Nghiên cứu biến nạp gen dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
---------------------

LÊ THỊ LÝ

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN DOF1 VÀO MÔ SẸO
PHÔI HÓA GIỐNG SẮN TMS 60444 THÔNG QUA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn:

PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

Hà Nội, 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
---------------------

LÊ THỊ LÝ

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN DOF1 VÀO MÔ SẸO
PHÔI HÓA GIỐNG SẮN TMS 60444 THÔNG QUA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn:

PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hà Nội, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy ở
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời
gian học tập tại Viện.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng người thầy

đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học
và thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên
làm việc tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp
đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua.
Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ
thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ
theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT. Tôi xin chân thành biết ơn sự hỗ trợ đó.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên

Lê Thị Lý

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................11
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................13
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn ...............................................................................13
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây sắn .................................................................13
1.1.2. Vai trò của cây sắn ......................................................................................14
1.1.2.1. Vai trò của cây sắn đối với thế giới ............................................14

1.1.2.2. Vai trò của cây sắn đối với Việt Nam.........................................19
1.1.3. Giống sắn TMS 60444 .................................................................................21
1.2. Yếu tố phiên mã .................................................................................................21
1.2.1. Ứng dụng của yếu tố phiên mã trong chọn giống phân tử..........................21
1.2.2. Yếu tố phiên mã Dof1 .................................................................................23
1.3. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens ..............................................26
1.3.1. Cơ sở khoa học của phương pháp ...............................................................26
1.3.2. Đặc điểm cấu trúc của vi khuẩn Agrobacterium ........................................27
1.4. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở sắn ............................................................33
1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn trên thế giới ....................................33
1.4.2. Tình hình chuyển gen sắn ở Việt Nam .......................................................36
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................39
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................39
2.1.1. Mẫu thực vật ...............................................................................................39
2.1.2. Vi khuẩn và các vector................................................................................39
2.1.3. Môi trường nghiên cứu ...............................................................................41

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................42
2.2.1. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa .................................................42
2.2.2. Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa.............................44
2.2.2.1. Chuẩn bị dung dịch khuẩn và biến nạp.......................................44
2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime đến khả năng loại
khuẩn thừa và tái sinh cây từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp............................45
2.2.2.3. Nghiên cứu nồng độ chất chọn lọc thực vật hygromycin thích hợp

để chọn lọc mô được chuyển gen .....................................................................45
2.2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi
hóa sau biến nạp và chọn lọc cây chuyển gen ..................................................46
2.2.2.5. Phương pháp xác định sự có mặt của gen Dof1 trong cây sau chuyển
gen.....................................................................................................................46
2.2.3. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 trong điều
kiện nhà lưới .........................................................................................................48
2.2.3.1. Phương pháp đưa cây ra đất và chăm sóc cây trong nhà lưới ....48
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính nông sinh học của cây sắn
trồng ngoài đồng ruộng ....................................................................................48
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................49
3.1. Kết quả tạo mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 ..........................................49
3.2. Kết quả chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444................................52
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen
Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444 ...................................................................53
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng tiếp
nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444 ....................................................55
3.2.3. Kết quả nghiên cứu hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của
nó đến khả năng sống sót và tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen ......................57

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3.2.4. Kết quả khảo sát hiệu quả gây chết của chất chọn lọc hygromycin ...........60
3.2.5. Kết quả chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen sau biến nạp .........................62
3.2.6. Kết quả sàng lọc và phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong
cây sau chuyển gen ...............................................................................................65

3.3. Kết quả đưa cây ra vườn ươm và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây
chuyển gen Dof1 .......................................................................................................70
3.3.1. Kết quả đưa cây ra vườn ươm.....................................................................70
3.3.2. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 thế
hệ T0 sau 3 tháng trồng ra vườn ươm ...................................................................72
3.3.3. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 thế
hệ T0 sau 6 tháng trồng ra nhà lưới. ......................................................................74
KẾT LUẬN ...............................................................................................................78
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................78
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................80

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Thành phần hóa học của sắn và các sản phẩm sơ chế từ sắn so với các loại
lương thực khác [12] .................................................................................................17
Bảng 2: Năng lượng cung cấp trực tiếp cho con người ở vùng nhiệt đới [12]. ........18
Bảng 3: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn ...........................................43
Bảng 4: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng mồi Dof1 F3/ Dof1 R3 ....47
Bảng 5: Kết quả tạo FEC từ chồi nách và thùy lá non cây sắn TMS 60444 in vitro ...49
Bảng 6: Hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của nó đến tỉ lệ sống sót
và khả năng tái sinh của FEC giống sắn TMS 60444 (sau 8 tuần) ............................58
Bảng 7: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường chứa hygromycin .........63
Bảng 8: Kết quả đưa cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 ra nhà lưới sau 1 tháng..........71
Bảng 9: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau 3

tháng trồng trong nhà lưới .........................................................................................72
Bảng 10: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau 6
tháng so với đối chứng trong điều kiện nhà lưới ......................................................75

