Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên ha1 của virus h5n1 vào bèo tấm wolffia globosa thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

------------ 



 ----------


NGUYỄN HỮU HẢI




NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG NGUYÊN Ha1
CỦA VIRUT H5N1 VÀO BÈO TẤM Wolffia globosa
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens




LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP



Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 60.62.05
Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ LÝ THU

HÀ NỘI - 2010
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………i
LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn
ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn



Nguyễn Hữu Hải

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………ii
LỜI CẢM ƠN

ðể luận văn này ñược thành công tôi ñã nhận ñược sự quan tâm giúp
ñỡ của rất nhiều người. Trước hết, tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh ñạo
Viện ñào tạo Sau ñại học và các thầy cô của trường ðại học Nông nghiệp Hà
Nội. Những người ñã tận tình truyền thụ kiến thức và tạo mọi ñiều kiện cho
tôi ñược học tập, nghiên cứu trong suốt 2 năm qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến tiến sỹ Phạm Thị Lý Thu,
người thầy ñã dành nhiều thời gian, công sức tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi
trong suốt thời gian thực hiện ñề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn ban lãnh ñạo Viện Di truyền Nông nghiệp và tập
thể cán bộ phòng thí nghiệm Trọng ñiểm công nghệ tế bào thực vật ñã giúp
ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành ñề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình, bạn bè, những người

luôn ở bên cạnh giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua!
Tác giả luận văn



Nguyễn Hữu Hải

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………iii
MỤC LỤC

Lời cam ñoan 1
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung về bèo tấm Wolffia globosa 3
2.2 Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật 5
2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp PCR 15
2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16
3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.1 Vật liệu 22
3.2 Nội dung nghiên cứu 23
3.3 Phương pháp nghiên cứu 24
3.4 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 35
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Nghiên cứu tối ưu hoá một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình
biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa 36
4.1.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào bèo
tấm Wolffia globosa nguyên cây 36
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………iv
4.1.2 Xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen vào bèo
tấm Wolffia globosa 38
4.1.3 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của
gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 41
4.1.4 Xác ñịnh thời gian lây nhiễm thích hợp của vi khuẩn
A.tumefaciens với bèo tấm Wolffia globosa 43
4.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) ñến
tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 45
4.1.6 Xác ñịnh môi trường ñồng nuôi cấy bèo tấm – vi khuẩn thích hợp. 47
4.1.7 ðánh giá ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu
hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 48
4.2 Nghiên cứu xác ñịnh nồng ñộ chất kháng sinh (Cefotaxim,
Timentin) thích hợp ñể loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens sau biến nạp 50
4.3 Nghiên cứu xác ñịnh ngưỡng gây chết của kháng sinh thực vật
ñến bèo tấm W.globosa 51
4.4 Phân tích PCR cây chuyển gen 57
5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 59
5.1 Kết luận 59
5.2 ðề nghị 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
PHỤ LỤC 66
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AS acetosyringone

bp base pair
CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter
CTAB Cetyltrimeethylammonium bromide
DNA Deoxy ribo-Nucleic Acid
ðC ðối chứng
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid
Et-Br Ethidium Bromide
gus β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase
NOS Nopaline Synthetase
NOS-P Nopaline Synthetase Promotor
nptII Neomycin phosphotransferase gene
= gen mã hoá neomyciphosphotransferase
OD
600
Mật ñộ vi khuẩn ño ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế
DUR800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter
PCR Polymerase Chain Reaction
T-DNA transferred-DNA = DNA chuyển
Ti- Plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật
X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………vi
DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1 Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen
vào bèo tấm Wolffia globosa 37

2 Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen
gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 39

3 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen
gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 42

4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus
ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 44

5 Ảnh hưởng của Acetosyringone ñến biểu hiện của gen gus ở bèo
tấm Wolffia globosa chuyển gen 46

6 Xác ñịnh môi trường ñồng nuôi cấy thích hợp cho chuyển gen vào
bèo tấm Wolffia globosa 47

7 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của gen
gus ở Wolffia globosa chuyển gen 49

8 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Geneticin 52

9 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Paromomycin 53



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………vii
DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
2.1 Cây phân loại họ Bèo tấm (Lemnaceae) 4
2.2 Cấu trúc Ti-Plasmid dạng octopin 10
2.3 Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật 12
2.4 Sơ ñồ cấu trúc hệ vector nhị thể 13
2.5 Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp 15
3.1 Bèo tấm Wolffia globosa nuôi trên ñĩa thạch 22

