Phân tích cấu trúc, hàm lượng thuốc chống HIV stavudin bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––––

ĐOÀN THU TRANG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG THUỐC
CHỐNG HIV- STAVUDIN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––––

ĐOÀN THU TRANG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG THUỐC
CHỐNG HIV- STAVUDIN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hoá Phân tích

Mã số : 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH

THÁI NGUYÊN - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến và T.S Đặng Thị Tuyết Anh đã giao đề tài và tận
tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa Dược và các em sinh
viên phòng Hóa Dược đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và
hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học
Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên
cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K8D- lớp Cao học Hóa đã
trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và
đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Hà nội,ngày 15 tháng 10 năm 2016
Học viên

Đoàn Thu Trang

a
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... a
MỤC LỤC ......................................................................................................... b
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... d
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ............................................................. e
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Khái quát về d4t ......................................................................................... 2
1.2. Tổng quan về phương pháp phân tích hóa lý ............................................. 4
1.2.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR. ....... 4
1.2.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS) ........................................................ 6
1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ......................................................... 7
1.2.4. Phương pháp xác định độ ẩm theo Karl Fischer ..................................... 9
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................... 10
2.1. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 10
2.1.1.Hóa chất và dung môi ............................................................................ 10
2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc ...................................................................... 10
2.1.3. Xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của
các sản phẩm tổng hợp được ........................................................................... 11
2.2. Tổng hợp stavuđin .................................................................................... 11
2.2.1. Tổng hợp dimesylthymidin ................................................................... 11
2.2.2. Tổng hợp oxetanthymidin ..................................................................... 12

2.2.3.Tổng hợp stavudin .................................................................................. 13
2.3. Phân tích cấu trúc và hàm lượng của stavudin và các sản phẩm trung
gian bằng phương pháp hóa lý hiện đại .......................................................... 15

b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.3.1. Phân tích cấu trúc stavudin và các sản phẩm trung gian bằng
phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR,

13

C-NMR, khối phổ

MS, phổ hồng ngoại IR ................................................................................... 15
2.3.2. Phân tích hàm lượng của stavudin ........................................................ 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 18
3.1 . Phân tích và xác định cấu trúc của stavudin và các sản phẩm trung gian
đã tổng hợp được.............................................................................................. 18
3.1.1. Phân tích và xác định cấu trúc của sản phảm trung gian
dimesylthymidin tổng hợp được ..................................................................... 19
3.1.2. Phân tích và xác định cấu trúc của sản phảm trung gian
oxetanthymidin tổng hợp được ....................................................................... 20
3.1.3. Tổng hợp stavudin ................................................................................. 22
3.2 . Phân tích cấu trúc và hàm lượng của stavudin bằng các phương pháp
hóa lí hiện đại ................................................................................................... 22
3.2.1. Phân tích cấu trúc của stavudin bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ

hạt nhân 1H-NMR ............................................................................................ 22
3.2.2. Phân tích cấu trúc của stavudin bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ
hạt nhân cacbon 13C-NMR ............................................................................... 23
3.2.3. Phân tích cấu trúc của stavudin bằng phương pháp khối phổ ................. 24
3.2.4. Phân tích cấu trúc của stavudin bằng phương pháp phổ HPLC .............. 25
3.2.5. Phân tích cấu trúc của stavudin bằng phương pháp hồng ngoại -IR ....... 25
3.2.6. Phân tích stavudin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC .............. 26
3.2.7. Phân tích một số chỉ tiêu hóa lý khác của stavudin .............................. 27
KẾT LUẬN .................................................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 30

c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
13

C- NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear
Magnetic Resonance)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic

H- NMR

Resonance)
HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS

Phổ khối lượng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass
Spectrometry)