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Hình thái cây sắn [58]. .................................................................................14
Hình 2: Hoạt động của yếu tố phiên mã (TF) ............................................................22
Hình 3: Biểu hiện Dof1 tăng sự biểu hiện của các gen PEPC, PK, CS và ICDH trong
cây Arabidopsis chuyển gen Dof1. ...........................................................................24
Hình 4: Cấu tạo vi khuẩn A. tumefaciens [4] ............................................................27
Hình 5: Cấu trúc và sự biểu hiện của Ti-plasmid kiểu octopine và kiểu nopaline. ..28
Hình 6: Sơ đồ cấu trúc của Ti-plasmid [90]. .............................................................30
Hình 7: Cơ chế biến nạp của Agrobacterium vào tế bào thực vật [95]. ....................32
Hình 8: Sơ đồ khái quát các hệ thống đang được sử dụng để tạo cây sắn chuyển gen
[68] ............................................................................................................................35
Hình 9: Cây sắn TMS 60444 in vitro 1 tháng tuổi ....................................................39
Hình 10: Sơ đồ vector pCAMBIA 1303 [75]............................................................40
Hình 11: Sơ đồ vector pCAMBIA Dof1 [75]............................................................40
Hình 12: Cụm mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 ............................................44
Hình 13: Cụm mô sẹo giống sắn TMS 60444 hình thành và phát triển trên các môi
trường từ các nguồn vật liệu khác nhau. ...................................................................51
Hình 14: Các khối FEC của TMS 60444 hình thành và phát triển trên môi trường
MMS..........................................................................................................................52

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hình 15: Ảnh hưởng của các mật độ dịch khuẩn khác nhau đến khả năng tiếp nhận
gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444 .................................................................54
Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen Dof1
của FEC giống sắn TMS 60444 .................................................................................56
Hình 17: Hiệu quả gây chết của hygromycin lên FEC của giống sắn TMS 60444 sau
8 tuần .........................................................................................................................60
Hình 18: Các cụm FEC trong môi trường MMS bổ sung hygromycin ở các nồng độ
khác nhau sau 8 tuần chọn lọc...................................................................................62
Hình 19: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường tái sinh (MSN) chứa
hygromycin qua các giai đoạn khác nhau. ................................................................64
Hình 20: Kết quả kiểm tra sự ra rễ của cây chuyển gen Dof1 trên môi trường chứa
kháng sinh hygromycin .............................................................................................66
Hình 21: Kết quả điện di DNA tổng số kiểm tra cây chuyển gen Dof1 ...................67
Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HPT trong các
cây chuyển gen ..........................................................................................................68
Hình 23: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong các
cây chuyển gen. .........................................................................................................69
Hình 24: Kết quả đưa cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng ra đất sau 1 tháng. ..71
Hình 25: Cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 3 tháng trồng trong
nhà lưới......................................................................................................................73
Hình 26: Các cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 6 tháng trồng
trong nhà lưới. ...........................................................................................................77
Hình 27: Một số hình ảnh về sự phân chạc của cây đối chứng .................................77

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu/viết
tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AS