3.2 Vectơ nhị phân pCAMBIA1301 và vector p6d35SUbiHa1 23
4.1 Biểu hiện của gen gus khi biến nạp bằng các chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefacies 38
4.2 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của
gen gus ở bèo tấm W. globosa sau khi biến nạp với A. tumefaciens 40
4.3 Ảnh hưởng của cách phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện
của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen. 42
4.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus 45
4.5 Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS) ñến biểu hiện của gen gus
ở bèo tấm W. globosa chuyển gen 47
4.6 Biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen trên các
môi trường ñồng nuôi cấy khác nhau 48
4.7 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của
gen gus ở Wolffia globosa chuyển gen. 50
4.9 Ảnh hưởng của Geneticin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo
tấm Wolffia globosa 53
4.10 Ảnh hưởng của Paromomycin tới sự sinh trưởng và phát triển
của bèo tấm Wolffia globosa 53
4.8 Biểu hiện của gen gus khi chuyển gen bằng quy trình hoàn thiện 55
4.10 Kết quả kiểm tra DNA tổng số của 12 mẫu bèo W. globosa
chuyển gen 57
4.11 Kết quả phân tích PCR của 12 dòng bèo W. globosa chuyển gen 58

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………1
1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñời sống con người cũng
không ngừng ñược nâng cao. Việc chăm sóc sức khỏe cộng ñồng ngày càng
ñược quan tâm chú ý hơn. Nhất là trong giai ñoạn hiện nay, khi mà hiện tượng

kháng thuốc ñối với các tác nhân gây bệnh cũ khá phổ biến và số lượng các tác
nhân gây bệnh mới xuất hiện ngày càng nhiều thì việc chăm sóc sức khỏe con
người ñã trở thành một vấn ñề bức thiết của toàn xã hội. Các phương pháp
phòng bệnh luôn ñược ưu tiên hàng ñầu ở mọi quốc gia. Tuy nhiên, do giá thành
vaccine sản xuất còn rất cao và lượng vaccine sản xuất còn hạn chế nên nhiều
nước ñang phát triển vẫn không thể cung cấp ñầy ñủ vaccine ñể phòng ngừa các
loại bệnh nguy hiểm. Ngoài ra, việc bảo quản và sử dụng các loại vaccine sống
nhược ñộc cũng phải tuân thủ những quy tắc rất nghiêm ngặt nếu không sẽ mất
tác dụng, thậm chí có thể quay trở lại dạng ñộc gây nguy hiểm cho người sử
dụng. Vì vậy, một yêu cầu ñặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới là phải tìm
ra phương pháp sản xuất vaccine mới có hiệu quả cao và giá thành hạ.
Hiện nay, một hướng nghiên cứu mới ñang thu hút sự quan tâm của các
nhà khoa học trên thế giới, ñó chính là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản
xuất vaccine thực vật, hay còn gọi là “Vaccine thực phẩm”. ðây chính là các
protein tái tổ hợp do thực vật tạo ra sau khi ñược chuyển gen. So với phương
pháp sản xuất vaccine truyền thống, hệ thống thực vật có nhiều lợi thế hơn
hẳn. Vaccine thực phẩm an toàn hơn hẳn so với các loại vaccine nhược ñộc
hiện nay do chúng không có khả năng quay trở lại dạng ñộc ñể gây nguy hiểm
cho người sử dụng. Về mặt giá thành, thực vật có thể trồng trên diện tích rộng
với chi phí thấp hơn rất nhiều so với việc nuôi cấy tế bào ñộng vật ñể sản xuất
các loại vaccine nhược ñộc. Ngoài ra, việc bảo quản và sử dụng vaccine cũng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………2
ñươn giản hơn nhiều. Thay vì việc tiêm chủng thường gây chi phí tốn kém,
người sử dụng chỉ cần ăn các loại rau quả mang vaccine thực phẩm.
Nhiều loài cây trồng ñã ñược các nhà khoa học chọn làm ñối tượng ñể
nghiên cứu cho mục tiêu trên và thu ñược những thành công ñáng kể. Trong
số các loài thực vật ñược nghiên cứu ñể sử dụng làm hệ thống sản xuất
protein tái tổ hợp, các loài thuộc họ Bèo tấm (Lemnaceae) ñang ñược ñặc biệt
chú ý bởi chúng có rất nhiều ưu ñiểm.
Bèo tấm Wolffia globosa là một thực vật nhỏ bé nhưng lại có sức sống

