sinh dưỡng thực vật có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh, sau khi đã tạo
khối tế bào dạng mô sẹo. Về mặt lý thuyết thì nuôi cấy tế bào đơn thành
công cho hệ số nhân giống cao vượt trội hơn hẳn so với các kỹ thuật khác,
chất lượng cây con đồng nhất. Nuôi cấy tế bào đơn còn mở ra những ứng
dụng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng siêu sản xuất
một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến di truyền ở
thực vật bậc cao, giúp rút ngắn thời gian lai tạo giống.
Xuất phát từ những vấn đề trên, tác giả tiến hành luận án: “Nghiên
cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) và
ứng dụng trong nhân giống”.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NUÔI CẤY MÔ SẸO
Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc
tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo
cơ quan. Do đó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân,
rễ,…) dễ tạo mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một
auxin mạnh (như 2,4-D) được sử dụng riêng rẽ hay kết hợp với auxin khác hay
với cytokinin. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có
khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo (Taiz và Zeiger,
2006; George et al., 2008). Sự tạo mô sẹo in vitro thuộc một trong ba quá trình:
sự phản phân hóa của tế bào nhu mô (xung quanh mộc hay libe, trong vỏ hay
lõi), sự phân chia của tế bào tượng tầng hay sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ
khởi để tạo mô sẹo, cần chú ý đến tuổi của mô cấy, sử dụng auxin riêng rẽ hay
phối hợp với cytokinin, bản chất của loại auxin và nồng độ auxin (Hopkin,
1995; Bùi Trang Việt, 2000; George et al., 2008; Suárez và Bozhkov, 2008;

Grafi et al., 2011).
Quá trình hình thành mô sẹo chia ra ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: giai đoạn phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào
chuẩn bị phân chia, giai đoạn này phụ thuộc vào loại mô mẫu, tình trạng sinh lý
của mẫu và điều kiện nuôi cấy.
Giai đoạn 2: phân chia tế bào, sau khi hình thành, các tế bào mô sẹo phân chia
nhanh tạo ra nhiều tế bào mới.
Giai đoạn 3: biệt hóa, các tế bào mô sẹo đi vào giai đoạn biệt hóa, xuất hiện
các con đường trao đổi chất dẫn đến sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính
sinh học.
1.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
Nuôi cấy huyền phù tế bào được khởi đầu bằng cách chuyển các khối
mô sẹo vào môi trường B5, MS lỏng khuấy và bổ sung thêm các dịch chiết có
nguồn gốc tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết malt,… Các
tế bào được tách ra khỏi khối mô sẹo và phân tán vào trong môi trường lỏng,
nơi chúng sẽ phân chia để tạo thành các cụm tế bào nhỏ. Nuôi cấy được duy trì
qua một loạt cấy chuyền dưới những điều kiện về dinh dưỡng và thoáng khí
thích hợp. Việc bổ sung thêm các dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên như nước
dừa, dịch chiết nấm men, các auxin và cytokinin ở nồng độ tối ưu sẽ thúc đẩy sự
phân bào cũng như tăng tốc độ tăng trưởng (Earle và Torrey, 1965; King et al.,
1973). Sự phân bố của các tế bào và các cụm tế bào phụ thuộc vào thành phần
của môi trường dinh dưỡng và sự thông khí của môi trường. Theo King (1980)
nuôi cấy huyền phù tế bào gần với nuôi cấy tế bào đơn. Huyền phù tế bào lý
tưởng có sự phân chia tế bào tích cực, sự cân bằng tốt giữa hai quá trình tạo
nhóm và tách rời tế bào, có tính đồng nhất cao về hình thái và sinh hóa. Huyền
phù tế bào lý tưởng là một dịch mịn, hầu như chỉ bao gồm các tế bào có khả
năng sinh phôi, cô lập hay hợp lại thành từng nhóm nhỏ chứa từ vài đến vài
chục tế bào có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên
môi trường tái sinh trong một điều kiện thích hợp (Bùi Trang Việt, 2000; Assani
et al., 2002; George et al., 2008). Nhu cầu về ánh sáng trong quá trình tạo huyền

phù tế bào thường tương tự như quá trình hình thành mô sẹo trước đó. Sự hình
1


thành và tăng trưởng của huyền phù tế bào có thể xảy ra trong điều kiện tối hoàn
toàn như ở Solanum tuberosum L. (De Vries và Bokelmann, 1986); hay Daucus
carota (Fujimura và Komamine, 1979)]; và cũng có thể xảy ra trong điều kiện
chiếu sáng ở cây Pyrus communis [(Mehra và Jaidka, 1985), Brassica nigra
(Klimaszewska và Keller, 1986) hay ở Solanum melongena (Gleddie et al.,
1983).
1.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN
Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả
những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra. Cho nên mỗi tế
bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn thế. Nuôi cấy tế bào
đơn là phương pháp nuôi cấy tế bào được phân lập vô trùng trên môi trường
dinh dưỡng trong điều kiện có kiểm soát (King, 1980).
Các nguyên tắc cơ bản của nuôi cấy tế bào đơn là cô lập số lượng lớn
các tế bào còn sống nguyên vẹn và nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng
thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển. Tế bào đơn có thể được thu nhận từ
một loạt các mô và cơ quan của thực vật cũng như từ mô sẹo và huyền phù tế
bào. Theo phương pháp truyền thống các tế bào đơn cũng được thu nhận từ nuôi
cấy mô sẹo và huyền phù tế bào trên hệ thống máy lắc. Các tế bào đơn được cô
lập một cách cẩn thận từ huyền phù tế bào bằng kim tiêm. Nhờ sự rung lắc của
máy lắc làm cho các cụm mô sẹo tạo ra các tế bào đơn và các cụm nhỏ tế bào
trong môi trường. Kết quả tạo thành huyền phù tế bào. Huyền phù tế bào được
lọc để loại bỏ những khối tế bào và dịch lọc sau đó được ly tâm để thu nhận các
tế bào đơn. Các mô sẹo rời thường được chọn để nuôi cấy tế bào đơn. Tế bào
đơn là một đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua
đó có thể thu nhận tế bào trần. Do tế bào có tính toàn năng nên từ một tế bào
sinh dưỡng thực vật có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh, sau khi đã tạo