Acetosyringone

BAP

6-Benzyl amino purin

CTAB

Bromide
cetyltrimethylammonium

Cs

DNA

Cộng sự
Deoxiribonucleic Acid

ĐC

Đối chứng

FEC

Friable Embryogenic Callus

Mô sẹo phôi hóa

FAO

Food and Agriculture
Organization of the United
Nations

Tổ chức nông lương Thế
giới

NAA

Napthanele acetic acid

OD

Optical Density

Picloram

4-Amino-3,5,6-trichloro-2pyridinecarboxylic

Mật độ quang

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Phương pháp

PP
TF

Transcription factor

Yếu tố phiên mã

w/v

Weight per volume

Khối lượng trên thể tích

MỞ ĐẦU

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lương thực có củ chứa tinh bột quan trọng
ở nhiều vùng nhiệt đới có nguồn gốc từ châu Mỹ La-tinh và được du nhập vào Việt
Nam khoảng giữa thế kỷ 18. Trải qua thời gian dài phát triển, cây sắn đã dần khẳng
định được vị thế của mình, trở thành cây lương thực và cây hàng hóa quan trọng,
được coi là cây “xóa đói giảm nghèo”. Trong 30 năm qua, diện tích trồng sắn đã tăng
nhanh hơn bất kỳ cây lương thực quan trọng nào khác [7], [38].
Quá trình chuyển dịch nền kinh tế theo hướng sản xuất hàng hóa làm cho vai
trò cây sắn dần dần thay đổi. Sắn không chỉ là cây lương thực quan trọng góp phần
ổn định nhu cầu lương thực của con người và giải quyết vấn đề an ninh lương thực
trên thế giới, cây sắn còn là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các ngành công nghiệp
khác: dược phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu sinh học và công nghiệp thực phẩm…
Đặc biệt sắn là một nguồn nguyên liệu chính trong ngành công nghiệp sản xuất mì
chính do có hàm lượng tinh bột cao. Tuy nhiên, sắn có hàm lượng protein và axit
amin thấp do vậy trong quá trình chế biến sản xuất mì chính phải mất nhiều nguyên
liệu cũng như thời gian lên men, làm giảm sức cạnh tranh của sắn với các nguồn
nguyên liệu khác và tăng giá thành sản phẩm. Vì vậy, để tăng sức cạnh tranh của sắn
với các nguồn nguyên liệu khác trong sản xuất mì chính thì đòi hỏi phải có một giống
sắn mới có năng suất cao, chất lượng tốt, hàm lượng axit amin cao.
Một trong những giải pháp phát triển sắn bền vững là áp dụng giống mới và kỹ
thuật canh tác sắn bền vững để đạt năng suất lợi nhuận cao và duy trì độ phì nhiêu
của đất mà không mở rộng diện tích trồng sắn. Không giống như nhiều loại cây trồng

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




chính trên thế giới, mặc dù cây sắn dễ nhân giống vô tính bằng giâm cành nhưng rất
khó khăn trong nhân giống hữu tính. Do tính dị hợp gen cao, ít hoa, khả năng thụ

phấn và tỷ lệ đậu trái thấp, tự không tương thích và phân ly tính trạng cao trong thế
hệ con cháu làm cho việc tạo giống truyền thống của sắn bị cản trở nghiêm trọng [22].
Chọn tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong các
phương pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo nói trên. Tuy
nhiên đột biến là vô hướng vì vậy không phải lúc nào cũng thu được cá thể mang
những tính trạng mong muốn. Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen là một trong các
phương pháp hiệu quả nhất tạo ra giống sắn mới có năng suất, chất lượng tốt, có hàm
lượng tinh bột và axit amin cao do có khả năng tích hợp các tính trạng mong muốn
từ những nguồn gốc khác nhau không bị giới hạn về kiểu gen. Trên thế giới đã có khá
nhiều công trình chuyển gen vào sắn thành công với các gen tăng cường hàm lượng
các chất và chống chịu sâu bệnh: tăng hàm lượng tinh bột, tăng hàm lượng vitamin A
[39], [74]. Đặc biệt, mô sẹo phôi hóa (FEC – Friable embryo callus) được coi là vật
liệu thích hợp nhất cho chuyển gen hiệu quả ở sắn [50]. Nhưng chưa có công trình
nào nghiên cứu chuyển gen gia tăng hàm lượng axit min ở sắn.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn ở trên, chúng tôi đã lựa chọn giống sắn TMS
60444 là giống sắn đã được các Viện nghiên cứu ở Thụy Sĩ và Hoa Kỳ đánh giá là
giống sắn dễ tạo mô sẹo phôi hóa nhất và đã được chuyển gen thành công [69], [87]
để thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biến nạp gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống
sắn TMS 60444 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, với mục đích
tạo giống sắn TMS 60444 mang gen Dof1 bằng kỹ thuật chuyển gen thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về
khả năng biến nạp gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa của giống sắn TMS 60444.
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài là cơ sở ứng dụng để chuyển gen Dof1
vào cây sắn (M. esculenta Crantz) nhằm tạo ra giống sắn mới có hàm lượng axit amin
cao cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất mì chính.

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào thực
vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ
thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ
theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây sắn
Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) (hình 1) thuộc chi Manihot, họ
Euphorbiaceae sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác
nhau trên thế giới [18]. Sắn được phân bố phổ biến từ 33° vĩ bắc đến 33° vĩ nam. Sắn
được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa lý nơi chúng được
trồng. Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yuca (theo tiếng Tây Ban Nha) hoặc mandioca
(tiếng Bồ Đào Nha), trong khi tại Brazin, chúng được chia thành 2 loại, sắn ngọt
(sweet cassava) hay sắn đắng (bitter cassava) theo người trồng [22].