mạnh mẽ. Chúng có thể sống ở nhiều vùng khí hậu khác nhau; có khả nhân
sinh khối nhanh; chứa nhiều loại vitamin A, B1, B2,… và ñặc biệt là chúng có
bộ máy sản xuất protein khá mạnh. Với những ưu ñiểm ñó bèo tấm Wolffia
globosa mang nhiều lợi thế cho việc sản xuất các loại protein tái tổ hợp.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi ñã thực hiện ñề tài: “Nghiên
cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia
globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài
1.2.1. Mục ñích
- Xây dựng thành công quy trình chuyển gen kháng nguyên Ha1 cảu
virus vào bèo tấm W. globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
- Tạo ñược mẫu bèo tấm Wolffia globosa mang gen Ha1.
1.2.2. Yêu cầu
- Tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưỏng ñến quá trình biến nạp gen, bao
gồm: Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thích hợp cho biến nạp gen,
mật ñộ vi khuẩn thích hợp ñể biến nạp, thời gian biến nạp,…
- Sử dụng các loại kháng sinh như: Geneticin, Paromomycin ñể chọn
lọc cánh bèo chuyển gen và nhân dòng.
- Kiểm tra sự có mặt của gen Ha1 trong hệ gen của bèo tấm Wolffia
globosa bằng phản ứng PCR.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về bèo tấm Wolffia globosa
2.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân bố
Wolffia globosa ñược tìm thấy ở các vùng thung lũng có khí hậu nóng
thuộc trung tâm và miền nam California, ở vùng bùn lầy của các kênh mương
dọc miền tây Nevada, và cả những cánh ñồng lúa ở trung tâm Valley. Ngoài
California người ta còn tìm thấy Wolffia globosa ở những vùng khác của Mỹ
như miền nam Florida. Wolffia globosa còn phân bố rộng khắp các vùng nhiệt

ñới nóng ẩm trên thế giới như Châu Phi, Ấn ðộ, ðông Nam Á, ðảo
Hawai,…. [22], [23].

2.1.2. Phân loại thực vật
Họ Bèo tấm (Lemnaceae) có 5 chi: Spirodela, Landoltia, Lemna,
Wolffia, Wolffiella và ñược chia làm 38 loài. Trong họ Lemnaceae, chi
Spirodela ñược xem là nguyên thủy nhất với 2 loài là Spirodela polyrhiza và
Spirodela intermedia. Nó ñược xếp ñầu tiên trong cây phân loại. Trái lại, chi
Wolffia ñược coi là chi tiến hóa nhất do có ít ñặc ñiểm giống với Spirodela
nhất, nằm ở vị trí cao nhất trong cây phân loại. Xét về hình thái thì Spirodela,
Landoltia, Lemna có quan hệ gần gũi với nhau. Ba chi này có rất nhiều ñặc
ñiểm chung, trong ñó Landoltia mang hình thái chung gian giữa Spirodela và
Lemna [22], [23].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………4

Hình 2.1: Cây phân loại họ Bèo tấm (Lemnaceae)
(Nguồn: />)

2.1.3. ðặc ñiểm của bèo tấm Wolffia globosa
Wolffia globosa là loài thực vật hạt kín có hoa nhỏ bé nhất. Chúng
không có rễ, cây có dạng hình trứng hoặc hình elíp ống dài và toàn bộ cây có
màu xanh trong suốt, kích thước từ 0,4 – 0,9mm. Hoa của chúng rất nhỏ bé,
phát triển ngay trên thân cây chứa 1 nhị và 1 nhụy ñơn ñược bao bọc bởi một
cái túi nhỏ, không có ñài và những cánh hoa.
Bèo tấm có 2 hình thức sinh sản, ñó là: sinh sản hữu tính và vô tính.
Trong ñó, bèo tấm sinh sản bằng hình thức nảy chồi vô tính là chủ yếu. Các
cánh bèo con ñược sinh ra từ vùng mô phân sinh nằm sâu trong cánh bèo mẹ và
chúng tách khỏi cánh bèo mẹ khi trưởng thành, Mỗi cánh bèo con ñại diện cho
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………5
một thế hệ bèo mới, chúng mang ñầy ñủ các bộ phận và chức năng như cánh

bèo mẹ. Khi các cánh bèo con hình thành, bản thân chúng ñã mang sẵn các thế
hệ cánh bèo kế tiếp ñang ñược hình thành ở vùng mô phân sinh của chúng. Khi
gặp ñiều kiện bất lợi như: thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt ñộ quá cao hay quá
thấp,… bèo tấm có khả năng tạo chồi ngủ gọi là “turion”. Các chồi ngủ này
lắng xuống ñáy bùn ao hồ và nảy mầm thành những cây bèo mới khi gặp ñiều
kiện thuận lợi. ðôi khi, bèo tấm Wolffia globosa cũng sinh sản hữu tính thông
qua sự ra hoa và kết hạt tương tự như các loại thực vật hạt kín khác [23], [24].
2.1.4. Những ưu ñiểm của bèo tấm W. globosa
W.globosa là cây một lá mầm thuộc họ Lemnaceae [23] nên nó mang
ñầy ñủ những ñặc ñiểm chung của họ Bèo tấm:
- Có khả năng nhân ñôi trong vòng 24 – 72 giờ tùy thuộc vào ñiều kiện
môi trường, là một trong số những loài có tốc ñộ nhân sinh khối lớn nhất
trong giới thực vật [22], [23].