H, C

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm

Phần triệu ( parts per million )

s

singlet

dd

Double doulet

CHCl3

Clorofoc

EtOH

Etanol

MW

Microwave

MeOH

Metanol

OMe

Methoxy

SOCl2

Sulfonylchlorua

DMF

TLC

Dimethylformamide
Thin-layer chromatography

d


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình:
Hình 1.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat ................................ 5
Hình 1.2. Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2) ................................... 7
Hình 1.3. Phổ hồng ngoại của benzyl ancol...................................................... 8
Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của dimesylthymidin ................................................ 20
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của oxetanlthymidin ................................................. 21
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của d4T ..................................................................... 23
Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của d4T .................................................................... 24
Hình 3.5: Phổ MS của stavudin ...................................................................... 24
Hình 3.6: Phổ HPLC của stavudin .................................................................. 25
Sơ đồ:
Sơ đồ 1.1............................................................................................................ 3
Sơ đồ 1.2............................................................................................................ 3
Sơ đồ 1.3............................................................................................................ 4
Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp stavudin .......................................................... 18
Sơ đồ 3.2: Tổng hợp dimesylthymidin ............................................................ 19
Sơ đồ 3.3: Tổng hợp stavudin ......................................................................... 22

e

MỞ ĐẦU
Tính đến cuối năm 2015, theo báo cáo của WHO đã có 35 triệu người
nhiễm HIV, 1,5 triệu người chết do AIDS và 119 quốc gia đã báo cáo kết quả
có khoảng 95 triệu người đã xét nghiệm HIV.
Ở Việt Nam, trong năm 2015, đã phát hiện 10.195 trường hợp nhiễm
mới HIV số bệnh nhân chuyển sang AIDS là 6130, tử vong do AIDS 2130
trường hợp. Tính đến cuối năm 2015 cả nước hiện có 227.154 trường hợp
nhiễm HIV còn sống và ước tính hiện có 254.000 người nhiễm HIV trong
cộng đồng. Mỗi năm, Việt Nam mỗi năm có khoảng 12.000 – 14.000 trường
hợp nhiễm mới HIV. Trong số những người được báo cáo xét nghiệm mới
phát hiện nhiễm HIV trong năm 2015, nữ chiếm 34,1%, nam chiếm 65,9%;
lây truyền qua đường tình dục chiếm phần lớn với 50,8%, lây qua đường máu
chiếm 36,1%, mẹ truyền sang con chiếm 2,8% và không rõ nguyên nhân
chiếm 10,4%... dịch vẫn diễn biến rất khó lường và chứa đựng nhiều nguy cơ
bùng nổ dịch. Những số liệu dịch tễ gần đây cho thấy HIV đang chuyển sang
cấp độ phổ biến hơn, nhất là các khu vực Quảng Ninh, Thành phố Hồ Chí
Minh và Hà Nội. Chiến lược phòng chống HIV/AIDS của Bộ Y Tế, phấn đấu
đến năm 2020 có khoảng trên 80% bệnh nhân được tiếp cận đầy đủ thuốc điều
trị HIV/AIDS, nghĩa là có khoảng 196.000 người cần thuốc để điều trị. Với
ước tính hiện nay khoảng 96.000 người Việt Nam cần được chữa trị ( 49% số
người bị nhiễm), thì tổng chi phí sẽ vào khoảng 10 tỷ đồng hàng năm. Khi đã
bắt đầu điều trị, thì phải điều trị liên tục, bởi bất cứ sự gián đoạn nào đều dẫn
đến nhờn thuốc. Nếu nhân với số năm cuộc đời của người nhiễm sẽ thấy gánh
nặng chi phí đối với cá nhân, gia đình của họ và chính phủ. Vì thế, nghiên cứu
sản xuất thuốc chống HIV/AIDS ở Việt Nam để người bệnh được tiếp cận
thuốc giá rẻ là điều không thể bỏ qua và đã rất cấp bách.
Vì vậy,chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc,
hàm lượng thuốc chống HIV - Stavudin bằng các phương pháp hóa lý hiện
đại ”. Đây là đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về d4t
2’,3’-Didehydro-3’-deoxythymidin (stavudin) (1), Zidovudin (2) và
lamivudin (3) (hình 1) là thuốc được dùng rộng rãi ở dạng đơn chất và tổ hợp
để điều trị HIV [1-4]. Nhóm thuốc này hoạt động như tác nhân ức chế enzim
phiên mã ngược của virus HIV ( HIV-RT) [5]. Tổng doanh thu của thuốc
d4T năm 1998 trên 1,1tỷ USD. AZT và d4T là hai biệt dược chữa HIV/AIDS
nằm trong danh mục thuốc dự trữ liêu thông của Bộ Y tế, và đang được sử
dụng chủ yếu trong điều trị bệnh HIV/AIDS. Vì thế, nghiên cứu tổng hợp
stavudin, thuốc chống HIV/AIDS ở Việt Nam để người bệnh được tiếp cận
thuốc giá rẻ, chủ động nguồn thuốc chữa bệnh HIV-AIDS ở Việt Nam là cần
thiết và cấp bách.
Trong luận văn nay, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình tổng hợp
stavudin, từ đó phân tích cấu trúc và độ sạch của stavudin bằng các phương
pháp hóa lý hiện đại.

O

O
HN

HN

HO

O
O

NH2

O
O

N
HO

Stavudin (1)

N
N
HO

N3
Zidovidin (2)

O
O

N

S
Lamivudin (3)

Stavudin là thuốc chống HIV/AIDS đã được sử dụng rất rộng nên trên

thế giới [6-33] có nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp hiệu quả để
tổng hợp chất này. Nhìn chung d4T được tổng hợp theo hướng sau đây:
Một số phương pháp tổng hợp d4T
*Tổng hợp d4T từ thymidin.
Tổng hợp stavudin từ thymidin được tiến hành theo nhiều con đường
khác nhau và có thể tóm tắt trong sơ đồ 1.1 và 1.2. Từ dẫn xuất mesyl hóa (4)
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




và ( 5), anhydrit (6) [30] và oxetan (7) [31] có thể chuyển hoá thành stavudin
(1) dưới tác dụng của các tác nhân khác nhau.

O

O
HN

HN

TrO

O
O

O

N

1) LiCN, DMF

O
O

HO

HN
N

1) LiCN, DMF
2) CH3 COOH

2) CH 3COOH

TrO

O
O

N

MsO

MsO

1

4

5

Sơ đồ 1.1

O
HN

N

HO

O
O

O

O

N

O
O

1) LiCN, DMF
HO

2) CH3 COOH
(80%)
6

HN
N

Base

1

O

O
O

N

7

Sơ đồ 1.2
* Tổng hợp d4T từ 5-methyl uridin
Stavudin đã đươc Ewing và các cộng sự [32] tổng hợp từ 5-methyl
uridin (8) qua 4 bước phản ứng như mô tả trong sơ đồ 1.3:

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




O

O
HN

HN
O
O

HO

O

N

TrCl, Py

O
O

TrO

HN
N

a) NaIO4
TrO

O
O

N

b) Ph3 PCH 3 Br
HO

HO

OH

OH
10

9

8

Grubbs reagent

O

O
HN

HN
O
O

HO

N

AcOH (80%)
TrO

Stavudin (1)

O
O

N

11

Sơ đồ 1.3
Trong phương pháp này, tổng hợp stavudin từ 5-methyluridin (8) sử
dụng các tác nhân phản ứng đắt tiền (tác nhân cho phản ứng Wittig và tác
nhân cho phản ứng Grubbs).
1.2. Tổng quan về phương pháp phân tích hóa lý
1.2.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) [33-35] là phương pháp vật lý
hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến
được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và
13

C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ

của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là
spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 .
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt
nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho
các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt

nhân 1H thì:  

 TMS  x
.10 6 ( ppm)
o

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa
một các tổng quát như sau:


 chuan  x
.10 6 ( ppm)
o

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao
quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến
chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học
của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu
hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn.

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt
trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên
mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12
ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.

Hình 1.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân
không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân
phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách
tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có
từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J
phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên
kết ngăn giữa các tương tác.
Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa
các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có
thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau.
1.2.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử
trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau
đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa
vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất
nghiên cứu [33-35].
Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng
electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá

nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn
phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử
hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương
hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:
2e (1) > 95%

ABC
ABC

e
ABC

2

3e (2)

ABC-

Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các
ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lượng bắn phá các phân tử
thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc
phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân
tử ở mức năng lượng 70 eV.

ABC

A

ABC

AB

AB

A

BC
B
B

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và
năng lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.
Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e,
tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác
nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị
biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì
đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.2).

Hình 1.2. Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2)
Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định
được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những
thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần
nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.

1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho
nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất [33-35].
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước
sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến.
Phần của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm
trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m. Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ
hồng ngoại là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ
thuận với năng lượng .
Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng
ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao
động cao hơn. Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị
và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết,
dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết.
Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng
ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng
với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định,
(Hình 1.3).

Hình 1.3. Phổ hồng ngoại của benzyl ancol
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc
trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân
tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của
các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân

ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn
chứng cho hai hợp chất giống nhau.
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được
chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các
pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì
vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O,
C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 – 626 cm-1 phức
tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định
nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến
hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay .
1.2.4. Phương pháp xác định độ ẩm theo Karl Fischer
- Phương pháp chung:
Chiết phần mẫu thử bằng metanol khô ở 65 oC (nhiệt độ sôi) bằng cách
cho hồi lưu để loại nước. Để nguội rồi chuẩn độ phần dịch lỏng của dịch chiết
được giữ lại trong thiết bị Karl Fischer cho đến khi đạt được điểm kết thúc
chuẩn độ theo phương pháp chuẩn độ ampe với hai điện cực chỉ thị.
Phản ứng:
Trong quá trình xác định độ ẩm theo phương pháp Karl Fischer, nước
có trong mẫu phản ứng với iot và sulfua dioxit với sự có mặt của amin và
alcohol:
H2O + I2 + SO2 + ROH + 3 RnNH3-n  2RnNH3-n • HI + RnNH3-n • HSO4R
trong đó R là nhóm alkyl hoặc alkoxyl.
Điểm kết thúc phản ứng thu được bằng phép đo điện đối với iot dư.
- Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng
phải là nước cất hoặc nước đã khử khoáng có độ tinh khiết tương đương.

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1.Hóa chất và dung môi
Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của
hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng
cho phân tích.
Bột silicagel cho sắc ký cột 100 – 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký
silicagel đế nhôm Art. 5554 DC – Alufolien Kiesel 60F254(Merck).
2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc
Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, chúng tôi tiến hành
các phương pháp sau:
- Xác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy đo trên máy
Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ – Viện hóa học
– Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Impact 410 – Nicolet,
tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa
học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H-NMR (500MHz) và

13

C-NMR (125MHz) của các chất nghiên

cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO
và TMSlà chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân – Viện Hóa học
– Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên LC – MSD – Trap – SL
tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ
Việt Nam
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.1.3. Xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của
các sản phẩm tổng hợp được
Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng được xác định nhờ các phương
pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR,

13

C-

NMR,phổ hồng ngoại ( IR).
Các sản phẩm phản ứng được kiểm tra độ sạch bằng các phương pháp
sắc kí lớp mỏng, sắc khí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS).

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản
phẩm. Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị R f khác nhau, màu sắc
và sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng đã
xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chưa kết thúc là dựa vào
các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tương ứng. Giá trị Rf của các chất
phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên
tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để
tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết
để tinh chế các chất.
2.2. Tổng hợp stavuđin
2.2.1. Tổng hợp dimesylthymidin
* Nguyên liệu
- Thymidin: 10g
- Dung môi pyridin: 20 ml
- Xúc tác DMAP: 1,05 g
- Dung dịch HCl 1N: 10 ml
- Bản mỏng
*Thiết bị
- Bình cầu phản ứng 250 ml: 02 cái
- Phễu nhỏ giọt
- Bếp khuấy từ gia nhiệt
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




- Phễu lọc
-Phễu chiết 200ml
-Bơm chân không

-Máy cô quay dung môi
* Quy trình tổng hợp
Dung dịch của thymidin (10 g; 0,0432 mol ) trong dung môi pyridin
(20 ml), xúc tác dimethylaminopyridine (1,05 g; 0,0086 mol) được làm lạnh
tại nhiệt độ 0oC. Hỗn hợp phản ứng được nhỏ từ từ methanesufonyl chloride
(15,228 g; 0,1057 mol) trong 1h và khuấy tại 0oC trong 30 phút. Phản ứng
được nâng dần đến nhiệt độ phòng và khuấy tiếp trong 8 h. Phản ứng sau đó
được kiểm tra bằng bản mỏng TLC sau mỗi giờ phản ứng. Sau 8 h kết thúc,
phản ứng được xử lý bằng axit HCl 1N để đưa về môi trường trung tính, thêm
đá vào hỗn hợp phản ứng khuấ y ma ̣nh ở nhiêṭ đô ̣ 00C trong 4 h, sản phẩ m
dimesylthymidin đươ ̣c tủa ra. Lo ̣c tủa và rửa sản phẩ m bằ ng nước nhiề u lầ n,
làm khô bằ ng bơm hút chân không thu đươ ̣c sản phẩ m thô (14,8 g). Sản phẩ m
thô đươ ̣c kết tinh trong axeton nhiều lần thu được 13,7 g sản phẩm
dimesylthymidin, hiệu suất phản ứng đạt 78 %.
Quy trình tổng hợp và kết tinh dimesylthymidin trong axeton đã được
nghiên cứu lặp lại nhiều lần, hiệu suất của phản ứng 74-79%.
2.2.2. Tổng hợp oxetanthymidin
* Nguyên liệu
- Dimesylthymidin: 3,5 g
- Dung dịch NaOH 2N: 6,54ml
- Dung dịch HCl 12N: 10 ml
- Dung môi axeton: 30 ml
- Bản mỏng
*Thiết bị
- Bình phản ứng 250 ml: 01 cái
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Bình tam giác 200 ml: 02 cái
- Máy khuấy từ gia nhiệt
- Bơm chân không
- Phễu chiết 200 ml
- Máy cô quay dung môi
- Phễu lọc xốp
* Quy trình phản ứng
Dung dịch phản ứng gồm dimesylthymidin (3,50 g; 0,087 mol) và dung
dịch NaOH 2N (6,54 ml; 0,262 mol) được đun ta ̣i 50 0C trong 8h. Sau 8h kết
thúc phản ứng, hỗn hợp đươ ̣c làm la ̣nh đế n 0oC và trung hòa về môi trường
trung tính bằ ng HCl 12N(10ml). Cô quay bớt nước và chiết bằng dung môi
axeton (3 lần) thu được dung dịch sản phẩm. Cô quay dịch chiế t dưới áp suấ t
giảm thu đươ ̣c sản phẩm thô oxetanthymidin 1,56 g. Sản phẩm thô được kết
tinh trong dung môi axeton nhiều lần thu đươ ̣c sản phẩm sạch
oxetanthymidin.
Quy trình kết tinh thu được oxetanthymidin như sau: hòa tan 1,0g
oxetanthymidin trong 10 ml dung môi aceton. Hỗn hơ ̣p dung dịch đươ ̣c đun
hồi lưu cho đế n khi sản phẩ m tan hoàn toàn trong dung môi. Dung dich
̣ đươ ̣c
lo ̣c nóng để loại bỏ các tạp chấ t và sản phẩ m chưa tan hế t trong dung môi.
Dịch lọc được làm nguô ̣i ta ̣i nhiê ̣t độ phòng, sau đó làm la ̣nh ta ̣i nhiê ̣t đô ̣ âm 20 oC, trong 24 h để kế t tinh sản phẩ m. Sau 24h, sản phẩ m kết tinh ở da ̣ng
tinh thể hin
̀ h kim, màu trắ ng. Tinh thể đươ ̣c lo ̣c bằng phễu xốp, sấy khô trong
chân không thu đươ ̣c sản phẩ m sạch oxetanthymidin, hiệu suất kết tinh đạt
67%, sản phẩm có độ sa ̣ch >95%. Sản phẩm là chất rắn mầu trắng, điểm nóng
chảy: 192 oC.
2.2.3.Tổng hợp stavudin
* Nguyên liệu
- Oxetanthymidin: 1,5g

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




- Dung dịch DMF: 10 ml
- NaH trong dầu: 0,6g
- Dung dịch HCl 12N: 10 ml
- Dung môi axeton: 50 ml
- Bản mỏng
- Silical gel
*Thiết bị
- Bình phản ứng 100 ml: 01 cái
- Bình tam giác 100 ml
- Bếp khuấy từ gia nhiệt
- Bơm chân không
- Máy cô quay dung môi
-Phễu chiết 200 ml
- Phễu lọc xốp G3
* Quy trình phản ứng
Hỗn hợp dung dịch của oxetanthymidin (1,50 g; 0,00675 mol ) trong
dung môi DMF (10 ml) ta ̣i nhiêṭ đô ̣ phòng được thêm NaH (0,6 g; 0,025mol).
Phản ứng đươ ̣c khuấ y tại nhiêṭ độ 100 oC trong 8 h. Phản ứng đươ ̣c kiểm tra
bằng bản mỏng TLC sau mỗi giờ phản ứng. Sau 8 h, phản ứng được làm lạnh
về 0 oC và trung hòa về môi trường trung tính bằ ng HCl (12N). Cấ t loa ̣i nước
và chiết bằng dung môi axeton (3 lầ n). Cô quay dich
̣ chiết dưới áp suất giảm
thu đươ ̣c sản phẩ m thô (1,425 g). Sản phẩm thô được kết tinh trong dung môi
axeton thu đươ ̣c sản phẩ m stavudin (1,5 g) với hiê ̣u suất 78 % .

Quy trình tinh chế:
Hòa tan sản phẩ m (1,0g) trong axeton (8 ml), hỗn hơ ̣p đươ ̣c đun hồ i lưu
cho đế n khi sản phẩ m tan hoàn toàn trong dung môi. Dung dich
̣ đươ ̣c lo ̣c
nóng để loa ̣i bỏ các ta ̣p chấ t và sản phẩ m chưa tan hế t trong dung môi. Dich
̣
lo ̣c đươ ̣c làm nguô ̣i ta ̣i nhiê ̣t đô ̣ phòng, sau đó làm la ̣nh ta ̣i nhiê ̣t đô ̣ âm -20 oC
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




trong 24 h để kế t tinh sản phẩ m. Sau 24h tinh thể được lo ̣c phễu lo ̣c, hút khô
bằ ng bơm chân không thu được sản phẩ m sạch, hiệu suất kế t tinh phản ứng đạt
70%. Sản phẩm là tinh thể hình kim, mầu trắng; nhiệt độ nóng chảy: 164-165oC.
2.3. Phân tích cấu trúc và hàm lượng của stavudin và các sản phẩm trung
gian bằng phương pháp hóa lý hiện đại
2.3.1. Phân tích cấu trúc stavudin và các sản phẩm trung gian bằng
phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR,

13

C-NMR, khối phổ

MS, phổ hồng ngoại IR
* Hợp chất dimesylthymidin
O
4

3

HN

O 2 N1 6
O

5'

MsO

1'

4'
3' 2'

MsO

1

5

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  11,38 (1H, s, H-3); 7,51 (1H, s, H-

6); 6,23 (1H, t, J = 7 Hz, H-1’); 5,30 (1H, dd, J=7,5; 4,5Hz, H-3’); 4,46 (2H,
m, H-5’); 4,37 (1H, dd, J=4,5; 7,5Hz, H-4’); 3,32 (3H, s, CH3); 3,24 (3H, s,
CH3); 2,52 (2H, dd, J=7; 4,5Hz, H-2’); 1,79 (3H, s, CH3).
13

C-NMR (125 MHz, DMSO):  163,57 (C-4); 150,35 (C-2); 135,8 (C-

6); 110,05 (C-5); 84,07 (C-1’); 80,54 (C-4’); 79,35 (C-3’); 68,43 (C-5’);
37,71 (CH3); 36,84 (CH3); 35,99 (C-2’); 11,96 (CH3).
*Hợp chất oxetanthymidin
O
3

HN

5

O 2 N1 6
O

5'

O

4

1'

4'
3' 2'

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3):  8,9 (1H, bs, NH); 8,06 (1H, s, H-6);

6,68 (1H, m; H-1’); 5,58 (1H, m, H-3’); 4,96 (1H, m, Ha-5’); 4,82 (1H, dd,
J=3,5; 8Hz, Hb-5’); 4,20 (1H, d, J=8Hz, H-4’); 2,53 (2H, m, H-2’); 1,94 (3H,
s, CH3).
13

C-NMR (125 MHz, CDCl3):  163,61 (C-4); 151,35 (C-2); 136,35

(C-6); 111,82 (C-5); 88,79 (C-1’); 87,21 (C-3’); 80,61 (C-4’); 75,96 (C-5’);
38,19 (C-2’); 12,63 (CH3).
*Hợp chất Stavudin
O
3

HN

5

O 2 N1 6
O

5'

HO

4

1'

4'
3' 2'

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  11,28 (1H, s, NH); 7,64 (1H, s, H-

6); 6,82 (1H, m; H-1’); 6,39 (dd, 1H, J= 1,5; 5,5 Hz, H-2’); 5,91 (d, 1H, J =
5,5 Hz, H-3’); 5,01 (1H, t, J=5,5Hz, OH); 4,77 (1H, s, H-4’); 3,59-3,61 (m,
2H, 2H-5’); 1,72 (3H, s, CH3).
13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  163,88 (C-4); 150,81 (C-2); 136,78

(C-6); 134,95 (C-3’); 125,95 (C-2’); 108,99 (C-5); 88,90 (C-1’); 87,31 (C-4’);
62,28 (C-5’); 12,15 (CH3).
Phổ khối ESI-MS: m/z 225 [M+H]+ (C10H12N2O4).
IR (cm-1): 3170 (N-H); 3037 (O-H); 1683 (C=O); 1646 (C=O).
2.3.2. Phân tích hàm lượng của stavudin
* Phương pháp phân tích:
+ Tính chất:
Kiểm tra bằng cảm quan
+ Hàm lượng nước:
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Phương pháp Karl-Fischer. Cân khoảng 0,500g chế phẩm.
+ Định tính:
Dung dịch thử (phần định lượng) cho píc có thời gian lưu tương ứng
với thời gian lưu của pic Stavudin chuẩn.
+ Tro sulfat:
Cân khoảng 1,0g chế phẩm
+ Định lượng (Phương pháp sắc ký lỏng cao áp)
* Điều kiện sắc ký:
-Thiết bị: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
-Pha động: Acetonitril - Dung dịch Amoni axetat 0,77g/l (5 : 95).
-Cột: C18 (4,6 mm x 25 mm, 5µm)
-Detector: 254 nm
-Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút
-Thể tích tiêm: 20µl
* Tiến hành:
-Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 20 mg stavudin chuẩn vào
bình định mức 100 ml, thêm 60ml nước, siêu âm đến tan hết, làm vừa đủ bằng
nước. Hút chính xác 2ml dung dịch trên vào bình định mức 20ml và làm vừa
đủ bằng nước.
-Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 20 mg chế phẩm cho vào bình
định mức 100 ml, thêm 60ml nước, siêu âm đến tan hết, làm vừa đủ bằng
nước. Hút chính xác 2ml dung dịch trên vào bình định mức 20ml và làm vừa
đủ bằng nước.
Dung dịch chuẩn và thử được lọc qua màng lọc 0,45µm
Tiêm riêng biệt 20 µl mỗi dung dịch chuẩn và thử vào hệ thống sắc ký
và ghi lại sắc ký đồ.
Hàm lượng (%) Stavudin (C10H12N2O4) trong chế phẩm được tính theo diện
tích của pic chuẩn và thử, hàm lượng của chuẩn stavudin và hệ số pha loãng.

17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 . Phân tích và xác định cấu trúc của stavudin và các sản phẩm trung
gian đã tổng hợp được
Như đã viện giải trong phần tổng quan, thymidin là một nucleozit thiên
nhiên, hiên nay là nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp thuốc chống HIV/AIDS
zidovudin (AZT) và stavudin. Quy trình tổng hợp d4T từ nguyên liệu
thymidin qua 3 bước phản ứng như được mô tả trong sơ đồ 4.1. Từ kết quả
nghiên cứu bước đầu, chúng tôi đã đưa ra con đường tổng hợp stavudin từ
thymidin. Thymidin (12) được mesyl hoá tạo thành dimesylthymidin (13),
chất trung gian này được vòng hoá trong môi trường kiềm tạo thành
oxetanthymidin (7). Cuối cùng dưới tác dụng của bazơ, oxetanthymidin (7)
chuyển hoá thành stavudin (1).
O

O
4

3

HN

O 2 N1 6
O

5'

HO

O
O

MsCl, DMAP
MsO

1'

4'

HO

HN

5

N

o

pyridin, 0- 25 C, 8h

3' 2'

MsO

12

13(84%)

NaOH 2N, 50oC, 8h

O

O
HN

HN

HO

O
O

O
O

N
t-BuOH,KOH, MeOH

O

1100C, 6h
7 (75%)

1 (78%)

Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp stavudin
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



N