khối tế bào dạng mô sẹo. Nuôi cấy tế bào đơn mở ra những ứng dụng mới trong
việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp
nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến di truyền ở thực vật bậc cao. Mô sẹo
cũng có thể được sử dụng cho nuôi cấy tế bào đơn.
1.4. NUÔI CẤY PHÔI
Phôi soma (phôi vô tính, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ) là phôi hình
thành theo con đường vô tính từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng 2n), theo
con đường sinh phôi soma. Phôi soma phổ biến khi nuôi cấy in vitro của các mô
tách rời trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực
vật ngoại sinh. Trong quá trình sinh phôi soma, tế bào soma đóng vai trò sinh
phôi như hợp tử và sự phát triển phôi cũng trải qua các giai đoạn như trong quá
trình sinh phôi hợp tử. Sự hiện diện của phôi soma là điểm kết thúc của một
chuỗi các bước bao gồm sự thu nhận các tế bào có khả năng phát sinh phôi và
biệt hóa tế bào (Suárez và Bozhkov, 2008). Để tạo thành phôi soma, các tế bào
thực vật đã biệt hóa cần phản biệt hóa (trừ các tế bào mô phân sinh) tạo thành tế
bào gốc, phát triển thông qua giai đoạn phôi đặc trưng để tạo ra tất cả các loại tế
bào của cây mới. Do đó, các tế bào tiền thân của một phôi soma là một tế bào
gốc có tính toàn năng. Các đặc điểm chính để phân biệt một phôi soma với một
chồi bất định là khi giải phẫu hình thái cho thấy phôi có cấu tạo rời rạc, độc lập
không có liên kết mạch với các mô của mô mẹ (Haccius, 1978; Rafael, 2009).
Tuy nhiên, ngay cả sau khi công bố nhiều bài báo về phôi soma, các nhà nghiên
2


cứu vẫn không hiểu được làm thế nào mà một tế bào được lập trình lại để có
thẩm quyền tạo thành một phôi soma (Michael et al., 2010).
Quá trình phát sinh phôi soma thường được xem là con đường trung
tâm của quá trình vi nhân giống thực vật và có vai trò đặc biệt quan trọng trong
các nghiên cứu về phát sinh hình thái thực vật. Quá trình thu nhận phôi soma
thường bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn tạo các tế bào sinh phôi (mô sẹo và

dịch huyền phù tế bào) và giai đoạn tiến hóa phôi soma từ các tế bào sinh phôi.
Dưới các điều kiện xác định, các tế bào mô sẹo hay huyền phù tế bào có thể cho
các sơ khởi cơ quan (sinh cơ quan) hay phôi (sinh phôi soma) dựa vào tính toàn
năng của tế bào thực vật (Ahloowalia, 1991; Bùi Trang Việt, 2005).
Sự sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng phải trải qua hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: mô nuôi cấy trong môi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế
bào trong môi trường này sẽ phản phân hóa và mất tính hữu cực.
Giai đoạn 2: mô sẹo từ giai đoạn 1 sẽ được chuyển sang môi trường có ít hoặc
không có auxin, trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm
ứng với trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình tim và trạng thái hình cá
đuối.
Các phân tích về quá trình phát triển phôi cho thấy sự hình thành phôi của thực
vật gồm hai giai đoạn chính: sự phân đoạn và sự sinh cơ quan phôi
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi: các chất điều hòa sinh
trưởng, nguồn carbohydrate, nguồn nitrogen, các thành phần khoáng trong môi
trường nuôi cấy, tính chất đồng bộ của tế bào.
Hiện nay, những nghiên cứu về đặc tính sinh lý, sinh hóa của quá trình
sinh phôi trong huyền phù tế bào còn rất ít do sự tạo phôi xảy ra không đồng bộ
và tần số không cao. Gần đây, người ta đã thành công trong việc tạo phôi đồng
bộ từ những cụm tế bào kích thước nhỏ với tần số cao hơn trước đây. Nuôi cấy
phôi soma hiện nay được xem như một kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả hơn
trong nhân giống cây trồng mà nhân giống vô tính theo phương pháp cổ điển có
nhiều hạn chế.
1.5. SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI
SOMA
Mỗi giai đoạn của sự phát triển phôi soma liên quan đến việc kích hoạt
và khử hoạt tính của các gene. Quá trình phát triển một số cây trồng là kết quả
của một loạt các tương tác gene, đòi hỏi sự biểu hiện của gene khởi động
(Torres-Ruiz et al.,1996). Sự cô lập các gene cụ thể quyết định sự sinh phôi, các
đặc tính và vai trò của chúng trong quá trình phát triển của phôi là nền tảng cho

sự hiểu biết tổng quát về quá trình điều khiển sự sinh phôi ở cấp độ phân tử
(Magioli et al., 2001). Các giai đoạn và cơ chế tham gia vào quá trình biến đổi
của các tế bào mô sẹo thành các tế bào phôi chưa được biết rõ. Giai đoạn cảm
ứng tạo mô sẹo và chuyển hóa thành phôi được gọi chung là giai đoạn tạo phôi
soma sớm (Kairong et al., 1999; Sato et al., 1995; Momiyama et al., 1995). Các
nghiên cứu gần đây đã cố gắng xác định những khác biệt trong sự biểu hiện
gene giữa mô sẹo và mô phôi. Duncan và cộng sự (2003) đã nhận thấy rằng các
mô với hàm lượng cao protein globulin-1 (Glb1) được mã hóa bởi các chuỗi
polypeptid là các mô có thẩm quyền tạo phôi. Trong mô không phải là phôi,
nồng độ Glb1 rất thấp. Các protein Glb1 được tổng hợp trong phôi hợp tử ngay
sau khi hoa được thụ phấn. Sự biểu hiện của gene SERK đã được phát hiện
3


trong nhóm các tế bào đang trong quá trình kéo dài và không bào hóa trong suốt
giai đoạn phát triển trước khi tạo phôi hình cầu. Somleva và cộng sự (2000)
cũng đã xác định được gene SERK trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi của các tế
bào đơn ở loài Dactylis glomerata. Gene HBK2, một gene mới thuộc lớp I của
họ gene KNOTTED1 (tương tự như gene KNOX) gene được biểu hiện ở cây
Vân sam Na Uy (Picea abies L. Karst.) từ giai đoạn tăng sinh của tiền phôi cho
đến giai đoạn phát triển phôi muộn (Hjortswang et al., 2002). Các gene
homeobox kiểm soát chi tiết tế bào và hình thành mô hình trong thời gian phát
triển của cây. Gene HBK2 chỉ biểu hiện trong các dòng tế bào có khả năng sinh
phôi mà kết quả là tạo phôi soma và không được biểu hiện trong các dòng tế bào
không sinh phôi. Các nghiên cứu khác liên quan đến gene KNOX cũng cho thấy
sự biểu hiện của gene này thể hiện cả trong phôi hợp tử cũng như trong phôi
soma ở cây Ngô (Zea mays L.) (Zhang et al., 2002).
Thực tế là sự phát triển của phôi soma dễ dàng được chia thành các giai
đoạn khác biệt dựa trên đặc điểm hình thái học (phôi hình cầu, phôi hình tim,
phôi hình thủy lôi và phôi lá mầm) điều này dễ tiếp cận hơn so với giai đoạn