- Có bộ máy sản xuất protein mạnh, khoảng 15% protein tính trên trọng
lượng chất khô (Landolt, 1986). Protein của bèo tấm W. globosa còn chứa hầu
hết các axít amin không thay thế và rất nhiều loại vitamin khác như A, B1,
B2, E,.... [22], [24].
- Rất dễ nuôi trồng; chỉ cần nước, ánh sáng, CO
2
và ñặc biệt không phụ
thuộc vào thời vụ (Landolt và Kandeler, 1987) [22], [23].
- Sinh sản vô tính là chủ yếu nên hạn chế ñược sự trao ñổi gen giữa các
loài gần gũi về di truyền [24]
,
ñiều này ñảm bảo tốt ñiều kiện về an toàn sinh
học cho cây biến ñổi gen.
- Cải tạo môi trường nước [10], [22], [41].
2.2. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
Chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một bước tiến nhảy vọt trong

chọn giống thực vật và là một thành quả rất quan trọng của công nghệ sinh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………6
học hiện ñại. Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng quan
trọng nhất là bản chất cây trồng, ñặc tính di truyền của cây và ñặc biệt là
phương pháp chuyển gen vào cây.
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết
kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của vi
sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật. . .) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào hệ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn ñến việc xuất hiện
những ñặc tính mới của sinh vật chuyển gen.
Có hai phương pháp chính chuyển gen vào thực vật, ñó là: Phương
pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp.
2.2.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp
Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen ñược chuyển trực tiếp vào tế
bào thực vật thông qua những thiết bị và thao tác nhất ñịnh. Người ta thường
sử dụng một số cách chuyển gen trực tiếp sau:
Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật siêu âm dùng ñể chuyển gen vào các tế bào trần. Sau khi tách
tế bào trần, tạo huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang gen
mong muốn và gen chọn lọc. Cắm ñầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập
trong huyền phù tế bào trần 3mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20 kHz
theo từng nhịp ngắn 110 mili giây. Tổng thời gian tác ñộng khoảng 500–900
mili giây. Sau ñó ñem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc
môi trường chọn lọc ñể tách các tế bào trần ñã nhận ñược DNA. Nuôi cấy tái
sinh cây [2].
Chuyển gen nhờ kỹ thuật ñiện xung (electroporation)
Kỹ thuật này ñược sử dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần. Tạo
một ñiện thế cao trong một thời gian ngắn thì có thể tạo nên các lỗ trên màng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………7

tế bào trần làm cho DNA bên ngoài có thể thâm nhập vào bộ gen của tế bào.
Người ta chuẩn bị một huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang
gen mong muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị ñiện xung tạo ñiện thế cao 200
– 600 V/cm trong khoảng thời gian 4 – 5 phần nghìn giây. Kết quả sẽ làm cho
màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời giúp cho DNA ngoại lai
có thể xâm nhập. Quá trình ñược thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc
các “buồng xung ñiện” có các tấm cực bằng kim loại ñặt cách nhau 1 – 4 mm.
Sau quá trình ñiện xung ñem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp
hoặc môi trường chọn lọc ñể tách các tế bào trần ñă nhận ñược DNA. Nuôi
cấy tái sinh và tiếp tục chọn lọc [2].
Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide
Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản
xuất. Sợi silicon carbide có ñường kính rất nhỏ khoảng 0,6 micromet và dài
khoảng 10-80 micromet. Khi lắc một huyền phù tế bào ñơn và plasmid tái tổ
hợp mang gen mong muốn, gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc
vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm
nhập. Nuôi cấy tế bào, tái sinh thành mô sẹo và cây, chọn lọc ñể tách ra
những cây ñã chuyển gen.
Thường huyền phù tế bào ñơn thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau
khi cấy chuyển là giai ñoạn tốt nhất ñể thực hiện quy trình chuyển gen [2].
Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn
Phương pháp chuyển gen này ñược gọi là phương pháp chuyển gen
không qua nuôi cấy mô. Theo phương pháp này thì DNA chuyển vào có thể
theo ñường ống phấn chui vào bầu nhuỵ cái và chuyển gen ngay sau khi hạt
phấn mọc qua vòi nhuỵ và bắt ñầu ñưa tinh tử vào thụ tinh. Theo nghiên cứu
thì chuyển gen qua bao phấn tốt nhất ngay sau khi quá trình thụ tinh xảy ra ở
noãn nhưng tế bào sinh dục cái chưa phân chia. Như vậy sự chuyển gen chỉ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………8
xảy ra ñối với một tế bào sinh sản cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không
xuất hiện thể khảm [2].