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hình 1: Hình thái cây sắn [58].

Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định rằng sắn có nguồn gốc ở
vùng nhiệt đới của châu Mỹ La-Tinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người

trồng cách đây 5000 năm. Trung tâm phát sinh sắn ở Đông Bắc Brazin và một trung
tâm khác ở Trung Mỹ và Mexico. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ
sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela,
và khoảng 2000 năm trước Công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những
lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được
tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900-200
trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một
số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại
cây nông nghiệp từ rất lâu đời [62].
Sắn được người Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi lần đầu tiên vào giữa thế kỷ 16.
Trải qua thế kỷ 17 phát triển chậm chạp, sắn được du nhập vào đảo Bourbon và Ilede
(Pháp) vào các năm 1738-1739, và đưa sang Madagasca vào năm 1875, Xri lanca
(1786), Calcutta (1794) và một số nước phía đông châu Phi như Zambiar (1799),
Uganda (1878). Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17, Việt Nam
và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ 18 [9].
Tóm lại, còn có những điều không chắc chắn về vấn đề trung tâm phát sinh
cây sắn. Các công trình nghiên cứu gần đây của nhiều tác giả kết luận rằng: Cây sắn
có nguồn gốc phức tạp và có 4 trung tâm phát sinh chính đó là ở Braxin có 2 trung
tâm còn lại là ở Mêxicô và Bolivia và được trồng cách đây khoảng 3000-7000 năm
[12].
1.1.2. Vai trò của cây sắn
1.1.2.1. Vai trò của cây sắn đối với thế giới
Sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất
thế giới bên cạnh gạo và ngô [42], có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt. Sắn là nguồn
lương thực đáng kể cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

nguyên liệu cho công nghiệp. Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào
các mục đích kinh tế [12]. Khoảng 600 triệu người tại châu Á, châu Phi và Mỹ La
tinh có cuộc sống phụ thuộc vào cây sắn và hơn 80 quốc gia có khả năng phát triển
ngành công nghiệp từ sắn. Cây sắn được coi là cây lương thực xóa đói giảm nghèo
quan trọng do là cây trồng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng và có khả năng
chịu hạn cao [17].
Hầu hết các bộ phận của sắn (củ, thân, lá) đều được dùng để chế biến ra nhiều
loại sản phẩm phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp như: Dược, dệt, hoá dầu thực
phẩm, chăn nuôi… Ngày nay giá trị của cây sắn ngày càng được nâng cao nhờ những
ứng dụng rộng rãi của nó. Trong ngành dược, tinh bột sắn được sử dụng làm tá dược
trong sản xuất thuốc, nhiều sản phẩm biến tính tinh bột sắn có giá trị như đường
gluccose, fructose…được dùng làm dịch truyền hoặc các phụ gia cho các sản phẩm
khác. Tinh bột sắn còn được dùng làm thức ăn cho người, để làm hồ vải và đặc biệt
trong ngành công nghiệp chế biến thức ăn cho nghề nuôi trồng thuỷ sản tinh bột sắn
là thành phần không thể thiếu được do nó có độ dẻo cao và không bị tan trong nước.
Gần 300 loại sản phẩm khác nhau có thể được chế biến từ tinh bột sắn. Lá sắn có
chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị, khá đầy đủ các axit amin cần thiết. Giá trị chủ
yếu của lá sắn là dùng để chế biến thức ăn gia súc hoặc dùng để nuôi tằm sắn rất tốt,
do chứa nhiều axit amin và một số chất dinh dưỡng [6]. Các công trình nghiên cứu
gần đây về sử dụng lá sắn ủ chua cho chăn nuôi lợn là hướng đi có nhiều triển vọng
tốt đang được nông dân ở tỉnh Thừa Thiên Huế và một số địa phương áp dụng [12].
Thân sắn được dùng để chế biến cồn, làm giấy, ván ép, chất đốt hoặc làm giá thể
trồng nấm …
Thành phần hoá học (Bảng 1) chính của củ sắn là gluxit, ở sắn củ tươi có tỷ lệ
các chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt là canxi. Tuy nhiên, sắn có tỷ lệ protein
và lipit thấp. Chính vì vậy, cần thiết phải tạo ra một giống sắn mới có hàm lượng
protein cao hơn các giống sắn hiện có.