phát triển phôi soma sớm. Mặc dù có sự khác biệt cả về mặt phân tử và hình thái
học giữa các mô không sinh phôi và mô sinh phôi, nhưng quá trình biến đổi từ
giai đoạn này đến giai đoạn tiếp theo vẫn còn ít được biết đến. Rất khó để xác
định sự khác biệt trong biểu hiện gene giữa các giai đoạn khi chính các giai
đoạn đó không được xác định rõ (Tammy và Zhongmin, 2004).
1.6. QUÁ TRÌNH TÁI SINH
Tái sinh là quá trình các mô đã biệt hóa phản biệt hóa và chuyển thành
mô non trẻ, có khả năng phân chia tế bào và bước vào chu trình tế bào mới, hình
thành cơ quan (Klerk et al., 1997). Quá trình này gồm ba giai đoạn chính, chịu
sự điều hòa của nhiều yếu tố khác nhau.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI
2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài
Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được tiến hành tại: Phòng Sinh
học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa Học Tây
Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam – 116 Xô Viết Nghệ
Tĩnh - Đà Lạt - Lâm Đồng và Bộ môn Sinh lý Thực vật, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên Tp. HCM – 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Tp. HCM.
2.1.2. Thời gian tiến hành đề tài
Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến
2015.
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy
Vật liệu dùng trong nghiên cứu là phát hoa của các cây lan Hồ điệp
(Phalaenopsis amabilis) trưởng thành, khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh,
cho hoa đẹp trồng trong nhà kính. Chọn những phát hoa có nụ hoa chưa nở.
Chọn các phần trên phát hoa có mang mầm ngủ, ở khoảng vị trí thứ ba từ dưới
lên, hai vị trí mầm ngủ ở phần gốc thường không tạo được chồi nên loại bỏ đi,
phần phía trên mang hoa cũng không sử dụng. Phần phát hoa sử dụng làm
4

nguồn mẫu cấy ban đầu thường chỉ mang từ 4 – 6 vị trí mầm ngủ (Tanaka và
Sakanishi, 1978).
2.2.2. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm
Mẫu cấy ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau (phát sinh mô sẹo từ PLB,
mô sẹo tái sinh từ tế bào đơn, phôi được dùng để trích ly các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật dùng trong sinh trắc nghiệm.
2.3. MÔI TRƯỜNG, ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP THU
NHẬN KẾT QUẢ
2.3.1. Môi trường thí nghiệm tạo mô sẹo, phôi, PLB, tế bào đơn, ra cây
Môi trường căn bản được sử dụng là môi trường MS (Murashige và
Skoog, 1962). Ngoài ra, bổ sung thêm: 30 g/l sucrose (đường Biên Hòa), 9,0 g/l
agar, 1,0 g/l than hoạt tính, riêng đối với nuôi cấy huyền phù tế bào sử dụng môi
trường lỏng không bổ sung agar. Tùy từng thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh
trưởng như BA (6-benzyl adenin), NAA (α-naphthalene acetic acid), 2,4-D (2,4dichlorophenoxy acetic acid),… được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau ở
các nồng độ khác nhau. Tùy từng thí nghiệm mà dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc
tự nhiên được bổ sung thêm hay không bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
2.3.2. Thiết kế thí nghiệm nuôi cấy lỏng lắc
Dung dịch huyền phù tế bào được hình thành trên hệ thống máy lắc, các
bình thủy tinh có thể tích 250 ml có chứa 40 ml môi trường lỏng cấy 1,3 g mô
sẹo và các bình thủy tinh có thể tích 100 ml có chứa 30 ml môi trường lỏng cấy
1 g mô sẹo được đặt lên máy lắc Orbital Shaker S01 (Stuart Scientific, Anh
Quốc) ở tốc độ 100 vòng/phút. Hệ thống này được đặt dưới đèn huỳnh quang
(Rạng Đông, Việt Nam), với cường độ sáng từ 2.500 – 3.000 lux).
2.3.3. Điều kiện nuôi cấy
2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro
10 giờ/ngày
- Thời gian chiếu sáng :
- Cường độ ánh sáng :

2.500 – 3.000 lux
- Nhiệt độ
:
25 ± 2oC
:
75 – 80%
- Độ ẩm trung bình
2.3.3.2. Điều kiện ở vườn ươm
- Thời gian chiếu sáng: ánh sáng tự nhiên
- Nhiệt độ
:
18 – 25oC
- Độ ẩm trung bình
:
80 – 85%
- Che bóng râm bằng lưới đen :
70%
- Cường độ ánh sáng
:
5.000 – 7.000 lux
2.3.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào, sinh khối (trọng lượng mô sẹo,
sinh khối huyền phù, phôi, PLB và cây con)
Mật độ tế bào được tính bằng cách đếm số lượng tế bào. Trọng lượng
của mẫu cấy huyền phù được thu nhận bằng cách lọc trong phễu lọc buchner có
màng lọc millipore 0,22 µm dưới áp lực của máy hút chân không để loại bỏ
nước, sau đó thu sinh khối và cân trên cân phân tích (Sartorius, Đức) để xác
định trọng lượng tươi. Mô sẹo, phôi, PLB và cây con sau khi lấy ra khỏi bình
nuôi cấy cũng được cân trên cân phân tích (Sartorius, Đức).
5

2.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
2.4.1. Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn
2.4.1.1. Qui trình tạo mẫu in vitro
Nuôi cấy phát hoa để tạo chồi.
2.4.1.2. Nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu
Từ các chồi thu được tiến hành nuôi cấy lá để thu nhận PLB.
2.4.1.3. Khảo sát các môi trường nhân nhanh PLB
a) Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các
mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa
Các mẫu cấy PLB có nguồn gốc từ mẫu lá hình thành từ nuôi cấy phát
hoa được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau kết
hợp với 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 20% (v/v) nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l
than hoạt tính.
b) Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ
các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa
Các mẫu cấy PLB có nguồn gốc từ mẫu lá hình thành từ nuôi cấy phát
hoa được cấy vào môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau
kết hợp với 2,0 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% (v/) nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l
than hoạt.
c) Thí nghiệm 1.3. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả
năng tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa
Các mẫu cấy PLB được cấy vào môi trường ½MS và môi trường MS có
bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 20% (v/v) nước dừa, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l
agar, 1,0 g/l than hoạt tính.
2.4.1.4. Khảo sát các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên
liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào
a) Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ
lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp
Các lớp mỏng tế bào cắt dọc (lTCL) PLB có kích thước 0,5 x 1,5 mm