Chuyển gen bằng súng bắn gen
Nguyên tắc chung của phương pháp là sử dụng những viên ñạn có kích
thước nhỏ nhưng có tỉ trọng cao ñể ñạt gia tốc cao, dưới tác dụng của một lực
nén chúng có thể xuyên qua các lớp vỏ và màng tế bào ñưa một lớp bọc ngoài
(DNA cần chuyển) vào tế bào và tiếp cận bộ gen của tế bào. Người ta thường sử
dụng hạt tungsten hoặc hạt vàng có ñường kính từ 1-1,5 micromet làm các hạt vi
ñạn (microprojectile). Việc chuyển gen bằng súng bắn gen có nhiều thuận lợi do
dễ dàng tiến hành và ñặc biệt ñối tượng nhận gen rất ña dạng (ở dạng mô, phôi,
tế bào trần, tế bào) . Người ta sử dụng thành công súng bắn gen vào callus ñể
chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, gen kháng rầy, kháng nấm cho nhiều ñối tượng
cây trồng không kể cây hai hay một lá mầm.
Phương pháp này ñược áp dụng với các cây trồng mà việc chuyển gen
thông qua Agrobacterium khó thực hiện ñược. Phương pháp này ñược sử
dụng tương ñối rộng rãi với các ưu nhược ñiểm sau:
Ưu ñiểm:
- Có thể áp dụng hầu hết với các loại mô, tế bào.
- Chuyển DNA ngoại lai và tế bào nhanh.
- Dễ sử dụng: quy trình ñơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể ñược
xử lí trong thời gian ngắn.
- Các vector ñược thiết kế ñơn giản: không ñòi hỏi các trình tự DNA
cho ñoạn T-DNA như chuyển gen bằng Agrobacterium.
- Cần một lượng nhỏ plasmid DNA.
- Biểu hiện gen tạm thời có thể ñược quan sát sau vài ngày.
Nhược ñiểm:
- Nhiều bản sao ñược chuyển vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………9
cho việc phân tích biểu hiện gen ñã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của
các gen không bền vững.
- Hiệu quả chuyển gen thấp.
- Thiết bị ñắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có

thể mua ñược, giá thành vật tư ñắt [2].
2.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
Phương pháp chuyển gen gián tiếp, ở ñây gen ñược chuyển vào tế bào
thực vật qua một sinh vật trung gian, thường là vi khuẩn, virus.
Chuyển gen nhờ virus
Virus ñược sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ
thâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Mặt khác trong cấu tạo của virus
cũng có mặt axit nuclêic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào. Tuy
nhiên ñể làm vector chuyển gen thì virus cần có các tiêu chuẩn sau:
- Bộ genome của virus có cấu tạo DNA chứ không phải RNA
- Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các
plasmodest (lỗ thành tế bào)
- Có khả năng tải ñược các ñoạn DNA gắn vào
- Có phổ ký chủ rộng
- Không gây hại hoặc gây hại không ñáng kể
Tuy nhiên hiện nay, việc chuyển gen nhờ virus rất ít ñược sử dụng, do
virus về nguyên tắc không chuyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây
chuyển gen nhờ virus phải tiến hành bằng phương pháp vô tính. ðiều này
không phải thực hiện ñược với tất cả các loại cây. ðây chính là một nhược
ñiểm lớn của phương pháp chuyển gen bằng virus [2].
Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
DNA ñược chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế truyền ñặc trưng của
loài vi khuẩn Agrobacterium làm môi giới.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………10
Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-). Chúng gây ra các triệu
chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương.
Trong chi Agrobacterium có các loài chính sau:
A. tumefaciens: gây bệnh u thân.
A. rhisogenes: gây bệnh tạo rễ.
A. rubi: gây u ở các loại dâu ñất, mâm xôi.

A. radiobacter: sản sinh kháng sinh ñặc trưng ngăn cản tác hại của các
loài Agrobacterium kể trên.
Trong ñó A. tumenfaciens ñược áp dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen.
Từ lâu người ta ñã phát hiện hiện tượng hình thành các u ở thân cây khi
cây bị nhiễm vi sinh vật ñất A. tumefaciens qua các vết thương. Phân tích các
u cho thấy trong u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline,
octopine, gọi chung là opine, các chất này không tồn tại ở các cây bình
thường. ðiều ñặc biệt là khối u không ngừng tăng trưởng kể cả khi ñã diệt vi
khuẩn. ðiều này cho phép kết luận: vi khuẩn ñã chuyển vào cây tác nhân gây
khối u dưới dạng vật chất di truyền, ñó chính là các plasmid, chắc chắn các
plasmid này ñã truyền vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u
cho cây, do vậy người ta gọi chúng là Ti- plasmid (Tumo inducing plasmid).
Ti- plasmid ñã chuyển một ñoạn DNA của nó nhập vào gen của cây [2], [7].

Hình 2.2: Cấu trúc Ti-Plasmid dạng octopin
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………11
Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn này ñã ñược áp dụng rất thành
công trên nhiều ñối tượng cây trồng ñặc biệt là trên cây hai lá mầm (khoai tây,
cà chua, thuốc lá, ñu ñủ…). Sự chuyển nạp nhờ vi khuẩn vào cây một lá mầm
là khó thành công. Cây một lá mầm như hoà thảo thường không có sự phản
ứng với sự thương tổn (cây họ ñậu là cây hai lá mầm nhưng không có sự phản
ứng với sự thương tổn nên cũng khó chuyển nạp bằng Agrobacterium). Vết
thương không dẫn ñến sự phản phân hoá tế bào lân cận. Mặt khác, vi khuẩn
khó gắn kết với thành tế bào, hoạt tính promoter T- DNA giảm, hoạt ñộng
vùng vir bị ức chế.
Gần ñây ñã chuyển ñược gen nhờ Agrobacterium ở một số cây hoà
thảo: lúa (HIEI, 1994; Rashie, 1996; Khush và Datta, 1996…), ngô (Ishida,
1996) rất thành công. Trong trường hợp này người ta dùng tế bào phôi ở dạng
huyền phù làm ñối tượng chuyển nạp, một trường nuôi cấy có bổ sung chất
dẫn dụ Acetosyringone.

* Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium.
Phổ vật chủ của Agrobacterium ñược xác ñịnh là rất rộng, song hiệu quả biến
nạp gen lại không giống nhau ở các ñối tượng thực vật. Nhìn chung ở cây hai lá mầm
tần suất chuyển nạp gen cao hơn nhiều so với cây một lá mầm. Ngoài ra hiệu quả
biến nạp gen còn phụ thuộc nhiều vào kiểu gen của thực vật.
Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc
vào một số yếu tố chính như dạng mô lây nhiễm, mật ñộ vi khuẩn và thời gian
lây nhiễm, tiền xử lý mô thực vật, chủng vi khuẩn Agrobacterium và cấu trúc
vector biến nạp.
Khi phân tích biểu hiện gen gus ở mô lúa, Hiei và cộng sự (1994) ñã
phát hiện mô sẹo tạo thành từ tế bào sctellum là vật liệu phù hợp nhất ñể
chuyển gen thông qua Agrobacterium so với các loại mô khác (mô lá, ñỉnh
sinh trưởng, ñầu rễ).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………12
Thời gian nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới tần suất biến nạp, ở lúa
khoảng thời gian nuôi cộng sinh vào khoảng 2-3 ngày là lý tưởng nhất.
Sardana cho thấy rằng mật ñộ vi khuẩn cao 10
10
tế bào/ml ñã làm tăng hiệu
quả biến nạp gen cao hơn so với mật ñộ thấp 10
6
tế bào/ ml ở cây thuốc lá và
Arabidopsis [26], [33]. Tuy nhiên mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm không ảnh
hưởng ñến hiệu quả biến nạp gen ở Petunia.
Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào khả năng chuyển T-DNA của các
gen vir. Tăng khả năng biểu hiện của các gen vir ñạt ñược bằng cách gây tiền
cảm ứng vi khuẩn với hợp chất phenol như Acetosyringone (AS). Tiền xử lý
trong môi trường chứa AS ñã làm tăng tần suất biến nạp gen ở các cây thuốc
lá. Bổ xung AS vào môi trường nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới hiệu quả
chuyển gen thông qua Agrobacterium [28]. Ngoài ra ñộ pH của môi trường

lây nhiễm cũng ảnh hưởng trực tiếp ñến sự chuyển nạp T-DNA vào tế bào
thực vật. Khả năng cảm ứng gen vir tăng khi giá trị pH dao ñộng từ 5,2-5,8.
Nhiệt ñộ thích hợp cho sự cảm ứng gen vir là từ 21-25
o
C, ở nhiệt ñộ cao làm
giảm chức năng của các gen vir [2], [7].