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Bảng 1: Thành phần hóa học của sắn và các sản phẩm sơ chế từ sắn so với các loại lương thực khác [12]
Thành phần hóa học (%)

Loại lương
thực

Gluxit

Protein

lipid

Gạo tẻ

76,2

7,6

1,0

Ngô hạt khô

69,4

8,6

Ngô mảnh

71,8

Khoai lang tươi

Muối khoáng (mg%)

Vitamin (mg%)

Calo*
Ca

P

Fe

Caroten

B1

B1

PP

353

30,0

104,0

1,3

-

0,12

0,04

1,9

4,7

364

30,0

190,0

2,3

0,4

0,28

0,11

2,0

8,5

3,2

359

-

-

-

-

-

-

-

28,5

0,8

0,2

122

34,0

49,4

1,0

0,3

0,05

0,05

0,6

Khoai lang khô

80,0

2,2

0,5

342

-

-

-

-

0,09

-

-

Khoai tây tươi

21,0

2,0

Vết

94

10,0

50,0

1,2

Vết

0,10

0,05

0,9

Khoai tây khô

75,1

6,6

0,3

338

37,0

180,0

4,3

-

-

-

-

Mỳ loại I

72,9

1V0

1,1

354

29,0

132,0

2,0

-

0,18

0,13

1,0

Sắn củ tươi

36,4

1,1

0,2

156

25,0

30,0

1,2

-

0,03

0,03

0,6

Sắn củ khô

80,3

3,0

0,7

348

-

-

-

-

-

-

-

* Calo/100 gr

17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Sắn là cây trồng đứng vị trí thứ tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho
con người (bảng 2).
Bảng 2: Năng lượng cung cấp trực tiếp cho con người ở vùng nhiệt đới [12].
Nguồn năng lượng

Các nước nhiệt đới
(tỷ kcal/ngày)

Thế giới (tỷ kcal/ngày)

Lúa gạo

924

2043

Đường

311

926

Ngô

307

600

Sắn

172

178

Cao lương

147

208

Kê

128

204

Lúa mỳ

<100

1877

Khoai tây

54

434

Chuối

32

44

Hội nghị Sắn Toàn cầu tổ chức tại Bỉ năm 2008 đã đưa ra thông điệp: “Cây sắn
là quà tặng của thế giới, cơ hội cho nông dân nghèo và thách thức đối với các nhà
khoa học” [29]. Do có hàm lượng tinh bột cao, cây sắn không chỉ là cây lương thực
mà còn là cây trồng nhiên liệu sinh học tiềm năng [26] tại một số quốc gia châu Á.
Năm 2006, sản lượng ethanol toàn thế giới đạt khoảng 50 tỷ lít [87]. Từ 2008, sản

lượng sản xuất ethanol của Trung Quốc đã đạt 1 triệu tấn và đang tiếp tục tăng lên.
Trung Quốc trở thành nước nhập khẩu nguyên liệu sắn để sản xuất ethanol từ các
quốc gia lân cận như Thái lan, Việt Nam, Campuchia và Indonesia. Tại Thái Lan và
Việt Nam, nhiều nhà máy sản xuất ethanol sử dụng sắn đã được xây dựng trong giai
đoạn từ 2008-2012. Indonesia, Philippine đã lên kế hoạch sử dụng sắn sản xuất
ethanol để pha vào xăng theo tỷ lệ bắt buộc 5% bắt đầu từ năm 2010. Các nước như

18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Lào, Papua New Guinea, đảo quốc Fiji, Nigeria, Colombia và Uganda cũng đang
nghiên cứu thử nghiệm cho sản xuất ethanol [93].
1.1.2.2. Vai trò của cây sắn đối với Việt Nam
Tại Việt Nam, cây sắn đang được trồng rất rộng rãi và là cây lương thực, thức
ăn gia súc quan trọng được xếp vào hàng thứ ba sau lúa, ngô và đang trong quá trình
chuyển đổi nhanh chóng từ cây lương thực truyền thống thành cây công nghiệp [3].
Hướng sử dụng nguyên liệu sắn để chế biến tinh bột, cồn sinh học, tinh bột biến tính,
thức ăn gia súc và màng phủ sinh học đang ngày càng được quan tâm.
Năm 2014, tổng diện tích sắn trên cả nước đạt khoảng 551,1 nghìn ha tăng 7
nghìn ha, sản lượng đạt 10,225 triệu tấn, tăng 468 nghìn tấn so với năm 2013, so với
cây ngô diện tích ngô đạt khoảng 1,18 triệu ha, tăng 7 nghìn ha và sản lượng khoảng
5,19 triệu tấn, tăng 500 tấn và so với cây lúa tổng diện tích gieo trồng lúa mùa cả
nước đạt xấp xỉ 1,96 triệu ha, năng suất bình quân đạt 49 tạ/ha, sản lượng đạt 9,61
triệu tấn [11]. Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do
sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ.
Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến
thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi [12].

Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam tầm nhìn
đến năm 2020. Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô và coi
trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển.
Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự báo thuận lợi và có lợi thế
cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và
những sản phẩm tinh bột biến tính. Diện tích sắn của Việt Nam dự kiến ổn định
khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo
và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây
dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh
thái [12].
Để thúc đẩy ngành sản xuất nhiên liệu sinh học phát triển, gần đây Việt Nam đã
phát triển chính sách E10 (xăng sinh học gồm 10% ethanol và 90% xăng thông thường)

19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




mà sẽ yêu cầu sản xuất từ 100 đến 150 triệu lít ethanol mỗi năm. Thủ tướng Chính phủ
đã phê duyệt "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm
2025", với mục đích sản xuất nhiên liệu sinh học để thay thế một phần nhiên liệu truyền
thống, góp phần bảo đảm an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường [91].
Sản xuất sắn của nước ta đang đứng trước những cơ hội và thách thức mới. Cây
sắn được xác định là cây cung cấp nguyên liệu chính cho sản xuất xăng sinh học tại
Việt Nam [92]. Cả nước hiện có 13 nhà máy nhiên liệu sinh học công suất 1067,7
triệu lít cồn sinh học mỗi năm, 66 nhà máy chế biến tinh bột sắn qui mô công nghiệp,
hơn 2000 cơ sở chế biến thủ công. Đầu tư nhà máy chế biến bioethanol là một hướng
lớn triển vọng. Hiện mỗi năm Việt Nam sản xuất khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn
tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước. Sắn lát và

tinh bột sắn Việt Nam hiện là một trong mười mặt hàng xuất khẩu chính. Thị trường
chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapo, Hàn Quốc [12], [36].
Năm 2015, trái ngược với tình trạng xuất khẩu sụt giảm mạnh của nhiều mặt
hàng nông sản khác như: cà phê, cao su và gạo, mặt hàng sắn và các sản phẩm từ sắn
lại tăng mạnh cả về số lượng và giá trị xuất khẩu. Cụ thể, khối lượng xuất khẩu sắn
và các sản phẩm từ sắn trong tháng 9 năm 2015 ước đạt 235 nghìn tấn, với giá trị đạt
84 triệu USD đưa tổng khối lượng xuất khẩu mặt hàng này 9 tháng đầu năm 2015 đạt
3,27 triệu tấn với giá trị 1,03 tỷ USD, tăng 28,4% về khối lượng và tăng 24,3% về giá
trị so với cùng kỳ năm 2014 [91]. Dự báo trong năm 2015 xuất khẩu sắn của Việt
Nam đạt 2 tỷ USD và là cây mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất ở Việt Nam do cần ít
vốn đầu tư [94].
Việt Nam hiện là nước đứng thứ 3 về xuất khẩu tinh bột sắn, chúng được trồng
ở khắp cả ba miền đất nước. Với đặc tính dễ trồng, sản lượng cao, đầu tư ít nên tinh
bột sắn tương đối rẻ so với các loại tinh bột khác. Ngoài ra, trong bột sắn chứa tới
83÷88% hàm lượng tinh bột. Vì vậy tinh bột sắn thích hợp làm nguyên liệu để sản
xuất ra các sản phẩm phục vụ cho công nghiệp thực phẩm đặc biệt là mì chính.
Không giống như những loại cây trồng khác, cải thiện di truyền sắn thông qua
lai hữu tính thường là một quá trình lâu dài và kém hấp dẫn do thiếu các gen kháng

20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




trong các giống sắn hiện có, dị bội, khả năng sinh sản thấp và ra hoa không đồng bộ.
Có nhiều giống sắn rất hiếm khi ra hoa và khả năng tạo hạt thấp. Trên đồng ruộng
sắn thường được nhân giống bằng cách giâm hom. Phương pháp nhân giống này là
lý tưởng cho sự tiếp cận phân tử để cải thiện cây trồng hạn chế sự phân ly gen thông
qua thụ phấn chéo. Vì vậy cây sắn châu Á mặc dù đã được chuyển đổi từ cây lương