được cấy vào môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l
cao nấm men, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn
Nhựt và cộng sự, 2009) kết hợp với mannitol ở nồng độ khác nhau (0; 10; 20;
30; 40 mg/l).
b) Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo từ
lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp
Các lTCL-PLB có kích thước 0,5 x 1,5 mm được cấy vào môi trường
MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước
dừa, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính kết hợp với adenine ở
nồng độ khác nhau (0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/l).
2.4.2. Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn
2.4.2.1. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả
năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong huyền phù tế bào
Các cụm mô sẹo được cấy vào môi trường MS lỏng có bổ sung 0,1 mg/l
BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar (Dương
Tấn Nhựt và cộng sự, 2009).
2.4.2.2. Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn lan Hồ điệp
6


a) Thí nghiệm 4.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế
bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc
Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g)
được cấy vào môi trường MS bổ sung BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l) kết hợp
với 0,01 mg/l 2,4-D; 1,0 g/l cao nấm men; kết hợp thêm với môi trường nuôi
cấy protoplast gồm có 27,3 g/l mannitol; 27,3 g/l sorbitol; 18 g/l glucose (Lê
Văn Hoàng, 2008.
b) Thí nghiệm 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình
thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc
Song song với thí nghiệm 4.1 chúng tôi cũng tiến hành cải tiến môi

trường nuôi cấy tế bào đơn bằng cách cấy các cụm mô sẹo có khả năng sinh
phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) vào môi trường MS lỏng có bổ sung sucrose
(30; 40; 50; 60; 70 g/l) kết hợp với 0,01 mg/l 2,4-D; 2,0 mg/l BA; 1,0 g/l cao
nấm men; 20% nước dừa.
c) Thí nghiệm 4.3. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên
khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng
lắc
Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g)
được cấy vào môi trường MS lỏng bổ sung sucrose (30; 40 g/l) kết hợp sorbitol
(0; 10; 20; 30; 40 g/l) và bổ sung thêm 0,01 mg/l 2,4-D; 2,0 mg/l BA; 1,0 g/l
cao nấm men; 20% nước dừa.
2.4.2.3. Thí nghiệm 4.4. Xác định đường cong tăng trưởng của huyền phù tế
bào lan Hồ điệp
Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) được
cấy vào ba môi trường tốt nhất cho sự tăng trưởng của tế bào đơn trong huyền
phù tế bào thu được từ ba thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào ở trên là: MS
lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 27,3 g/l mannitol; 27,3 g/l
sorbitol; 18 g/l glucose; 1,0 g/l cao nấm men (Nghiệm thức F3); MS lỏng có bổ
sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 40 g/l sucrose; 1,0 g/l cao nấm men; 20%
nước dừa (Nghiệm thức G1); MS lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4D; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa (Nghiệm
thức H6). Thí nghiệm này nhằm để khảo sát chu kỳ tăng trưởng của huyền phù
tế bào, từ đó xác định pha log của quá trình tăng trưởng của tế bào đơn lan Hồ
điệp nhằm xác định thời điểm thích hợp để cấy chuyền tế bào đơn và nghiên
cứu tái sinh.
2.4.3. Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn
2.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên
sự tái sinh
a) Thí nghiệm 5.1. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo
và phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn
Huyền phù tế bào được thu nhận ở ngày nuôi cấy thứ 16 (pha log kết

quả ở thí nghiệm 4.4) sau khi loại bỏ các cụm tế bào lớn chỉ chứa các cụm nhỏ
tế bào (chứa vài tế bào có nguồn gốc từ tế bào đơn) được cấy với thể tích là 1
ml/bình sử dụng pipette thủy tinh vô trùng vào môi trường MS bổ sung 0,01
mg/l 2,4-D; 2 mg/l BA; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 20% nước dừa; 1,0 g/l
7


than hoạt tính trên các loại giá thể: agar; bông gòn; giấy lọc + agar sau đó được
nuôi cấy trong điều kiện tối.
b) Thí nghiệm 5.2. Khảo sát ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá
trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi có nguồn gốc từ tế bào đơn (kết
quả thí nghiệm 5.1) được cấy vào môi trường có thành phần khoáng thay đổi
[MS0 (không sử dụng môi trường khoáng), ½MS (có hàm lượng khoáng đa lượng
MS giảm đi một nửa), MS] có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 1,0 g/l cao
nấm men; 20% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính và sucrose ở nồng độ
khác nhau (30; 40; 50; 60 g/l).
2.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên
sự phát sinh phôi
a) Thí nghiệm 6.1. Khảo sát ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi
từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi
trường MS bổ sung D-glucose (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA,
2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính.
b) Thí nghiệm 6.2. Khảo sát ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh
phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi
trường MS bổ sung D-fructose (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA,
2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính.
c) Thí nghiệm 6.3. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose thí nghiệm (TN) lên sự

phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi
trường MS bổ sung sucrose TN (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l
NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính.
d) Thí nghiệm 6.4. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose công nghiệp (CN) lên
sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi
trường MS có bổ sung sucrose CN (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l
NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính.
2.4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự
nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp
a) Thí nghiệm 7.1. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát
sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS
bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar;
1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007) còn dịch chiết Cà
chua được bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l).
b) Thí nghiệm 7.2. Khảo sát ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh
hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS
bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar;
1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007) còn Chuối nghiền
được bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l).
8


c) Thí nghiệm 7.3. Khảo sát ảnh hưởng của Khoai tây lên sự phát sinh hình
thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS
bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar;

1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007), còn Khoai tây được
bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l).
2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa cây con in vitro
a) Thí nghiệm 8.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng và hàm
lượng nước dừa lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế
bào đơn
Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường
khoáng (MS và ½MS) bổ sung nước dừa (10; 15; 20%) kết hợp với 2,0 mg/l BA,
0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính.
b) Thí nghiệm 8.2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên
khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn
Các cây con 3 tháng tuổi có nguồn gốc từ tế bào đơn, chiều cao cây 3
cm được cấy vào các bình có thể tích 250 ml trên môi trường ½MS có bổ sung
2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than
hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3 với các mật độ khác nhau (1, 2, 3, 4, 5 cây/bình).
c) Thí nghiệm 8.3. Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc
từ tế bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng
Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn 3 tháng tuổi với các chiều cao
khác nhau (1, 2, 3, 4 cm/cây) được cấy chuyền sang môi trường ½MS có bổ
sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l
than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3.
d) Thí nghiệm 8.4. Khảo sát ảnh hưởng của tuổi cây con có nguồn gốc từ tế
bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng
Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn có độ tuổi khác nhau (2, 3, 4
tháng tuổi) được cấy vào các bình có thể tích 250 ml (kích thước cây 3 cm, cấy
3 cây trong một bình) trên môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l
NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar;
pH = 5,3.
2.4.5. Nội dung 5: Chuyển cây nuôi cấy mô ra vườn ươm, trồng thử nghiệm,
theo dõi sự sinh trưởng

a) Thí nghiệm 9.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng
sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn ở vườn ươm
Chọn các cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro có kích thước 4 – 5 cm,
có 2 – 3 lá và 5 – 6 rễ chuyển ra trồng ex vitro. Tiến hành 3 chế độ tưới nước:
tưới 1 lần/ngày (9h sáng), tưới 2 lần/ngày (9h sáng, 15h chiều), tưới 3 lần/ngày
(9h sáng, 12h trưa, 15h chiều).
b)Thí nghiệm 9.2. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước cây con có nguồn
gốc từ tế bào đơn lên khả năng sinh trưởng ở giai đoạn vườn ươm
Cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro với các chiều cao cây khác nhau
được chuyển ra trồng ex vitro trong điều kiện vườn ươm. Tiến hành theo dõi sáu
kích thước (dựa vào chiều cao cây) sau của cây in vitro ở điều kiện vườn ươm:
kích thước lớn: 7,23 ± 0,81 cm; cây có kích thước vừa: 5,47 ± 0,60 cm; kích
9


thước trung bình: 4,17 ± 0,43 cm; kích thước nhỏ vừa: 2,73 ± 0,51 cm; kích
thước nhỏ trung bình: 1,95 ± 0,37 cm; kích thước nhỏ nhất: 1,01 ± 0,23 cm.
2.4.6. Hình thái giải phẫu
Giải phẫu hình thái phôi, PLB, rễ cây con thu nhận được trên các môi
trường nuôi cấy khác nhau bằng phương pháp nhuộm kép. Phôi, PLB và cây
con được hình thành trong các thí nghiệm khác nhau được giải phẫu để xem xét
hình thái của mô cắt dọc, cắt ngang, nhận biết các vùng mô phân sinh chồi, lông
biểu bì, cấu trúc phôi hình cầu, hình trứng, phôi dạng chuyển tiếp, phôi dạng
PLB, cực ngọn, cực gốc của PLB, cấu trúc rễ.
2.4.7. Đo cường độ hô hấp
Cường độ hô hấp (µmol O2/g TLT/giờ) của mẫu cấy ở các giai đoạn
nuôi cấy khác nhau (phát sinh mô sẹo từ PLB, mô sẹo tái sinh từ tế bào đơn,
phôi, chồi) được xác định bằng máy Oxylab Hansatech bằng điện cực oxygen ở
nhiệt độ 25 ± 2oC, trong điều kiện tối, kết quả là giá trị trung bình của ba lần lặp
lại.

2.4.8. Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh
- Ly trích và phân đoạn
- Sắc ký và cô lập
- Thu nhận và xác định hoạt tính bằng sinh trắc nghiệm
- Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
- Sinh trắc nghiệm cytokinin
- Sinh trắc nghiệm gibberellin
2.4.9. Thống kê và xử lý số liệu
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại (30 bình
nuôi cấy/lần). Số liệu thu nhận được xử lý bằng phần mềm MicroSoft Excel®
2010 và phần mềm Statgraphic centurion XV. Tất cả các số liệu sau khi thu thập
ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị
trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các
mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NỘI DUNG 1: TẠO NGUỒN MẪU BAN ĐẦU CHO NUÔI CẤY TẾ
BÀO ĐƠN
3.1.1. Kết quả nuôi cấy phát hoa và nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban
đầu
Sau 8 tuần nuôi cấy các đoạn cắt phát hoa tạo chồi ở các nốt các chồi có
lá dài khoảng 2 cm, các lá này được sử dụng làm nguồn mẫu cho nuôi cấy tạo
PLB. Các lá được cắt đôi theo chiều dọc (cắt tại phần gân lá), sau đó cắt ngang
vuông góc với gân chính, tạo khoảng 6 mảnh lá cấy vào môi trường tạo PLB,
mỗi bình cấy 2 mảnh. Sau 8 tuần nuôi cấy, tại bề mặt cắt xuất hiện các PLB, các
PLB này được sử dụng làm nguồn mẫu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Xác định các môi trường nhân nhanh PLB có nguồn gốc từ mẫu cấy
lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa lan Hồ điệp
3.1.2.1. Thí nghiệm 1.1. Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các
mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn

gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy
10


Trọng lượng
Số PLB
Số chồi
Số cây
Tỷ lệ sống sót
tươi (mg/mẫu)
(PLB/mẫu)
(chồi/mẫu)
(cây/mẫu)
(%)
A0
1936,1b*
106,45b
8,72a
4,72a
100a
A1
772,3d
40,38c
3,99c
1,66b
64,0c
A2
2296,3a
532,24a
3,86c

1,89b
100a
A3
1103,3c
23,31c
5,59b
5,52a
78,59b
A4
268,2e
7,38d
1,41d
0,69c
25,72d
A5
–
–
–
–
–
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu
hoặc mẫu bị chết.
NT

Kết quả thí nghiệm cho thấy sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng
thực vật trong môi trường nuôi cấy cho thấy hiệu quả rõ rệt về sự tăng trưởng và
biệt hóa tế bào (Madhabi et al., 2014). Nhìn chung, nghiệm thức A2 tốt nhất có
tỷ lệ sống sót cao nhất (100%), mẫu cấy tăng trưởng tốt, trọng lượng tươi đạt
cao nhất, số PLB tạo ra nhiều nhất.

3.1.2.2. Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các
mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có
nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy

Trọng lượng
Số PLB
Số chồi
Số cây
Tỷ lệ sống
tươi (mg/mẫu)
(PLB/mẫu)
(chồi/mẫu)
(cây/mẫu)
sót (%)
b
b
c
a
B0
1512,6
300,14
2,72
3,59
92,21b
a
a
b
b
B1

2346,4
539,14
5,72
2,86
100a
b
b
a
B2
1576,0
312,28
10,86
–
90,0b
B3
269,0c
16,83c
0,62d
0,41c
16,86d
B4
133,1d
13,34c
0,48d
0,14c
24,31c
B5
–
–
–

–
–
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu
hoặc mẫu bị chết.
NT

Trong thí nghiệm này, nghiệm thức B1 cho sự tăng trưởng hơn hẳn so
với các nghiệm thức còn lại, đây là nghiệm thức tăng sinh PLB tốt nhất. Như
vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 20% nước dừa, 2,0 mg/l BA, thì NAA
ở nồng độ 0,5 mg/l (B1) thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh PLB.
3.1.2.3. Thí nghiệm 1.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng
tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi
cấy
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng tăng sinh PLB từ
các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy
Môi
Trọng lượng
Số PLB
Số chồi
Số cây
Tỷ lệ sống
trường
tươi (mg/mẫu)
(PLB/mẫu)
(chồi/mẫu)
(cây/mẫu)
sót (%)
C0
MS