Hình 2.3: Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật
Hệ thống vectơ chuyển nạp
Kích thước lớn của Ti-plasmid gây không ít khó khăn trong việc sao
chép ở mức phân tử cũng như không ñơn giản ñể chuyển nạp gen thông qua
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………13
Agrobacterium. Mặt khác, chúng lại chứa các gen tổng hợp hormon sinh
trưởng thực vật gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không ñược dùng trực
tiếp làm vectơ. Các enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều
chỗ khác nhau, trong khi ñó công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy
nhất cho hoạt ñộng của một số enzyme giới hạn. Ngoài ra, các gen onc ñược
dùng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội, nhưng chúng lại cản trở quá trình tái
sinh bình thường ở thực vật (Lê Trần Bình và cs, 1997, 2003; Lê Thị Thu
Hiền, 2003).
Với những lý do này, Ti-plasmid ñã ñược cắt bỏ các gen không quan
trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng ña năng (MCS), tạo hai hệ
thống vectơ chuyển gen hiệu quả: vectơ nhị thể (binary vector) và vectơ liên hợp
(co-integrate vector). Nhờ vậy, cây trồng ñược biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa
mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường.
• Hệ vector nhị thể
Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid
với vùng T-DNA mà vẫn ñiều khiển ñược sự chuyển và xâm nhập của T-
DNA vào genom thực vật, người ta ñã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống
vectơ nhị thể trong ñó vùng T-DNA và vùng vir nằm trên hai plasmid khác

nhau nhưng trong cùng một chủng A. tumefaciens (hình 2.3).

Hình 2.4: Sơ ñồ cấu trúc hệ vector nhị thể
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………14
Có hai loại vectơ ñược sử dụng trong hệ thống vectơ nhị thể:
(1) Vectơ chuyển gen: Là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và
có phổ vật chủ rộng với ñoạn T-DNA ñược cắt bỏ hết các gen không cần thiết
ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra
cấu trúc mới gồm: i) các ñơn vị sao chép ñể DNA plasmid có thể vừa tự nhân
trong cả E. coli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen ñánh dấu và iii)
vùng có chứa nhiều ñiểm cắt của các enzym giới hạn (vùng tạo dòng ña năng)
nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải ñể chèn gen mong muốn.
(2) Vector bổ trợ: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng vir ñược
giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB. Plasmid này ñược
cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng
vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai loại vector này cùng ñược ñưa vào Agrobacterium, khi các gen trên
vector bổ trợ hoạt ñộng thì các sản phẩm của nó sẽ tác ñộng tới ñoạn T-DNA
trên vector chuyển gen dẫn ñến sự chuyển ñoạn T-DNA sang tế bào thực vật.
• Hệ vectơ liên hợp
Vectơ liên hợp ñược xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương
ñồng nằm trên plasmid vi khuẩn (như vectơ của E. coli) với vùng T-DNA trên
Ti-plasmid của A. tumefaciens. Trong ñó, người ta giữ lại vùng vir, loại bỏ
vùng mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những ñoạn DNA mới
trong Ti-plasmid (hình 2.4).
Có 3 loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp:
(i) Ti-plasmid: các gen gây khối u ñã bị vô hiệu hoá bằng cách thay vào
ñó gen kháng kanamycin của vi khuẩn;
(ii) Vectơ trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và
ñược sử dụng ñể bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước

lớn và thiếu vùng MCS). Chúng ñược nhân lên trong E. coli và chuyển sang
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………15
A. tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể sao chép trong A.
tumefaciens nên chúng mang những ñoạn tương ñồng với T-DNA.
(iii) Vectơ trợ giúp: tồn tại trong E. coli, có kích thước nhỏ, chứa các
gen di ñộng (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển
vào A. tumefaciens.


Hình 2.5: Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp

2.3. Cơ sở khoa học của phương pháp PCR (polymerase chain reaction)
Cơ sở của phương pháp PCR là ñặc tính hoạt ñộng của các DNA
polymerase: chúng chỉ có khả năng tổng hợp một mạch mới từ một mồi (là
một trình tự DNA ngắn) ñã bắt cặp sẵn với khuôn. Trong thực nghiệm mồi là
những trình tự bổ sung chuyên biệt cho ñoạn DNA tổng hợp.
Phương pháp PCR gồm 3 bước :
- Biến tính : tách rời hai mạch của phân tử DNA.
- Lai: cặp mồi chuyên biệt cho một trình tự DNA ñịnh ñược cho bắt cặp
mồi với mạch khuôn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………16
- Kéo dài : DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi ñã bắt cặp.
Ba bước này hợp thành một chu kì và chu kì này ñược lặp lại nhiều lần.
Sau phản ứng PCR, sản phẩm khuyếch ñại ñược ñiện di trên gel
agarrose 1% bằng máy ñiện di và soi trên máy soi gel ñể quan sát kết quả [2].
2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
2.4.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất vaccine có nguồn gốc thực vật trên
thế giới
Trong thập niên vừa qua, nhiều nghiên cứu sử dụng thực vật làm hệ
thống sản xuất vaccine uống ñã ñược tiến hành và ñã thu ñược những kết quả