thực tự cung tự cấp thành cây công nghiệp quan trọng, nhưng nguồn di truyền hẹp
các giống sắn ở vùng này đã hạn chế việc tăng năng suất và tinh bột [21], [38], [39].
1.1.3. Giống sắn TMS 60444
Giống sắn TMS 60444 thuộc chi Manihot, loài esculenta, là giống sắn hoang dại
có nguồn gốc từ Nigeria, đã được các nhà khoa học tại Viện quốc tế Nông nghiệp Nhiệt
đới (IITA) thuộc Ibadan – Nigeria thu thập về để nghiên cứu vào ngày 01-06-1988.
Giống sắn TMS 60444 còn có tên gọi khác là NGA11. Chiều cao đạt được của giống
khi thu hoạch khoảng 215 cm. Lá trung tâm có dạng hình mác-elip. Cuống lá màu xanh
xen kẽ với một ít màu đỏ. Lá trưởng thành có màu xanh đậm và xẻ thành 5 thùy lá. Rễ
củ có màu trắng [92]. Đây là giống sắn đã được các viện nghiên cứu ở Thụy Sĩ và
Hoa kỳ đánh giá là giống sắn có khả năng tạo mô sẹo phôi hóa chất lượng nhất và đã
được chuyển gen thành công [69], [85].
1.2. Yếu tố phiên mã
1.2.1. Ứng dụng của yếu tố phiên mã trong chọn giống phân tử
Các gen mã hóa các enzyme thường được sử dụng trong chọn giống phân tử với
mục tiêu cung cấp cho cây trồng những đặc tính mới. Khi một đặc tính mới được hình
thành nó yêu cầu phải có sự thay đổi nào đó trong gen mã hóa, các đặc tính này được
xác định thông qua các phản ứng sinh hóa. Thêm vào đó, nếu mục đích hoạt hóa một
con đường cụ thể được quy định ở một mức giới hạn tỷ lệ, thì sự biểu hiện quá mức
giới hạn của enzyme xúc tác có thể dẫn đến sự gia tăng hoạt động của enzyme, từ đó
dẫn đến sự hoạt hóa con đường. Sự biểu hiện quá mức của một dạng enzyme đã bị
giảm hoạt tính có thể có hiệu quả hơn bởi vì con đường chuyển hóa có thể được hoạt
hóa một cách cơ định không phụ thuộc vào các nhân tố điều hòa âm [84].

21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Tuy nhiên, sự thay đổi đáp ứng của tế bào hoặc sự kích thích các phản ứng
enzyme là cần thiết để hình thành một đặc điểm mới, điều này rất hữu ích để thay đổi
biểu hiện của gen mã hóa protein điều hòa đặc biệt là yếu tố phiên mã. Bởi vì một
yếu tố phiên mã đơn lẻ thường kích hoạt phức hợp những đáp ứng của tế bào với
những kích thích bên trong hoặc bên ngoài cụ thể bằng cách đồng thời cảm ứng biểu
hiện của nhiều gen chức năng không liên quan đến nhau (hình 8A), sự biểu hiện quá
mức của một yếu tố phiên mã có thể tạo ra đáp ứng mạnh hơn với một kích thích cụ
thể. Bên cạnh đó, bởi vì một yếu tố phiên mã đơn lẻ thường điều khiển sự biểu hiện
phối hợp của các enzyme tham gia vào một con đường chuyển hóa (hình 8B), tăng
cường biểu hiện của yếu tố phiên mã chính sẽ có khả năng kích hoạt các con đường
mà chỉ cần tăng cường sự biểu hiện quá mức của một enzyme [84].

Hình 2: Hoạt động của yếu tố phiên mã (TF); (A) TF có thể hoạt hóa quá trình phiên mã
từ các promoter của nhiều gen mà mỗi gen trong đó có liên quan đến phản ứng khác nhau. (B) TF có
thể điều khiển phối hợp biểu hiện của nhiều gen tham gia vào một con đường trao đổi chất [84].

Các nghiên cứu về yếu tố phiên mã CBF/DREB liên kết đặc biệt với trình tự
A/GCCGAC trong các promoter cảm ứng hạn, muối cao, và lạnh, cho thấy tiềm năng
của các yếu tố phiên mã trong chọn giống phân tử. Biểu hiện yếu tố phiên mã CBF1
(DREB1B) trong cây Arabidopsis đã giúp tăng cường khả năng chịu lạnh của cây
chuyển gen [39] và sự siêu biểu hiện của yếu tố phiên mã DREB1A (CBF3) cũng dẫn
đến việc cải thiện khả năng chống chịu với những điều kiện bất lợi: hạn hán, muối
cao và lạnh [43].