2286,9b
584,45b
4,00c
0,59b
100a
C1
½MS
2391,0a
1169,45a
–
–
100a
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu
hoặc mẫu bị chết.
NT

Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm lượng khoáng đa lượng trong môi
trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tăng sinh PLB. Lan Hồ điệp
vốn là loài cây yêu cầu hàm lượng khoáng thấp, cho nên môi trường nuôi cấy có
hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa C1 (½MS bổ sung 2,0 mg/l BA,
11


0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính) thích hợp nhất
cho nuôi cấy tăng sinh PLB.
3.1.3. Xác định các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên
liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào
3.1.3.1. Thí nghiệm 2.1. Ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp
mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào
cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy
Nồng độ
Trọng lượng
Trọng lương
NT
mannitol (g/l)
tươi (mg/mẫu)
khô (mg/mẫu)
b
D0
0
232,9
142,5c
D1
10
503,8a
137,0d
D2
20
283,2b
195,9a
D3
30
248,4b
169,8b
D4
40
201,9b
131,4d

*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt
thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Bảng 3.5. Cường độ hô hấp của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng của
mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp
sau 8 tuần nuôi cấy
Cường độ hô hấp
(µ
µmol O2/g TLT/giờ)
D0
0
4,338b
D1
10
6,586a
D4
40
3,705c
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Nồng độ mannitol (g/l)

Bảng 3.6. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mẫu cấy khi
khảo sát ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt
dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy
Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nồng độ
Tỷ lệ

(mg/l/g TLT)
mannitol
IAA/Zeatin
(g/l)
IAA
Zeatin
GA3
ABA
D0
0
0,880b
0,337b
1,015b
1,3
1,147a
D1
10
1,050b
0,280c
1,0
1,055a
2,121a
c
c
c
a
D4
40
0,118
0,114

0,066
1,0
1,586
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Khi mẫu cấy mô sẹo tăng trưởng trên môi trường bổ sung 10 g/l
mannitol, tương ứng với chỉ tiêu tăng trưởng trọng lượng tươi đạt cao nhất thì
cường độ hô hấp của mẫu cấy cũng cao nhất (6,586 µmol O2/g TLT/giờ).
Mannitol thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với vai trò tương tự
như chất tạo stress áp suất thẩm thấu và trao đổi chất trong nuôi cấy mô cây gỗ
(George, 1993). Trong thí nghiệm này, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10
g/l mannitol (nghiệm thức D1) cho khả năng tăng trưởng và hình thành mô sẹo
từ mẫu cấy lát mỏng PLB cắt dọc tốt nhất tương ứng với cường độ hô hấp của
mẫu cấy cao nhất, hoạt tính zeatin, GA3 cao nhất.
3.1.3.2. Thí nghiệm 2.2. Ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo có khả
năng sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi
từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy
NT
E0

Nồng độ adenin
(mg/l)
0,0

Trọng lượng
tươi (mg/mẫu)
364,7d

Trọng lượng
khô (mg/mẫu)
133,7e

Số PLB
(PLB/mẫu)
25,33a

Tỷ lệ mô
sẹo (%)
7,33e
12


380,0c
18,67b
16,67d
E1
1,0
799,9c
E2
2,0
1081,9b
574,0b
7,67d
70,67b
E3
3,0
1747,8a

769,1a
6,00d
95,33a
cd
d
bc
E4
4,0
632,7
251,4
14,00
34,67c
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Bảng 3.8. Cường độ hô hấp của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng của
adenine đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ
điệp sau 8 tuần nuôi cấy

Cường độ hô hấp
(µ
µmol O2/g TLT/giờ)
E0
0
4,473b
E3
3
5,729a
E4
4

3,558c
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Nồng độ adenine (mg/l)

Bảng 3.9. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mẫu cấy khi
khảo sát ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế
bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy

Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nồng độ
Tỷ lệ
(mg/l/g TLT)
adenine
IAA/Zeatin
(mg/l)
IAA
Zeatin
GA3
ABA
E0
0
1,283a
0,901a
1,959a
1,085b
1,4
E3

3
1,328a
0,750b
1,777 b
0,523c
1,8
E4
4
0,904b
0,259c
0,072c
1,291a
3,5
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Kết quả nghiên cứu cho thấy adenine ở nồng độ 3 mg/l (nghiệm thức E3)
thích hợp cho việc tạo mô sẹo của lan Hồ điệp. Tóm lại, việc bổ sung adenine ở
nồng độ 3 mg/l (nghiệm thức E3) thích hợp cho việc tạo mô sẹo của lan Hồ điệp
tương ứng với cường độ hô hấp của mẫu cấy cao nhất, hoạt tính IAA tăng cao còn
hoạt tính ABA thấp nhất.
3.2. NỘI DUNG 2: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO THU NHẬN TẾ
BÀO ĐƠN
3.2.1. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát
sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào
mô sẹo có khả năng sinh phôi sau 14 tuần nuôi cấy
Bảng 3.10. Khả năng tăng sinh, phát sinh phôi, PLB và hình thành tế bào
đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy
Trọng lượng

Số cụm
Số lượng
Tế bào đơn
tươi (mg/bình)
PLB
PLB
a
a
a
Lỏng lắc (Lc)
10936,0
35,30
5600,59
Rất nhiều
1963,0b
9,17b
1024,41b
Rất ít
Lỏng tĩnh (Lt)
Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
Kiểu nuôi cấy

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ sống sót của mẫu
cấy
Kiểu nuôi
cấy
Lỏng lắc
Lỏng tĩnh

0
100a
100a

2
100a
100a

Tỷ lệ sống sót (%)
Thời gian nuôi cấy (tuần)
4
6
8
10
100a
100a
100a
80,37a
b
b
b
90,21
80,72
67,81
20,00b

12
50,0a
–

14
–
–
13


Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu
hoặc mẫu bị chết.

Kết quả thí nghiệm cho thấy thời điểm cấy chuyền các phôi và PLB trên
môi trường nuôi cấy lỏng lắc là khoảng 8 tuần, lúc này các mẫu cấy đạt tỷ lệ
tăng sinh tối ưu, cho hiệu quả cao nhất.
3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo dòng tế bào có khả năng hình thành tế
bào đơn
3.2.2.1. Thí nghiệm 4.1. Ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế bào
đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ
điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy
NT
Nồng độ BA (mg/l)
Mật độ tế bào đơn (tế bào x 104/ml)
F0
0,5
2,4452e
F1
1,0
3,6193b
F2
1,5

4,0272b
F3
2,0
6,4562a
F4
2,5
2,9852d
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Thí nghiệm này, cho thấy nồng độ BA thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế
bào lan Hồ điệp là 2,0 mg/l. Ở nồng độ 2,0 mg/l BA cũng thích hợp để nhân
nhanh PLB lan Hồ điệp trên môi trường bán rắn (Sinha và Jahan, 2011).
3.2.2.2. Thí nghiệm 4.2. Ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình thành tế
bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình thành tế bào đơn lan
Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy
Mật độ tế bào đơn
(tế bào x 104/ml)
G0
30
3,1014c
G1
40
4,0893a
G2
50
3,5814b
G3
60

2,2562d
G4
70
1,7852e
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
Nồng độ sucrose (g/l)

NT

Như vậy, đối với nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp với mục đích tạo
dòng tế bào thì nồng độ sucrose 40 g/l (nghiệm thức G2) là thích hợp nhất.
3.2.2.3. Thí nghiệm 4.3. Ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên khả
năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc
sau 16 ngày nuôi cấy
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên khả năng hình
thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau
16 ngày nuôi cấy
NT

Sucrose (g/l)

Sorbitol (g/l)

H0
H1
H2
H3
H4
H5

H6

30
30
30
30
30
40
40

0
10
20
30
40
0
10

Mật độ tế bào
(tế bào x 104/ml)
2,9807c
0,1621g
0,3679fg
0,6869e
0,1520g
4,0110b
8,4771a
14

H7
40
20
1,4101d
0,7204e
H8
40
30
0,4000ef
H9
40
40
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Các tế bào đơn hình thành ở nghiệm thức bổ sung kết hợp 40 g/l sucrose
và 10 g/l sorbitol (H6) ở trạng thái đẳng trương, tế bào thường có kích thước
nhỏ, đẳng kính, tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ, hoạt động biến dưỡng
mạnh đang ở giai đoạn phân chia tế bào.
3.2.2.4. Thí nghiệm 4.4. Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào đơn
trong nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp
Bảng 3.15. Đường cong tăng trưởng của tế bào đơn lan Hồ điệp trong
huyền phù tế bào sau 20 ngày nuôi cấy

Mật độ tế bào (tế bào x 104/ml)
NT
Thời gian nuôi cấy (ngày)
4
8
12

16
20
b
b
F3
0,5342
1,0741
4,2108b
6,4603b
2,6862b
c
c
c
c
G1
0,2664
0,4861
1,8924
4,0912
2,2803c
a
a
a
a
H6
1,7531
6,2031
8,1010
8,4631
6,6101a

*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Đối với huyền phù tế bào lan Hồ điệp được thiết lập để nuôi cấy thu tế
bào đơn thì chu kỳ tăng trưởng của tế bào khoảng 15 đến 16 ngày cần tiến hành
cấy chuyền qua môi trường mới. Môi trường tối ưu cho huyền phù tăng trưởng
và tạo tế bào đơn là MS lỏng lắc bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 40 g/l
sucrose; 10 g/l sorbitol; 1 g/l cao nấm men; 20% nước dừa (Nghiệm thức H6).
3.3. NỘI DUNG 3: NGHIÊN CỨU TÁI SINH TẾ BÀO ĐƠN
3.3.1. Ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên sự tái sinh
3.3.1.1. Thí nghiệm 5.1. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo và
phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo và phát sinh
phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy
Trọng lượng
Trọng lượng
Tỷ lệ tạo
Tỷ lệ tạo
Tỷ lệ tạo
tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) mô sẹo (%)
phôi (%)
PLB (%)
I0
–
Agar
877,0a
292,1a
74,52a
25,53b
I1

–
Bông gòn
657,9b
219,3b
38,44b
61,63a
I2 Giấy lọc + agar
435,9c
145,2c
6,91c
14,21c
78,90a
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu
hoặc mẫu bị chết.
NT

Giá thể

Bảng 3.17. Cường độ hô hấp của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng của giá
thể lên khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi từ tế bào đơn sau
12 tuần nuôi cấy
Cường độ hô hấp
(µ
µmol O2/g TLT/giờ)
I0
Agar
4,851b
I1
Bông gòn

5,648a
I2
Giấy lọc + Agar
5,747a
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Giá thể

15


Bảng 3.18. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mẫu cấy
khi khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo và
phát sinh từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy
Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Tỷ lệ
(mg/l/g TLT)
IAA/Zeatin
IAA
Zeatin
GA3
ABA
I0
Agar
0,843a
0,409c
1,555b
0,207a

2,1
a
a
a
I1
Bông gòn
0,922
1,209
1,911
0,197a
0,8
I2 Giấy lọc + Agar
0,547b
0,672b
0,910b
0,193a
0,8
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Giá thể

Thí nghiệm này cho thấy giá thể agar thích hợp cho sự hình thành mô
sẹo, giá thể bông gòn thích hợp cho sự phát triển và duy trì trạng thái phôi của
mẫu cấy tương ứng với hoạt tính IAA đều tăng cao nhất.
3.3.1.2. Thí nghiệm 5.2. Ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá trình
phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần nuôi cấy
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá trình phát sinh phôi
từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần nuôi cấy

Khoáng
MS

Sucrose
Trọng lượng
Trọng lượng
Số PLB
Tỷ lệ phôi
(g/l)
tươi (mg/mẫu)
khô (mg/mẫu)
(PLB/mẫu)
(%)
d
d
f
J0
30
2053,8
1073,4
9,00
95,67a
f
f
g
J1
40
1696,4
762,7
3,33

91,33d
MS0
J2
50
1130,8g
476,3g
1,67h
43,67h
J3
60
354,2j
133,9i
0,67i
4,67j
J4
30
2305,7bc
1152,2c
15,00d
94,67bc
J5
40
1862,8e
806,7f
16,67c
84,00e
½MS
J6
50
671,6h

276,8h
17,67b
73,67f
J7
60
392,1j
121,3i
12,67e
47,33g
J8
30
2949,3b
1500,7b
17,00c
94,33c
J9
40
3192,5a
1789,8a
18,67a
95,33ab
MS
J10
50
2084,8d
917,7e
14,67d
73,67f
J11
60

523,1i
238,6h
18,33a
37,00i
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Bảng 3.20. Cường độ hô hấp của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng khoáng
và sucrose lên quá trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc
từ tế bào đơn sau 8 tuần nuôi cấy
Cường độ hô hấp
Nồng độ sucrose
(g/l)
(µ
µmol O2/g TLT/giờ)
J0
MS0
30
15,348c
J4
½MS
30
16,499a
J9
MS
40
18,922b
J11
MS

60
3,876d
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.
NT

Khoáng MS

Bảng 3.21. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mẫu cấy
khi khảo sát ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá trình phát
sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần nuôi
cấy
NT

Khoáng
MS

J0
J4
J9

MS0
½MS
MS

Nồng độ
sucrose
(g/l)
30
30

40

Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật (mg/l/g TLT)
IAA
Zeatin
GA3
ABA
0,549c
0,872b
1,011c
0,224b
0,610b
0,793b
1,473b
0,181b
0,968a
1,086a
1,670a
0,120b

Tỷ lệ
IAA/Zeatin
0,6
0,8
0,9
16


J11

MS
60
0,468c
0,486c
0,670d
1,020a
1,0
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Trong thí nghiệm này việc bổ sung 40 g/l sucrose vào môi trường MS là
tối ưu nhất cho sự hình thành phôi tương ứng với cường độ hô hấp đạt cao nhất,
hoạt tính của các chất kích thích sinh trưởng (IAA, zeatin, GA3) đều cao nhất
trong khi hoạt tính ABA thấp.
3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên sự phát
sinh phôi lan Hồ điệp
3.3.2.1. Thí nghiệm 6.1. Ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi từ
mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có
nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
NT

Trọng lượng
tươi (mg/mẫu)

Trọng lượng
khô (mg/mẫu)

Đặc điểm

Phát sinh phôi tương đối đồng nhất, phôi
M0
125,1a
51,1a
cầu, vàng nhạt, nhỏ, một số hóa nâu kém
sức sống
M1
116,2b
37,2b
Phôi cầu, nhỏ, vàng nhạt
M2
101,3c
34,3b
Phôi cầu, nhỏ, khỏe
Phôi vàng nhạt hơi nâu. Tỷ lệ sống sót là
M3
75,2d
26,0c
57,14%
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

Nồng độ D-glucose thấp (10 g/l) thích hợp cho phát sinh phôi từ mô sẹo.
D-glucose được thấy là cần thiết cho sự tăng trưởng nhanh của tế bào (Kim et
al., 1995). Điều này cũng phù hợp với nuôi cấy mô sẹo P. amabilis. D-glucose
được ưu tiên khi làm nguồn carbon trong một dòng tế bào (Fett-Neto et al.,
1994).
3.3.2.2. Thí nghiệm 6.2. Ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh phôi từ
mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có

nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
NT
N0
N1
N2
N3

Trọng lượng
tươi
Đặc điểm
(mg/mẫu)
–
Mẫu chết, nghiệm thức này không thích hợp cho phát sinh phôi
–
Mẫu chết, nghiệm thức này không thích hợp cho phát sinh phôi
–
Mẫu chết, nghiệm thức này không thích hợp cho phát sinh phôi
–
Mẫu chết, nghiệm thức này không thích hợp cho phát sinh phôi
*Ghi chú: (-): Không có số liệu hoặc mẫu bị chết.

Kết quả thí nghiệm cho thấy D-fructose không thích hợp cho nuôi cấy
mô sẹo P. amabilis.
3.3.2.3. Thí nghiệm 6.3. Ảnh hưởng của sucrose thí nghiệm (TN) lên sự
phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của sucrose TN lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có
nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
NT

Trọng lượng Trọng lượng

tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu)

O0

338,3a

115,4a

O1

248,1b

83,4b

Đặc điểm
Phôi xanh, nhiều lông hút trắng; mẫu phát sinh phôi không
đồng nhất, một số phôi vàng nhạt, hình cầu, xốp
Phôi vàng nhạt, hình cầu, có một số phôi trắng, mẫu cấy tạo
cụm phôi
17


Phôi vàng tươi, hình cầu, có mô sẹo, một số nâu đen, tỷ lệ sống
sót là 57,14%
O3
98,3d
34,1d
Duy trì trạng thái mô sẹo, chết nhiều, tỷ lệ sống sót là 28,57%
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05.

171,2c

O2

57,1c

Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường O1 (20 g/l sucrose TN) là thích
hợp nhất cho sự phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy.
3.3.2.4. Thí nghiệm 6.4. Ảnh hưởng của sucrose công nghiệp (CN) lên sự
phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của sucrose CN lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có
nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy
NT

Trọng lượng Trọng lượng
tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu)

Đặc điểm

Phôi vàng nhạt, hình cầu, kích thước nhỏ, xốp, khỏe có sức
P0
149,0
51,4
sống, phát sinh phôi đồng đều
Phôi vàng nhạt, đồng nhất, xốp, kích thước nhỏ, hình cầu,
P1
332,3a
109,0a
mẫu tạo phôi ở dạng cụm
Mẫu ít tạo phôi chủ yếu tạo mô sẹo vàng đậm; phần lớn mẫu

P2
108,4c
32,3c
chết, có khoảng 28,57% mô sẹo
P3
–
–
Mẫu chết 100%, nâu đen
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu
hoặc mẫu bị chết.
b

b

Như vậy, trong thí nghiệm phát sinh phôi từ mô sẹo thì nồng độ sucrose
CN 20 g/l là thích hợp nhất (nghiệm thức P1).
Tóm lại, trong bốn loại đường được sử dụng trong nghiên cứu thì
sucrose CN ở nồng độ 20 g/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh phôi từ mô sẹo.
3.3.3. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên lên
sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp
3.3.3.1. Thí nghiệm 7.1. Ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát sinh
hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát sinh hình thái
của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy
Trọng lượng
Trọng lượng
Số PLB
Số chồi
Tỷ lệ tạo mô

Tỷ lệ sống
tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu)
sẹo (%)
sót (%)
Q0
1348,2c
309,3c
70,72c
2,27c
–
97,80c
Q1
697,1d
078,3d
25,28d
–
–
63,41d
Q2
1642,2b
620,2a
86,48b
3,59b
–
100a
Q3
2398,1a
374,0b
153,65a
5,14a

–
100a
Q4
801,3c
61,2e
25,86d
–
35.43a
98,00b
e
f
e
Q5
219,2
34,0
2,86
–
–
4,00e
Q6
123,4f
39,3f
–
–
–
–
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về
mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu
hoặc mẫu bị chết.
NT

Khi bổ sung dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên là dịch chiết Cà
chua vào nuôi cấy mô sẹo lan Hồ điệp nhằm mục đích kích thích sự tăng trưởng
của mẫu cấy và tạo PLB thì nên bổ sung 30 ml/l (nghiệm thức Q3).
3.3.3.2. Thí nghiệm 7.2. Ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh hình
thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh hình thái của mô
sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy
NT

Trọng lượng
Trọng lượng
tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu)

Số PLB
(PLB/mẫu)

Số chồi
(chồi/mẫu)

Tỷ lệ sống sót
(%)
18