rất khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003) [33].
Một loạt các protein gây miễn dịch của virus, vi khuẩn và một số loài
thực vật ñã ñược nghiên cứu. Kết quả thử nghiệm ñã chứng minh vaccine tái
tổ hợp chống viêm gan B sản xuất bằng thực vật ñã gây miễn dịch hệ thống
màng nhầy ñộng vật (Mason et al., 1996) [28] và gây miễn dịch ở những
người tình nguyện (Tacket et al., 2000) [36].
Nhiều loại vaccine thú y cũng ñược quan tâm nghiên cứu như: Gen
VP2 tổng hợp vỏ của virus Gumboro ñã ñược chuyển vào Arabidopsis
thailiana. Dịch chiết của thực vật ñược tách và sử dụng ñể gây miễn dịch cho
gà qua ñường miệng. Kết quả cho thấy vaccine thương mại gây miễn dịch cho
78%, trong khi dịch triết gây miễn dịch cho 80% số gà ñược uống. Khi kết
hợp 2 loại vaccine này, cho gà uống vaccine thương mại ở 1 tuần tuổi và dịch
triết tách từ thực vật ở tuần thứ 4 cho tỷ lệ miễn dịch ñạt 90% (Wu et al.,
2004) [39]. Cỏ Linh lăng ñược chuyển gen tổng hợp polyprotein P1 và
protease 3C của virus gây bệnh lở mồng long móng ñã gây miễn dịch cho
chuột (Marria et al., 2005) [26].

Hiện nay, người ta ñã thành công trong việc tạo ra kháng nguyên chống
bệnh ở một số loại thực vật như: Glycoprotein B (cytomegalovirus người) ở
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………17
thuốc lá, lúa (Sardana et al., 2003) [33]; Tacket et al., 2000) [36]; NVCP
(virus Norwalk) ở khoai tây và thuốc lá (Marson et al., 1996) [28];
hemaglutinin virus sởi ở cà rốt (Bouch et al., 2003) [9]; HbsAg (virus viêm
gan B) ở khoai tây, rau riếp, chuối (Kapusta et al., 1999; Kong et al., 2001)
[19]; ñộc tố gây bệnh tả ở cà chua (Jani et al., 2002) [18]; protein F (virus hợp
bào hô hấp) ở cà chua (Sandhu et al., 2000) [32]; LT-B (E.coli) ở khoai tây,
ngô (Chikwamba et al.,2002; Haq et al., 1995) [12]; protein S (virus gây bệnh
ñường ruột) ở thuốc lá (Tuboly et al., 2000) [37]; protein L1 (papilloma virus
người) ở khoai tây (Warzecha et al., 2003) [38]; kháng nguyên chống bệnh
than ở thuốc lá (Aziz et al., 2002) [7]; protein vở puumala ở khoai tây và

thuốc lá (Kelm et al., 2001) [20] và epitope VP1 (virrus lở mồng long móng)
ở khoai tây (Carilo et al., 2001) [11]. Các thực vật ñược tạo ra có khả năng
gây ñáp ứng miễn dịch qua màng nhầy trên ñộng vật (Mason et al., 1992)
[27], ở gà (Wu et al., 2004) [39] và ở người tình nguyện (Tacket et al., 2000)
[36]. Các kết quả này cho thấy tiềm năng của nguồn thực vật là rất lớn. Thành
công trong việc phát triển và sản xuất vaccine uống bằng kỹ thuật di truyền
thực vật sẽ làm cho việc sử dụng vaccine trở nên thông dụng và tiện lợi hơn
cho các nước kém phát triển và những vùng sâu, vùng xa.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của bèo tấm ñể sản xuất các loại
protein tái tổ hợp
Trong giới thực vật, họ Bèo tấm (Lemnacaea) là họ có nhiều ưu ñiểm
như: có tốc ñộ nhân sinh khối nhanh, có bộ máy sản xuất protein khá mạnh,
có thể sinh trưởng và phát triển bình thường ở nhiều vùng khí hậu, … [22],
[23]. Chính vì vậy, nó ñã trở thành một trong những ñối tượng quan trọng
ñược rất nhiều nhà khoa học lựa chọn ñể nghiên cứu xây dựng hệ thống sản
xuất vaccine tái tổ hợp. Phương pháp ñược ứng dụng nhiều nhất ñể chuyển
gen vào bèo tấm là sử dụng súng bắn gen và biến nạp nhờ vi khuẩn