Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử gen kháng cephalosporin của vi khuẩn e coli sản sinh men betalactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại thái bình và sóc sơn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN XUÂN BÁCH

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân
tử gen kháng Cephalosporin của vi
khuẩn E. coli sản sinh men Betalactamase phân lập từ người chăn
nuôi và lợn tại
Thái Bình và Sóc Sơn

2016


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách
LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến TS. Đặng Thị
Thanh Sơn đã tận tình, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học –
Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, toàn thể cán bộ Phòng Công
nghệ tế bào động vật, Trung tâm giám định ADN, Phòng Công nghệ sinh học tái
tạo môi trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập,
thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Bộ môn Vệ sinh Thú y- Viện Thú y
đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo,
các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học.
Luận văn này là một phần kết quả của đề tài có mã số 106-YS thuộc Quỹ

phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED). Tôi xin chân thành
cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên khích lệ của gia đình,
bạn bè và các đồng nghiệp trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Học viên

Trần Xuân Bách
i


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa được sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Học viên

Trần Xuân Bách

ii


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 4
1.1.Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 4
1.1.1. Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli ...................................................... 6
1.1.2. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli ................................................. 6
1.1.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn E. coli................................................ 7
1.2. Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli ..................................... 7
1.2.1. Hiểu biết về thuốc kháng sinh ............................................................... 7
1.2.2. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn ........................................... 12
1.2.3. Enzyme beta-lactamase........................................................................ 16
1.3. Một số nghiên về tính kháng thuốc của vi khuẩn trong và ngoài nước ..... 20
1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 20
1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước ............................................................. 22
CHƯƠNG II: NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 24
2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 24
2.1.2. Hóa chất sử dụng ................................................................................. 25

2.1.3. Thiết bị sử dụng ................................................................................... 25
2.1.4. Phần mềm tin sinh học ......................................................................... 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 27
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn E. coli ..................................... 27
2.2.2. Nhân đoạn gen kháng kháng sinh của E. coli bằng phản ứng PCR .... 28
2.2.3. Phương pháp điện di kiểm tra kết quả ................................................. 33
2.2.4. Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F. Sanger ...................... 33
2.2.5. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide ......................................... 34
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 36
iii


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

3.1. Kết quả phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm cephalosporin của các
chủng E. coli kháng cefotaxime phân lập từ Thái Bình và Sóc Sơn ................ 36
3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của một số gen kháng kháng sinh .................. 40
3.2.1. Giải trình tự các gen kháng kháng sinh thu được ................................ 40
3.2.2. Đặc điểm sinh học phân tử gen CTX -M ............................................. 43
3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử gen TEM .................................................. 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 54

iv


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

E. coli

Escherichia coli

ESBL

Extended Spectrum beta-lactamase

ADN

Deoxyribonucleic acid

ARNt

ARN de transport

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase Chain Reaction

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

UV

Ultraviolet

Bla

Beta-lactamase

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CDS

Coding DNA sequence

cs

Cộng sự

v


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin ................................... 12
Bảng 2.1. Số lượng chủng E. coli nghiên cứu…………………………………………..24
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ................................................... 26
Bảng 2.3. Phần mềm sử dụng............................................................................... 27
Bảng 2.4. Các cặp gen mồi để phát hiện các gen kháng kháng sinh TEM, SHV
and CTX-M (Hasman et al. 2005) ....................................................................... 32
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ............................................................ 32
Bảng 3.1. Tỷ lệ phát hiện gen CTX-M và gen TEM ở các chủng E. coli kháng
cefotaxime………………………………………………………………………37
Bảng 3.2. Nguồn gốc các chủng E. coli được giải trình tự gen kháng kháng sinh
.............................................................................................................................. 41
Bảng 3.3. Bảng kí hiệu gen CTX-M .................................................................... 43
Bảng 3.4.Vị trí đột biến nucleotit gen CTX-M .................................................... 44
Bảng 3.5. Vị trí đột biến axit amin ....................................................................... 46
Bảng 3.6. Nhóm các gen có trình tự nucleotit giống nhau .................................. 48
Bảng 3.7. Bảng kí hiệu gen TEM……..……………………………………….. 49

vi


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình mô tả vi khuẩn E. coli ........................................................................5
Hình 1.2. Cấu trúc của vòng beta-lactam ..................................................................10
Hình 1.3. Cấu trúc chung của cephalosporin ............................................................11
Hình 1.4. Sự lan truyền gen kháng thuốc bằng hình thức thông qua các R-plasmid
(ảnh nguồn internet) ..................................................................................................15

Hình 1.5. Đề kháng thu được do nhận được gen nằm trên Integron.........................16
Hình 1.6. Vị trí tác động của enzyme beta-lactamse ................................................20
Hình 2.1. Vi khuẩn E. coli trên môi trường thạch………………………………25
Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR ................................................................29
Hình 2.3. Các bước của một chu kì PCR ..................................................................31
Hình 2.4. Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger ..........................33
Hình 2.5. Kiểm tra chất lượng tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự ..............................34
Hình 2.6. Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông .........35
Hình 3.1. Kết quả phát hiện gen TEM của một số chủng E. coli bằng phản ứng
PCR……………………………………………………………………………..36
Hình 3.2. Kết quả phát hiện gen CTX-M của một số chủng E. coli bằng phản ứng
PCR ...........................................................................................................................36
Hình 3.3.Tỉ lệ chủng E. coli ở người mang gen kháng kháng sinh ..........................38
Hình 3.4. Tỉ lệ chủng E. coli ở lợn mang gen kháng kháng sinh ..............................38
Hình 3.5. Kết quả phát hiện gen SHV của một số chủng E. coli bằng phản ứng PCR
...................................................................................................................................40
Hình 3.6. Hình ảnh quá trình xử lý trình tự nucleotit của gen CTX-M ....................42
Hình 3.7. So sánh mức độ tương đồng của các gen CTX-M với các gen trên ngân
hàng gen thế giới .......................................................................................................42
Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotit gen CTX-M......................................................44
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotit gen TEM ..........................................................50
vii


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

MỞ ĐẦU
Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chưa được quản lý chặt chẽ (về

liều lượng kháng sinh, cách pha trộn,và dùng kháng sinh theo thói quen) sẽ
dẫn đến hiện tượng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm và các sản phẩm từ
chăn nuôi gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người [52]. Nguy
hiểm hơn cả là tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh. Vấn
đề vi khuẩn kháng thuốc trong những năm gần đây trở thành vấn đề toàn cầu
khi ngành chăn nuôi, và đặc biệt là khi chăn nuôi lợn đang phát triển mạnh
mẽ. Với đặc điểm thời tiết nóng ẩm mưa nhiều ở nước ta, dịch bệnh ở đàn lợn
nuôi thường xuyên xảy ra. Một trong những biện pháp chính để phòng trị
bệnh xảy ra trong chăn nuôi lợn là sử dụng thuốc kháng sinh, không chỉ riêng
ở Việt Nam mà ở nhiều nước trên thế giới [26]
Vi khuẩn kháng kháng sinh luôn là vấn đề quan tâm của các nước trên
thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. Theo Son và cs (2011), vi khuẩn
kháng lại kháng sinh đang tiếp tục gây nên những tổn thất nặng nề về kinh tế
trong chăn nuôi và gây nguy hiểm đến tính mạng của người bệnh và vật nuôi
[48]. Vi khuẩn và gen kháng thuốc của vi khuẩn có thể nhanh chóng lan
truyền ra môi trường, kể cả trong bệnh viện, cộng đồng và trong chăn nuôi.
Trong khi tốc độ đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng thì việc nghiên cứu
tìm ra các loại kháng sinh mới để điều trị thì gặp khó khăn. Như vậy trong
cuộc chạy đua dành ưu thế thì vi khuẩn đang vươn lên dẫn trước. Khoảng
cách giữa khả năng vi khuẩn biến đổi để trở thành chủng kháng kháng sinh và
khả năng con người kiểm soát được vi khuẩn đang được nới rộng. Vì vậy, nếu
chúng ta không có biện pháp làm giảm tốc độ kháng thuốc kịp thời thì sẽ đẫn
đến hậu quả không có thuốc kháng sinh để điều trị.
Kháng sinh nhóm beta-lactam được biết đến sớm nhất trong lịch sử
kháng sinh và có vai trò đặc biệt trong điều trị nhiễm khuẩn. Hiện nay nhóm
beta-lactam có số lượng kháng sinh lớn nhất, chiếm ba phần tư tổng số lượng
1


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

kháng sinh đang lưu hành. Trong những năm gần đây, các kháng sinh
Cephalosporin được sử dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng nói chung và
trong điều trị thú y nói riêng. Do được sử dụng rộng rãi nên tỷ lệ vi khuẩn đề
kháng các kháng sinh này là rất cao, nhất là ở các vi khuẩn Gram âm. Hiện
nay đã xuất hện nhiều chủng vi khuẩn Gram âm sinh men beta-lactamase và
beta-lactamase phổ rộng (ESBL: Extended Spectrum beta-lactamase) đề
kháng các kháng sinh nhóm beta-lactam, bao gồm các kháng sinh phổ rộng
như Cephalosporin. Sinh ESBL vẫn là nguyên nhân chủ yếu gây gia tăng đề
kháng kháng sinh nhóm beta-lactam ở những vi khuẩn Gram âm như:
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa đặc biệt là Escherichia coli.
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện sự tương đồng kiểu
hình và kiểu gen của các chủng E. coli sản sinh enzyme beta-lactamse được
phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân, sản phẩm chăn nuôi, và môi trường.
Vi khuẩn E. coli dễ dàng được phát hiện trong chất thải chăn nuôi (Son et
al., 2011) [47]. Đây là vi khuẩn chính gây bệnh đường tiêu hóa ở lợn và
người. Việc quản lý chất thải trong ngành chăn nuôi chưa được thực hiện một
cách triệt để nên một lượng lớn chất thải lợn được xả thẳng ra môi trường.
Đặc biệt đối với các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ thì việc sử dụng đồ bảo hộ, các công
cụ hỗ trợ việc ngăn chặn vi khuẩn từ vật nuôi sang người trực tiếp chăn nuôi
gần như chưa có. Đây là nguy cơ làm cho các vi khuẩn, trong đó có các vi
khuẩn kháng kháng sinh có trong chất thải chăn nuôi lây nhiễm sang người.
Đây phải chăng là những nguyên nhân cơ bản làm tăng khả năng kháng kháng
sinh của E. coli ở đàn lợn và làm lây nhiễm E. coli kháng thuốc cho người
chăn nuôi lợn (do thường xuyên tiếp xúc với chất thải chăn nuôi).
Để làm sáng tỏ hiện tượng lây truyền gen kháng thuốc của vi khuẩn E.
coli từ vật nuôi sang người, tôi thực hiện đề tài khoa học“Nghiên cứu đặc
điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E. coli sản

2


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

sinh men Beta-lactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại Thái Bình
và Sóc Sơn”
Kết quả sử dụng trong luận văn được trích từ kết quả của đề tài
NAFOSTED có mã số 106-YS.
Mục tiêu của đề tài.
- Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh nhóm
Cephalosporin (sản sinh enzyme beta-lactamase) phân lập từ chất thải của
người chăn nuôi, chất thải của lợn và môi trường.
- Xác định trình tự gen kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sản sinh
enzyme beta-lactamase
- Đánh giá sự tương đồng về kiểu gen kháng kháng sinh của E. coli
được phân lập từ người chăn nuôi và lợn
Ý nghĩa của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu khoa học cung cấp thông tin
về thực trạng nhiễm vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin
ở lợn và người chăn nuôi
- Làm cơ sở khoa học cho việc khẳng định có hay không hiện tượng
truyền lây gen kháng thuốc beta-lactam qua plasmid giữa người và lợn để
từng bước kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc, ngăn chặn nguy cơ kháng kháng
sinh của vi khuẩn ở Việt Nam.

3

Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
Vi khuẩn Escherichia do nhà khoa học Escherich phát hiện lần đầu tiên năm
1885. Giống Escherichia được chọn là đại diện điển hình của họ vi khuẩn
đường ruột. Giống này gồm nhiều loại như E. coli, E.adecarboxylase,
E.blattae, E.fergusonii, E.hermanii và E.vulneris. Trong đó E. coli có vai trò
quan trọng nhất và được chọn là loài điển hình của giống Escherichia, chiếm
80% các vi khuẩn hiếu khí kí sinh ở đường ruột của người
Trước đây vi khuẩn Escherichia coli được gọi là Bacterium coli commune hay
Bacilus coli commnis, lần đâu tiên được phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy
năm 1885 và được đặt theo tên của người bác sĩ nhi khoa Đức Theodor
Escherich [5]. Vi khuẩn E. coli tổng hợp một số sinh tố B, E, K và tạo quần
thể vi khuẩn cân bằng ở ruột. Đồng thời E. coli cũng là nguyên nhân gây nên
một số bệnh.
Vi khuẩn E. coli là trực khuẩn Gram (-) có kích thước trung bình là 2-3 µm x
0,3-0,6 µm, trong môi trường nuôi cấy như canh khuẩn già xuất hiện những
trực khuẩn dài 4-8µm hoặc vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.
coli có vỏ nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động, chúng không sinh
nha bào và có thể có giáp mô. Vi khuẩn E. coli sống ở nhiều nơi trong môi
trường, đặc biệt có cả trong cơ thể người và động vật. Trong ruột, E. coli sống
hòa bình và giúp cơ thể tổng hợp các loại vitamin K, B. Hiện nay, đã tìm ra
hàng trăm chủng vi khuẩn E. coli. Hầu hết các chủng E. coli là vô hại và sống
trong đường ruột của người và động vật khỏe mạnh

4


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

Hình 1.1. Hình mô tả vi khuẩn E. coli
(ảnh nguồn internet)
Theo phân lọai vi khuẩn E. coli là vi khuẩn thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Tộc: Escherichiae
Giống: Escherichia
Loài: Escherichia coli
Nơi cư trú chính của Escherichia coli thường ở phần sau của ruột, ít khi
ở dạ dày hay ở phần trước ruột các loài động vật như: ngựa, bò, dê, cừu, lợn,
chó, mèo, gia cầm và người. Chúng theo phân của người hay gia súc đào thải
ra ngoài, loài ăn thịt bài tiết nhiều E. coli hơn loài ăn cỏ. E. coli xuất hiện và
sinh sống rất sớm trong đường ruột người và động vật, chỉ vài giờ sau sinh
(sau khi đẻ 2 giờ) và tồn tại đến khi con vật chết.
Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001). Các chủng E. coli không gây
bệnh mà chỉ khi các điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém và
trên cơ sở mắc kế phát sau các bệnh ký sinh trùng, bệnh virus, … dẫn tới sức
5


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E. coli mới trở nên cường độc và
có khả năng gây bệnh [6].
1.1.1. Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli không sinh nha bào nên có sức đề kháng yếu, bị diệt ở
nhiệt độ 55oC trong 1 giờ hoặc 60oC trong vòng 30 phút, đun sôi 100oC thì
chết ngay. Những chủng vi khuẩn E. coli trong phân có xu hướng đề kháng
cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài. Ở môi trường
bên ngoài, các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng [6]
Các chất sát trùng thông thường như axit Phenic 3%, Hydroperoxit 1%,
Focmon 1%... có thể diệt vi khuẩn trong 5 phút.
1.1.2. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli
E. coli là thành viên thuộc nhóm vi khuẩn thông thường sống trong
đường tiêu hóa của người và vật nuôi, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi
khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên, E. coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng , nó
đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm
đường mật. E. coli gây bệnh bởi nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố
không phải là độc tố bao gồm:
- Khả năng bám dính: yếu tố bám dính giúp vi khuẩn thực hiện bước
đầu tiên của quá trình gây bệnh là bám dính lên niêm mạc ruột nhờ một hay
nhiều yếu tố bám dính. Chúng có 4 yếu tố bám dính quan trọng là F4, F5, F6,
F41.
- Khả năng xâm nhập: là khả năng vi khuẩn qua được hàng rào bảo vệ
lớp musoca trên bề mặt ruột non và tế bào biểu mô, đồng thời sản sinh và phát
triển trong lớp tế bào này, tránh sự đại thực bào.
- Khả năng gây dung huyết: khả năng sản sinh ra Heamolysin của E.
coli có thể được coi như một yếu tố độc lực quan trọng. Kiểu dung huyết quan
trọng nhất là kiểu α và β.

6

Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

- Tính kháng kháng sinh: Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh
của E. coli nằm trong plasmid. Các plasmid nằm trong tế bào vi khuẩn thuộc
họ vi khuẩn đường ruột nói chung và E. coli nói riêng có khả năng tồn tại,
nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi khuẩn, do vậy nó có vai trò quan
trọng có thể gây nên hiện tượng kháng thuốc và có thể truyền ngang (lây
truyền giữa các loài vi khuẩn khác nhau) hoặc truyền dọc (lây truyền tính
kháng thuốc giữa các vi khuẩn cùng loài). Sử dụng một thuốc hóa học điều trị
nào điều trị E. coli trong một thời gian dài dẫn đến khả năng kháng không chỉ
thuốc đó mà còn kháng cả thuốc khác [4], [7]
1.1.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn E. coli
Vật liệu di truyền của vi khuẩn E. coli là ADN. Có hai loại ADN là
ADN nhiễm sắc thể và ADN ngoài nhiễm sắc thể. ADN nhiễm sắc thể là một
phân tử ADN xoắn kép dạng vòng tạo nên nhiễm sắc thể duy nhất. ADN
ngoài nhiễm sắc thể hay còn gọi là plasmid.
Plasmid cũng là ADN hai sợi xoắn kép dạng vòng, chúng chứa nhiều
gen mã hóa cho nhiều đặc tính không thiết yếu cho sự sống của tế bào nhưng
có thể giúp cho E. coli tồn tại dưới áp lực của chọn lọc. Nhờ plasmid mà
chúng có thể vận chuyển yếu tố di truyền cho tế bào khác qua các cơ chế: biến
nạp, tải nạp và tiếp hợp.
1.2. Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli
1.2.1. Hiểu biết về thuốc kháng sinh
1.2.1.1. Định nghĩa [3], [8]
Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của
nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh.

Năm 1938, Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị.
Năm 1942, Waksman (là người phát hiện ra streptomycin và được giải
Nobel) đã định nghĩa:

7


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

“Một chất kháng sinh hay một hợp chất có tính kháng sinh là một chất
do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc thậm chí
tiêu diệt các vi khuẩn khác”.
Năm 1950, Baron bổ sung và giới hạn định nghĩa như sau: “Kháng
sinh là những chất được tạo ra bởi những cơ thể sống, có khả năng ức chế sự
phát triển hay sự tồn tại của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”.
Ngày nay, kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh vật mà
còn được tạo ra bằng quá tình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó
định nghĩa về kháng sinh cũng được thay đổi, hiện nay kháng sinh được định
nghĩa như sau: “Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán
tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều lượng thấp có tác dụng kìm hãm
hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh”.
2.2.1.2. Cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh
 Kháng sinh ức chế tổng hợp màng vách tế bào vi khuẩn
Chất kháng sinh ức chế tổng hợp mucopeptid ở vách thế bào vi khuẩn.
Thuộc nhóm này gồm có các beta-lactam, Cephalosporin… Penicillin
và các dẫn xuất beta-lactam có cấu trúc giống như chuỗi peptid do vi khuẩn
tổng hợp nên để tạo màng tế bào. Do vậy, khi tổng hợp màng tế bào, vi khuẩn
tạo phức nhầm với các chất đó, phức hợp này bền vững và không hồi phục.

Phản ứng xuyên mạch tạo màng bị cản trở.
Một số kháng sinh lại có tác dụng vào việc vận chuyển, trùng hợp
mucopeptid. Chúng có tác dụng phá hoại chức năng màng nguyên sinh của tế
bào vi khuẩn. Thuộc nhóm này có 30 chất, trong đó có: Polymicin B, Colistin,
Bacitracin, Anbomycin, Vancomycin, Ristomycin.
 Kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn
Kháng sinh làm tổng hợp protein bất thường: Đại diện nhóm này là
Streptomycin, tác dụng gây ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức
ribosome. Thuốc gắn vào tiểu phần 30S của ribosom. Qua đó làm đọc sai mã
8


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

di truyền, dẫn đến việc tổng hợp tích lũy những polypeptide sai lạc. Thuốc có
tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn.
Kháng sinh phong bế tổng hợp protein: Đại diện nhóm này là
Chloramphenicol, thuốc gắn với tiểu phần 50S, 70S của ribosom trong tế bào,
ngăn cản mạch peptid kéo dài. Chlophenicol làm quá trình tổng protein của vi
khuẩn bị đình trệ ngay. Các thuốc thuộc nhóm Tetracycline lại gây ức chế quá
trình tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào phần 30S của ribosom
nên ức chế gắn aminoacyl – ARNt mới vào vị trí tiếp nhận trên phức hợp
ARNm-ribosom gây gián đoạn quá trình tỏng hợp chuỗi peptid.
 Thay đổi tính thấm của màng tế bào
Màng có tính thấm chọn lọc đối với các ion để duy trì sự ổn định cho
các thành phần bên trong màng. Các kháng sinh tác động lên màng, làm thay
đổi tính thấm của màng, gây rối loạn quá trình trao đổi chất giữa tế bào vi
khuẩn với môi trường làm vi khuẩn bị tiêu diệt.

 Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp axit folic)
Axit folic cần cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn.Các kháng sinh
kháng chuyển hóa có khả năng ức cạnh tranh với enzyme làm nhiệm vụ tổng
hợp và chuyển hóa axit folic. Kết quả là quá trình tổng hợp và chuyển hóa
axit folic bị ngưng làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt
1.2.1.3. Phân loại thuốc kháng sinh
Có nhiều cách phân loại thuốc kháng sinh như: Phân loại theo nguồn
gốc, phân loại theo hoạt phổ kháng sinh, phân loại theo mức độ tác dụng,
phân loại theo cơ chế tác dụng, phân loại theo cấu trúc hóa học,…Tuy nhiên
phân loại theo cấu trúc hóa học là cách phân loại thông dụng nhất vì hoạt phổ
kháng sinh, mức độ tác dụng, cơ chế tác dụng và cấu trúc hóa học luôn liên
quan chặt chẽ với nhau [2]. Với cơ sở này, người ta phân loại thuốc kháng
sinh thành các nhóm sau:
1. Kháng sinh Beta-lactam
9


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

2. Kháng sinh Aminoglycosid
3. Kháng sinh Tetracyclin
4. Cloramphenicol và dẫn chất
5. Kháng sinh Macrolid
6. Kháng sinh Lincosamid
7. Các kháng sinh khác: Rifamycin
+ Kháng sinh nhóm beta-lactam [8]
 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta - lactam
Tất cả các kháng sinh nhóm beta-lactam đều có vòng beta-lactam trong

cấu trúc phân tử. Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hoá học 4 cạnh
gồm 3 nguyên tử C và một nguyên tử N

Hình 1.2. Cấu trúc của vòng beta-lactam
 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta-lactam
Vi khuẩn tổng hợp vách tế bào cần enzyme transpeptidase, xúc tác tạo các
liên kết chéo trong hệ thống peptidoglycans cấu tạo vách tế bào. Kháng sinh
nhóm beta-lactam gắn được vào vị trí hoạt động của transpetidase này nên ức
chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, từ đó vi khuẩn dễ dàng bị tiêu
diệt.
 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam
10


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

Gồm 2 phân nhóm chính: penicillins và cephalosporins [8]
+ Cephalosporin
Lịch sử, cấu tạo
Năm 1948, Abraham và cộng sự phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporinum aeremonium thu được cephalosporin có hoạt tính kháng
khuẩn yếu nên không được dùng trong điều trị. Các cephalosporin hiện đang
dùng là các chất bán tổng hợp từ 7-amino-cephalosporin. Cấu trúc vòng
7ACA cũng dễ bị cephalosporinase phá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn.
Cấu trúc chung của kháng sinh cephalosporin gồm 2 vòng: vòng betalactam 4 cạnh gắn với một dị vòng 6 cạnh. Khi thay đổi các gốc R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.

Hình 1.3. Cấu trúc chung của cephalosporin

- Tính chất hóa học
Vòng beta-lactam trong các cephalosporin kém bền do cộng hưởng enamin không tồn tại. So với penicillin thì các cephalosporin bền với axit hơn.
-Tính kháng thuốc
Do vi khuẩn sinh ra enzyme beta-lactamase có tác dụng mở vòng betalactam làm kháng sinh mất tác dụng
Còn các cách kháng không sinh ra enzyme beta-lactamase để thực hiện
gọi là cách kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin)
Hiện nay có 5 thế hệ cephalosporin

11


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

Bảng 1.1. Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin
Cefazolin,
Thế hệ 1

Cefaloridine,

Cephalothin,
Cefalotin,

Cephalexin,

Cefadroxil,

Cefapirin,

Cefazedone,

Ceftezole…
Thế hệ 2

Cefuroxime, Cefaclor, Cefamandole, Cefamycins
Cefoxime,

Ceftriaxone,

Cefpodoxime,

cefodizime,

Thế hệ 3

Ceftizoxime, Ceftazidime…

Thế hệ 4

Cefepime, Cefpirome, Cefquinome, Cefozopran

Thế hệ 5

Cefbiprole, Ceftaroline fosamil

Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, nhóm nghiên cứu tập trung
nghiên cứu phát hiện gen và phân tích mức độ tương đồng gen kháng
Cephalosporin là nhóm kháng sinh được sử dụng để điều trị bệnh do vi khuẩn
E. coli gây ra

1.2.2. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn
1.2.2.1. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
Kháng thuốc kháng sinh là nói đến khả năng của vi khuẩn chống lại
hiệu quả của thuốc kháng sinh. Kháng thuốc xảy ra khi vi khuẩn thay đổi theo
một cách mới để làm giảm hoặc loại bỏ hiệu quả của thuốc chữa bệnh. Một
khi kháng thuốc, vi khuẩn không chết mà vẫn tồn tại và tiếp tục nhân lên, gây
ra nhiều tác hại khác.
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), một vi khuẩn của một loài nhất định
được gọi là đề kháng với thuốc nếu nó có thể sống tồn tại và phát triển được
trong môi trường có nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ ức chế sinh trưởng
và phát triển của phần lớn những cá thể khác hoặc những loài khác trong cùng
một canh khuẩn [5]
1.2.2.2. Phân loại hiện tượng kháng thuốc
12


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

 Đề kháng tự nhiên
Các gen đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn. Đề kháng tự
nhiên là đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài và được biết ngay
từ lúc đầu khi nghiên cứu xác định hoạt tính của kháng sinh, xác định phổ tác
dụng của thuốc kháng sinh.
Nguyên nhân do kháng sinh không thể tiếp cận được đích hoặc có ái
lực yếu với đích. Ví dụ: các Pseudomonas kháng kháng sinh nhóm
Macrolides, hoặc vi khuẩn Gram âm kháng Vancomycine đều là tự nhiên.
Đây là sự đề kháng thường xuyên và có nguồn gốc nhiễm sắc thể, ổn định và
di truyền lại cho các thế hệ con cháu (truyền dọc) khi phân chia tế bào, nhưng

không truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác (truyền ngang).
 Đề kháng thu được
Đề kháng thu được là khả năng đề kháng một hay nhiều kháng sinh do
biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng.
Những đề kháng thu được có thể là do:
- Đột biến trên NST: qua các thử nghiệm sao chép đĩa của Lederberg
(1952) có thể giải thích được vi khuẩn đề kháng thuốc là do đột biến.
- Nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền như:
tiếp hợp khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau, biến nạp khi vi khuẩn bị
ly giải và giải phóng ra ADN tự do hoặc tải nạp nhờ phage hoặc do một thành
phần di truyền di động (transposons).
Cơ chế sinh hóa của sự đề kháng thu được
- Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương
- Làm thay đổi đích tác động
- Làm cho kháng sinh thoát ra ngoài màng tế bào vi khuẩn quá mức
- Tạo ra các enzyme ức chế tác động của kháng sinh:

Cơ sở di truyền học của đề kháng thu được
 Đề kháng thu được do đột biến trên NST
13


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

Đột biến thường xảy ra ở giai đoạn sao chép các bazơ purin và
pyrimidin trong quá trình tổng hợp của ADN, các ADN mới được tổng hợp sẽ
không còn giống với phiên bản của ADN thế hệ trước
 Đề kháng thu được do nhận được gen đề kháng qua các hình thức

vận chuyển di truyền
Biến nạp
Là hiện tượng một phần nhỏ ADN tự do của vi khuẩn cho vào được tế
bào vi khuẩn nhận, gắn vào bộ gen của vi khuẩn nhận, quyết định tính chất
mới của vi khuẩn này và tính chất này có thể di truyền
Tải nạp
Là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua một
phage ôn hòa làm trung gian, phage này gọi là phage tải nạp
Tiếp hợp
Là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác khi có sự
tiếp xúc trực tiếp của vi khuẩn cho (được gọi là vi khuẩn đực) và vi khuẩn
nhận (được gọi là vi khuẩn cái). Để có thể tiếp hợp được vi khuẩn cho phải có
pili giới tính và toàn bộ hay một phần vật liệu di truyền sẽ được chuyển từ vi
khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua cầu nối pili đó

14


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

Hình 1.4. Sự lan truyền gen kháng thuốc bằng hình thức thông qua các
R-plasmid (ảnh nguồn internet)
Thành phần di truyền động
Là một thành phần của một đơn vị sao chép hoặc là plasmid, nhiễm
sắc thể hoặc là phage nhờ hai chuỗi tận cùng ở hai đầu để chuyển vị trí từ
một phân tử ADN này sang một phân tử ADN khác không cần có sự đồng
dạng của hai phân tử ADN (nó có thể chuyển từ plasmid này sang plasmid
khác, hay từ plasmid vào NST hoặc genome của một phage tải nạp)

15


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

.
Hình 1.5. Đề kháng thu được do nhận được gen nằm trên Integron
(ảnh nguồn internet)
1.2.3. Enzyme beta-lactamase
Năm 1929 chất kháng kháng sinh đầu tiên được phát hiện là penicillin
từ loài nấm Penicillium bởi Alexander Fleming, đây cũng chính là kháng sinh
đầu tiên của nhóm beta-lactam. Tuy vậy đến năm 1944 lần đầu tiên xuất hiện
S. aureus kháng penicillin do sinh enzyme penicilinase. Sau đó vào những
năm 1948 đến năm 1956 các cephalosporin thế hệ đầu tiên được nghiên cứu
và đưa vào sử dụng gọi là cephalosporin thế hệ 1. [11]
Năm 1961 thế hệ penicillin phổ rộng đầu tiên là ampicillin được ra đời
có tác dụng điều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cầu khuẩn Gram dương.
Chỉ vài năm sau, vào năm 1963 tại Athens Hy lạp từ máu một bệnh nhân tên
là Temoneria người ta phân lập được chủng E. coli kháng ampicillin có sinh

16


Luận văn thạc sĩ sinh học

Trần Xuân Bách

loại enzyme beta-lactamase và lấy luôn tên bệnh nhân đặt tên cho enzyme này
là TEM-1 [24], [42]
Năm 1965, người ta phát hiện ra TEM-2 là do TEM-1 biến đổi một axit
amin. Nhờ TEM-1 và TEM-2 đã làm cho vi khuẩn Gram âm kháng lại các
penicillins, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1 trong một thời gian dài sau
đó, như các thông báo về N. gonorrhoeae kháng pencicllin, H. influenzae và
Shigella spp đề kháng kháng sinh vào những năm 1971 – 1973 ở Châu Á và
nhiêu nơi trên thế giới. [24], [42]
Cho đến năm 1974 chủng K. pneumoniae có gen mã hóa enzyme
lactamase trên plasmid được phát hiện, enzyme này có nhiều thay đổi về axit
amin so với TEM-1 và TEM-2 nên đặt là SHV-1 (Sulphyrul Variable). Như
vậy vi khuẩn đã có TEM-1, TEM-2 và SHV1 nên các penicillins,
cephalosporins thế hệ 1 đã bị kháng lại rất nhiều [42]
Đầu những năm 1980 thì các kháng sinh bate-lactam phổ rộng như
cephalosporin thế hệ 2, thế hệ 3 và monobactams được đưa vào điều trị các vi
khuẩn kháng thuốc. Sự ra đời các kháng sinh beta-lactam mới này đặc biệt là
cephalosporins thế hệ 3 đã là thành công của các nhà khoa học trong cuộc
chiến đấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh có TEM-1, TEM-2, SHV-1. Nhưng
rồi có một loại enzyme beta-lactamase có khả năng phân hủy cephalosporins
thế hệ 2, cephalosporins thế hệ 3 và monobactams có nguồn gốc do TEM-1,
TEM-2, SHV-1 đột biến thay đổi một số axit amin gọi là ESBL đã xuất hiện
[42].
Năm 1983, ở Đức đã phát hiện chủng K. ozaenae sinh enzyme betalactamase phân hủy cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là trường hợp sinh
ESBL đầu tiên được ghi nhận. Năm 1984 đến 1987 tại Pháp đã phát hiện
chủng K. pneumoniae có gen mã hóa ESBL trên plasmid kháng cefotaxime
đặt tên là CTX-1. Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản Masumato và năm
1989 ở Đức, Bauernfein phát hiện E. coli sinh ESBL kháng cefotaxime không
17