22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1.2.2. Yếu tố phiên mã Dof1
Nitơ là nhân tố giới hạn chính cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật không
chỉ trong hệ sinh thái tự nhiên mà còn trong hầu hết các hệ sinh thái nông nghiệp. Sử
dụng yếu tố phiên mã có thể là một cách tiếp cận mạnh mẽ để cải thiện sự trao đổi chất
cho một thế hệ các loại cây trồng có đặc điểm vượt trội bởi vì một yếu tố phiên mã duy
nhất thường xuyên điều chỉnh biểu hiện phối hợp của một tập hợp các gen quan trọng
cho con đường tương ứng. Biểu hiện của Dof1 cảm ứng điều hòa tăng cho các gen mã
hóa các enzyme để sản xuất khung carbon giúp gia tăng đáng kể hàm lượng axit amin
và giảm mức độ glucose trong cây Arabidopsis chuyển gen [83].
Đồng hóa nitơ là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Do
chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của hiệu quả sử dụng nitơ đến năng suất cây trồng, một số
lượng lớn các loại phân đạm được đổ vào đồng ruộng để tối đa hóa năng suất cây
trồng. Tuy nhiên, phân bón nitơ gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trường, đặc biệt
là các hệ sinh thái thủy sinh [55]. Vì vậy, việc tạo cây trồng có khả năng tăng đồng
hóa nitơ là rất quan trọng để gia tăng cả sinh khối thực vật và bảo vệ môi trường [30].
Ở thực vật, nitơ vô cơ trong đất ở dạng nitrat và amoniac là bước đầu chuyển đổi
thành glutamine và glutamate bởi hai enzyme glutamine synthetase (GS) và
glutamate synthase (glutamine-oxoglutarate aminotransferase). Sau đó các axit amin
được sử dụng như nguyên liệu ban đầu cho quá trình tổng hợp các hợp chất nitơ hữu
cơ, bao gồm các axit amin khác, nucleotide, và chlorophyll (hình 3) [47].
Một con đường đồng hóa nitơ được giả định đó là việc tăng cường các hoạt
động enzyme cho đồng hóa nitơ hoặc khử nitrate. Tuy nhiên, biểu hiện quá mức sự
đồng hóa nitơ hoặc các enzyme khử nitrat không thúc đẩy được quá trình tổng hợp
axit amin trong cây chuyển gen [30], [73]. Ngoài ra, các báo cáo gần đây cho thấy,
sản xuất GS quá mức dẫn đến hiệu suất sử dụng nitơ tốt hơn thông qua thúc đẩy việc
tái sử dụng ammonia tạo ra trong quang hợp nhưng không làm tăng mạng lưới đồng
hóa nitơ [32], [57].
Đồng hóa nitơ không chỉ cần sự có mặt của nitơ vô cơ trong đất mà còn cần
khung carbon 2-oxoglutarate (2-OG) được tạo từ các chất trung gian chuyển hóa của

23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




quá trình quang hợp (hình 3). Mức độ các chất chuyển hóa carbon và nitơ cùng có
ảnh hưởng lẫn nhau, cho thấy liên kết mật thiết giữa quá trình trao đổi chất carbon và
nitơ [25]. Do đó, có thể dự đoán rằng sự gia tăng khung carbon có thể kích thích sự
đồng hóa nitơ trong các cây. Biến đổi gen sản xuất khung carbon được cho là khó
khăn bởi vì nhiều enzyme tham gia vào sản xuất khung carbon. Chuyển nhiều gen mã
hóa các enzyme có vẻ không thực tế nhưng chuyển một gen mã hóa một chất hoạt
hóa phiên mã chính thì dường như có thể.

Hình 3: Biểu hiện Dof1 tăng sự biểu hiện của các gen PEPC, PK, CS và ICDH
trong cây Arabidopsis chuyển gen Dof1. Chữ viết tắt cho các chất chuyển hóa được sử
dụng: PEP: phosphoenolpyruvate; OAA: oxaloacetate; 2-OG: 2-oxoglutarate. Một số enzyme quan
trọng: PEPC: carboxylase phosphoenolpyruvate; PK: pyruvate kinase; CS: synthase citrate; ICDH:
dehydrogenase isocitrate; GS: glutamine synthetase; GOGAT: synthase glutamate; NIA: reductase
nitrate [84].

Các loài thực vật và động vật đáp ứng với hàng loạt các kích thích bên trong và
bên ngoài bằng cách điều khiển sự phiên mã của các gen khác nhau. Vô số các nhân
tố cis và các yếu tố hoạt động trans đã được xác định và mô tả để hỗ trợ cho sự hiểu
biết của chúng ta về cơ chế điều hòa biểu hiện gen và các con đường dẫn truyền tín

24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN