Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG THỊ THAO

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên – 5/ 2017


ii


iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi được thực
hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS.TS. Nguyễn Vũ
Thanh Thanh. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trong các tạp chí khoa học công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, tháng 3 năm 2017
Tác giả luận án
Hoàng Thị Thao

iv

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Chu Hoàng Mậu,
PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong
suốt quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ nghiên cứu
Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành các thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo
dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện
luận án. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các cán bộ Bộ phận
đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Nông - Lâm Bắc
Giang, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Nông học - Trường Đại học
Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học
tập và công tác.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động
viên, khích lệ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày

tháng 3 năm 2017

TÁC GIẢ
Hoàng Thị Thao


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... iv
MỤC LỤC ...............................................................................................................v
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. viii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................3
4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................................4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................5
1.1. CÂY ĐẬU XANH, MỌT HẠI ĐẬU XANH VÀ SỰ THIỆT HẠI DO
MỌT GÂY RA CHO ĐẬU XANH ................................................................5
1.1.1. Cây đậu xanh .................................................................................................5
1.1.2. Mọt đậu xanh và ảnh hưởng của mọt đến bảo quản hạt đậu xanh.................8
1.1.3. Đánh giá khả năng kháng mọt của đậu xanh ...............................................13
1.2. DEFENSIN THỰC VẬT ................................................................................14
1.2.1. Các nhóm defensin thực vật.........................................................................14
1.2.2. Cấu trúc của defensin thực vật .....................................................................16
1.2.3. Hoạt động ức chế của defensin thực vật ......................................................19

1.2.4. Một số nghiên cứu biểu hiện gen defensin thực vật ....................................23
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN
DEFENSIN THỰC VẬT Ở MỘT SỐ LOÀI ĐẬU THUỘC CHI VIGNA ...26
1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở một số loài đậu thuộc chi Vigna .............26
1.3.2. Hệ thống tái sinh in vitro và tạo cây đậu xanh chuyển gen .........................30


vi

1.3.3. Một số thành tựu chuyển gen defensin ở thực vật .......................................32
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................35
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................35
2.1.1. Vật liệu thực vật ...........................................................................................35
2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector ........................................................36
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .............................36
2.2.1. Hóa chất .......................................................................................................36
2.2.2. Các loại thiết bị máy móc ............................................................................36
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án................................................37
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................37
2.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu...37
2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide ..............39
2.3.3. Thiết kế vector chuyển gen ..........................................................................45
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens..................48
2.3.5. Nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen............................................53
2.3.6. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu ...................................................56
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................56
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1
CỦA CÂY ĐẬU XANH ...............................................................................57
3.1.1. Khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu ..........................57
3.1.2. Khuế ch đa ̣i và tách dòng gen VrPDF1 từ giố ng đậu xanh Tằ m TH và ĐX22 61

3.1.3. Đă ̣c điể m của gen VrPDF1 phân lâ ̣p từ hai giố ng đâ ̣u xanh Tằm TH và ĐX22 62
3.1.4. Thảo luận về cấu trúc của protein defensin .................................................67
3.1.5. Sự đa dạng về trình tự nucleotide trong vùng mã hoá của gen VrPDF1 ở
cây đậu xanh ...............................................................................................68
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VrPDF1 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT
ĐỘNG CỦA VECTOR CHUYỂN GEN TRÊN CÂY THUỐC LÁ ............71
3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện ở hạt thực vật mang gen VrPDF1 bằng kỹ thuật
Gateway ......................................................................................................71


vii

3.2.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen in vitro mang gen VrPDF1 ...........................74
3.2.3. Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 ở các dòng cây
thuố c lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR và Southern blot..........................77
3.2.4. Phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trên cây thuốc lá
chuyển gen ở thế hê ̣ T1 ...............................................................................79
3.3. TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI
TỔ HỢP VrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22 .......................................84
3.3.1. Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen ....84
3.3.2. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển VrPDF1 trong hệ gen
cây đậu xanh chuyển gen ............................................................................87
3.3.3. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển VrPDF1 trong các dòng cây đậu
xanh chuyển gen T1 ....................................................................................90
3.3.4. Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt của protein tái tổ
hợp rVrPDF1 ở thế hệ T1 ...........................................................................92
3.3.5. Thảo luận kết quả tăng cường biểu hiện protein VrPDF1 ở cây đậu xanh
chuyển gen ..................................................................................................95
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................100
1. Kết luận ............................................................................................................100

2. Đề nghị .............................................................................................................100
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................101
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................102


v

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
µg

Microgam

AS

Acetylseringone

BAP

Benzylaminopurine

bp

Base pair

cs

Cặp bazơ nitơ
Cộng sự

CCM

Cocultivation medium

Môi trường đồng nuôi cấy

cDNA

Complementary DNA

DNA bổ sung

CTAB

Hexadecyltrimethyl ammonium
bromide

Cys

Cysteine

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent
assay

Xét nghiệm ELISA

GM

Germination Medium

Môi trường nảy mầm

Gus

β-Glucuronidase

HRP

Horseradish Peroxidase

IAA

Indole Acetic acid

IPTG

Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria Bertani

Môi trường dinh dưỡng cơ bản
nuôi cấy vi khuẩn

MS

Murashige và Skoog, 1962

Môi trường dinh dưỡng cơ bản
nuôi cấy mô thực vật

vi

mRNA

Messenger ribonucleic acid

NAA

Naphthaleneacetic acid

NptII

Neomycyn phosphatranferaseII

Gen kháng kanamycine

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

PDF1

Plant defensin type 1

Gen defensin 1 ở đậu xanh

RNA

Ribonucleic acid

RM

Rooting medium

Môi trường tạo rễ

RT-PCR

Reverse transcription polymerase
chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase phiên
mã ngược

rVrPDF1

Recombinant VrPDF1 protein

Protein defensin tái tổ hợp VrPDF1

ScFv

Single-chain variable fragment

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SEM

Shoot Elongation Medium

Môi trường kéo dài chồi

SIM

Shoot Induction Medium

Môi trường tạo đa chồi

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq DNA
polymerase

Thermus aquaticus DNA
polymerase

T-DNA

Transfer DNA

Đoạn DNA được chuyển vào thực
vật

Ti-plasmid

Tumor inducing – plasmid

Plasmid gây khối u

T0, T1

Các thế hệ cây chuyển gen

T0

Cây chuyển gen tái sinh từ chồi
trong ống nghiệm

T1

Hạt của cây chuyển gen T0 nảy
mầm thành cây T1

TMB

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

v/p

Vòng /phút

WT

Wild type

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalacto-pyranoside

Kiểu dại


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số thực vật chuyển gen defensin ....................................................... 33
Bảng 2.1. Nguồn gốc các giống đậu xanh nghiên cứu ............................................. 35
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong PCR ................ 39
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................... 41
Bảng 2.4. Các thành phần bổ sung phản ứng tổng hợp cDNA................................. 41
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR nhân gen VrPDF1 ........................................ 42
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen VrPDF1 ........................................... 42
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 vào vector tách dòng pBT ...... 43
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 với vector pDON201SLHEP-HA.......................................................................................................... 46
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng LR ......................................................................... 47

Bảng 2.10. Thành phần các môi trường nuôi cấy in vitro cây đậu xanh .................. 51
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh qua
các thời gian nhiễm mọt.......................................................................... 59
Bảng 3.2. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của gen VrPDF1 ........ 64
Bảng 3.3. Các vị trí amino acid sai khác giữa ba trình tự amino acid suy diễn
của gen VrPDF1 ..................................................................................... 65
Bảng 3.4. Thống kê một số trình tự gen PDF1 sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền....... 69
Bảng 3.5. Hê ̣ số tương đồ ng và hê ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u xanh dựa trên
triǹ h tự nucleotide của gen VrPDF1 ....................................................... 69
Bảng 3.6. Hê ̣ số tương đồ ng và hê ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u xanh dựa trên
triǹ h tự amino acid suy diễn của gen VrPDF1 ....................................... 70
Bảng 3.7. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso -VrPDF1 vào mô lá thuốc lá ...... 76
Bảng 3.8. Hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ
với dịch chiết protein từ hạt của các dòng cây thuốc lá chuyển gen
và từ hạt cây không chuyển gen ............................................................. 82
Bảng 3.9. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 ...... 86
Bảng 3.10. Hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ
với dịch chiết protein từ hạt của các dòng đậu xanh chuyển gen T1
và từ hạt cây không chuyển gen ............................................................. 93


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc tiền protein của hai lớp defensin thực vật ....................... 17
Hình 1.2. Cấu trúc không gian của protein defensin ở động vật, côn trùng và
thực vật. .................................................................................................. 18
Hình 1.3. Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2) ................................. 19
Hình 1.4. Mô hình cấu trúc defensin VrD1 ở cây đậu xanh..................................... 25

Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu ................................................... 35
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang gen kháng mọt VrPDF1 ............ 45
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen ở cây đậu xanh ...................... 500
Hình 3.1. Biểu đồ so sánh khối lượng hao hụt giữa các giống đậu xanh sau
các thời điểm nhiễm mọt. ....................................................................... 57
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 của hai
giố ng đậu xanh Tằ m TH và ĐX22.. ....................................................... 61
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân gen VrPDF1
từ các dòng khuẩ n la ̣c E. coli DH5 ...................................................... 62
Hình 3.4. Trình tự nucleotide gen VrPDF1 (cDNA) của hai giống đậu xanh
Tằm TH, ĐX22 và trình tự mang mã số AB020613 trên GenBank ...... 63
Hình 3.5. Trình tự amino acid suy diễn từ gen VrPDF1 của hai giố ng đậu
xanh Tằ m TH, ĐX22 và đoạn trình tự mang mã số AB020613 ............. 64
Hin
̀ h 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen VrPDF1 phân lập từ mRNA
và DNA của giống đậu xanh Tằ m TH và ĐX22 .................................... 66
Hình 3.7. Sơ đồ các cầu nối disulfide giữa các cặp Cys trong vùng chức năng
của protein VrPDF1 ................................................................................ 68
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide
của gen VrPDF1 của các giống đậu xanh............................................... 70
Hình 3.9. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự amino
acid của gen VrPDF1.............................................................................. 71
Hình 3.10. Sơ đồ cấ u trúc vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 và kế t quả điê ̣n
di sản phẩ m colony-PCR kiể m tra vector pDON201-SLHEPVrPDF1. .................................................................................................. 72


ix
Hình 3.11. Sơ đồ một đoạn trong cấ u trúc vector pBetaPhaso-VrPDF1;Kế t
quả điê ̣n di sản phẩ m PCR kiể m tra vector chuyể n gen
pBetaPhaso-VrPDF1............................................................................... 73

Hin
̀ h 3.12. Sơ đồ tóm tắt quy trình chuyển cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào
mô lá thuốc lá giống K326 và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen. ........... 75
Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ dòng
cây thuốc lá được chuyển gen ở thế hê ̣ T0.. ........................................... 77
Hin
̀ h 3.14. Kế t quả phân tích cây thuố c lá chuyể n gen bằ ng lai Southern .............. 78
Hình 3.15. Kết quả lai Western của protein hạt từ mô ̣t số dòng thuốc lá
chuyển gen thế hệ T1. ............................................................................. 80
Hình 3.16. Biể u đồ so sánh hàm lươ ̣ng protein rVrPDF1 tái tổ hơ ̣p giữa các
dòng thuố c lá chuyể n gen.. ..................................................................... 81
Hình 3.17. Biểu đồ so sánh kết quả thử nghiệm hoạt động ức chế của
rVrPDF1 đối với -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh.. ........................ 83
Hình 3.18. Hiǹ h ảnh các giai đoạn biến nạp và tái sinh cây đậu xanh chuyển gen......... 85
Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ các
dòng cây đậu xanh được chuyển gen ở thế hê ̣ T0 .................................. 88
Hình 3.20. Kết quả phân tích Southern blot của DNA tổng số các cây đậu xanh
chuyển gen VrPDF1 với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin. ....... 89
Hình 3.21. Kết quả phân tích Western blot từ 3 dòng đậu xanh chuyển gen thế
hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen. ........................................... 92
Hình 3.22. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp
VrPDF1 của ba dòng đậu xanh chuyển gen và cây đối chứng
không chuyển gen. .................................................................................. 92
Hình 3.23. Hình ảnh phân tích định tính khả năng ức chế α-amylase ấu trùng
mọt đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrDEF1 từ hạt cây đậu xanh
chuyển gen ĐX22 thế hệ T1 và hạt cây đậu xanh ĐX22 đối chứng
không chuyển gen. ................................................................................. 94
Hình 3.24. Biểu đồ so sánh hiệu suất hoạt động -amylase và hiệu suất ức chế
-amylase của protein defensin trong hỗn hợp -amylase từ ấu

trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen, cây
không chuyển gen ................................................................................... 99


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu xanh là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt,
đứng sau đậu tương và lạc. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm. Hạt đậu
xanh vừa cung cấp protein cho con người, vừa có giá trị trong y học, và cũng là
cây có giá trị trong cải tạo đất, bởi rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi khuẩn
cố định đạm sống cộng sinh. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, khí hậu
thường nóng ẩm. Đây là điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp, tuy
nhiên cũng là yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm
trọng tới năng suất và phẩm chất nông sản. Theo ước tính, tổn thất sau thu hoạch
khoảng từ 10% - 30% sản lượng cây trồng nông nghiệp. Điều này có nghĩa là
khoảng 10% - 30% lượng lương thực không bao giờ được sử dụng và cũng là tỷ lệ
tổn thất của công sức và tài chính đầu tư trong sản xuất nông nghiệp. Lượng nông
sản bị hao hụt này có thể ảnh hưởng đến an ninh lương thực của một phần dân số
thế giới. Do đó, việc đánh giá và hạn chế tổn thất sau thu hoạch là công tác rất có
ý nghĩa trong việc đảm bảo lương thực, thực phẩm trong điều kiện hạn chế diện
tích trồng trọt và dân số đang gia tăng hiện nay.
Đối với nhóm nông sản là hạt thì một trong những nguyên nhân chính gây
tổn thất đến số lượng và chất lượng hạt là côn trùng mà chủ yếu là một số thuộc
Bộ cánh cứng (thường gọi là mọt). Các loài mọt gây hại chủ yếu cho đậu đỗ là:
mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.), mọt đậu đỏ (Callosobruchus
maculatus F.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus)…Trong đó, mọt đậu
xanh Callosobruchus chinensis (L.) thuộc họ Bruchid, bộ Coleoptera là loài gây
hại chủ yếu cho hạt đậu xanh. Ngoài ra, mọt đậu xanh còn gây hại trên các loại

đậu khác như: đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen … Mọt có thể gây thành dịch từ
một số lượng nhỏ cá thể do khả năng sinh sản lớn và thời gian phát triển cá thể
ngắn. Sự tổn hại do mọt gây ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ mọt đậu nói
chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cần được quan tâm nghiên
cứu. Trong công tác chọn tạo giống thì bên cạnh yếu tố năng suất cao và chất


2

lượng tốt thì khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh trong đó có khả năng
khá ng mọt ở hạt là vấn đề cần thiết trong lĩnh vực chọn giống đậu đỗ nói chung
và chọn giống đậu xanh nói riêng.
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả năng kháng
mọt, kháng nấm, kháng virus trên một số loại cây trồng trong đó có đậu xanh. Tuy
nhiên, những nghiên cứu ở đậu xanh mới tập trung đánh giá về mức độ thiệt hại mà
còn ít nghiên cứu về cơ chế phân tử của tính chống chịu sinh vật hại nói chung và
tính kháng mọt nói riêng. Theo các nghiên cứu đã công bố, đặc tính kháng mọt hại
hạt của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin.
Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp cuộn ba
chiều qua 8 cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật hoạt động mạnh sẽ
tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác động đến hoạt động
của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật… Cơ chế gây độc của defensin
đối với mọt đậu xanh là sự cản trở hoạt động phân giải tinh bột của -amylase trong
ruột mọt và ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt, ức chế sự sinh trưởng phát triển
của mọt. Ngoài ra, defensin thực vật còn ức chế sự phát triển của một loạt các loại
nấm và một số loại virus gây hại cây lương thực.
Defensin trong hạt đậu xanh có hàm lượng thấp và khác nhau giữa các giống, vì
thế để tăng hiệu quả ức chế α-amylase của ruột ấu trùng mọt, việc ứng dụng công nghệ
gen nhằm tăng cường biểu hiện gen, nâng cao hàm lượng defensin trong hạt được quan
tâm nghiên cứu. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài

luận án là: “Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(i) Phân tích đươ ̣c đặc điểm của gen defensin 1 (VrPDF1) phân lập từ các giống đậu
xanh Viê ̣t Nam có khả năng kháng mọt khác nhau.
(ii) Biể u hiê ̣n đươ ̣c gen VrPDF1 trên cây thuố c lá chuyển gen.
(iii) Tạo được cây đậu xanh chuyển gen chứa gen VrPDF1 liên quan đến tính kháng
mọt Callosobruchus chinensis (L.).


3

3. Nội dung nghiên cứu
i) Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống đậu xanh trồng phổ
biến ở miền Bắc Việt Nam. Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen
VrPDF1 phân lập từ cây đậu xanh. Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide, trình tự
amino acid suy diễn của gen VrPDF1 phân lập từ giống đậu xanh có khả năng
kháng mọt tốt nhất và giống đậu xanh kháng mọt kém nhất.
ii) Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1 và phân tích hoạt động của
vector chuyển gen trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1.
iii) Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa gen VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen.
Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong cây đậu xanh chuyển gen ở thế hệ
T1.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ đánh
giá và phân nhóm các giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác nhau; phân lập,
tách dòng gen VrPDF1 đế n thiế t kế vector chuyển gen thực vậtđặc rưng biểu hiện ở
hạt, ta ̣o cây chuyể n gen và phân tić h sự biể u hiê ̣n gen chuyể n VrPDF1, cu ̣ thể là:
1) Đã phân lập được gen VrPDF1 từ DNA hệ gen của hai giống đậu xanh có khả năng
kháng mọt khác biệt nhau. Gen VrPDF1 có kích thước 356 bp gồm 1 intron (128 bp)
xen giữa 2 exon (228 bp); cDNA VrPDF1 có 228 bp, mã hóa 75 amino acid.

2) Protein tái tổ hơ ̣p rVrPDF1 được biể u hiê ̣n trên cây thuố c lá chuyể n gen và dịch
chiết chứa protein rVrPDF1 từ hạt dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả năng ức chế
-amylase của ruột ấu trùng mọt.
3) Ta ̣o đươ ̣c cây đâ ̣u xanh chuyển gen từ giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1
ở thế hệ T1 và biể u hiê ̣n thành công protein tái tổ hơ ̣p rVrPDF1. Chứng minh được
dịch chiết chứa protein tái tổ hơ ̣p rVrPDF1 từ hạt biểu hiện ức chế -amylase của
ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase ở hai dòng chuyển gen DX1-3 và DX1-7
tăng 166,40 % và 178,19% so với cây không chuyển gen.


4

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen
VrPDF1 phân lập từ các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác
nhau. Sự tăng cường biểu hiê ̣n protein tái tổ hơ ̣p rVrPDF và biể u hiê ̣n khả năng ức
chế -amylase ở ruột ấu trùng mọt của protein này từ cây chuyển gen là những cơ
sở khoa học để khẳng định hiệu quả của viê ̣c ứng du ̣ng công nghệ gen nhằ m nâng
cao khả năng kháng mọt của đậu xanh nói riêng và cây trồng thu hạt nói chung.
5.2. Về mặt thực tiễn
Các trình tự gen VrPDF1 phân lập được, cấ u trúc vector chuyển gen thực vâ ̣t
mang gen VrPDF1, các dòng cây chuyển gen ở T1, dịch chiết chứa rVrPDF1 từ hạt
có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt đã góp phần giải quyết những
vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng kháng
mọt của cây đậu xanh, mở ra triển vọng ứng du ̣ng công nghê ̣ sinh học hiện đại vào
thực tiễn chọn giống cây trồng thu hạt ở Việt Nam.


5

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU XANH, MỌT HẠI ĐẬU XANH VÀ SỰ THIỆT HẠI DO MỌT
GÂY RA CHO ĐẬU XANH

1.1.1. Cây đậu xanh
Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck] thuộc ngành Magnoliophyta, lớp
Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna. Chi Vigna là một trong những
chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna, Haydonia, Plactropic,
Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis. Đậu xanh bao gồm các
loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn được gọi là nhóm đậu châu Á, bao gồm
16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V. aconitifolia, V.
angularis, V. umbellata [11], [16]. Đậu xanh có bộ nhiễm sắc thể 2n = 22, là loại
cây ăn hạt, thân thảo. Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở
các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương. Dạng dại của V. radiata cũng
được tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [11].
Bên cạnh những cây lương thực như lúa, ngô, lạc…thì đậu xanh cũng là loài
cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng
23 - 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 56 - 60,2%, nước và các chất
khoáng cùng nhiều loại vitamin. Các sản phẩm chế biến từ đậu xanh không chỉ phù
hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu. Lá non và
ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa. Thân, lá xanh có thể
dùng làm thức ăn cho vật nuôi [1], [2]. Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học,
vỏ hạt đậu xanh có vị ngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải
bách độc [17]. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ
hệ rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có
khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại lượng
đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở
nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [15].

6

Cây đậu xanh gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Hệ rễ đậu xanh
thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính thường ăn sâu khoảng
20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thường
gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm. Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa
vi khuẩn cổ định đạm Rhizobium. Trung bình mỗi vụ, 1 ha đậu xanh có thể bù lại
cho đất tương ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn [12], [13].
Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có màu xanh
hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc [15]. Lá
cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi thân chính có 7 - 8
lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn. Lá thật hoàn chỉnh gồm
có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên và dưới của lá đều có lông bao phủ
[15]. Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to, xếp xen
kẽ nhau ở trên cuống. Hoa đậu xanh thường nở rải rác nên người ta chia hoa đậu
xanh thành 3 nhóm: Nhóm ra hoa không tập trung hoa nở liên tiếp trên 30 ngày,
nhóm ra hoa tập trung hoa nở kéo dài trong khoảng 16 ngày trở lại, nhóm 3 là nhóm
ra hoa trung gian hoa nở trong khoảng 16 - 30 ngày [15]. Quả đậu xanh thuộc loại
quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài 8 14 cm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2 gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có
một số hơi cong, khi còn non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc
xám đen, đen. Mỗi cây có từ 8 - 35 quả, mỗi quả có từ 8 - 15 hạt [1], [12]. Hạt không
nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ
hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non. Mầm non là nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn,
thân chính và lá kép đầu tiên. Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và
có nhiều màu sắc khác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc,
vàng bóng nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả [1].
Hạt đậu xanh có giá trị dinh dưỡng cao, trong hạt đậu xanh có chứa tương
đối đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho con người và gia súc. Thành phần

hóa học của hạt đậu xanh thay đổi phụ thuộc vào giống, điều kiện khí hậu, điều


7

kiện canh tác, và vị trí của hạt ở trong quả. Các chất hữu cơ trong hạt đậu xanh
bao gồm protein, glucid, lipid, vitamin, enzyme, và một số chất màu. Trong 100
gam hạt đậu xanh có khoảng 23,4g protein, 53,1g glucid, 2,4g lipid. Các chất vô
cơ gồm nước, muối khoáng [15], [17].
Protein chiếm hơn 90% các hợp chất chứa nitơ của hạt còn các chất phi
protein có hàm lượng không đáng kể. Protein đậu xanh có: protein hòa tan trong
nước (chiếm 71 - 79 % protein tổng sô); protein hòa tan trong dung dịch muối (chiếm
5 - 10% protein tổng số); protein hòa tan trong dung dịch kiềm (chiếm 4 - 8% protein
tổng sô). Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như
leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, valine nhưng hàm lượng
cysteine và methionine lại thấp [15], [17].
Glucid đậu xanh chứa chủ yếu là tinh bột và các thành phần khác với hàm
lượng rất thấp không đáng kể. Tinh bột đậu xanh bao gồm 2 cấu tử là amylose và
amylopectin. Trong đó amylose có hàm lượng tương đối cao, chiếm khoảng 45 50%. Tinh bột đậu xanh được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm như chế
biến các sản phẩm miến đậu xanh, bột đậu xanh, cháo đậu xanh ăn liền...[15], [17].
Hàm lượng lipid trong đậu xanh rất thấp nhưng có ảnh hưởng rất lớn đến
chất lượng của hạt, bột và sản phẩm chế biến. Chất béo của hạt có giá trị tương đối
cao vì trong thành phần của nó có 20 axit béo trong đó chứa nhiều axit béo chưa no
không thay thế như axit linoleic [15].
Hạt đậu xanh chứa nhiều vitamin như vitamin A, B1, B2, B6, C, D,
PP…Hàm lượng vitamin trong các sản phẩm được chế biến từ đậu xanh phụ thuộc
nhiều vào kỹ thuật và phương tiện chế biến. Nghiên cứu cho thấy có sự mất mát
vitamin từ 20 - 35% trong quá trình chế biến và 10 - 15% trong quá trình bảo quản
[15], [17].
Chất khoáng tập trung chủ yếu ở phần vỏ hạt gồm có Na, ca, Mg, P, Cu, Zn,

Fe, Mn…Ngoài ra, trong hạt đậu xanh còn chứa các enzyme như lipase, transferase,
hydrolase, lypoxygenase…[15], [17].


8

1.1.2. Mọt đậu xanh và ảnh hưởng của mọt đến bảo quản hạt đậu xanh
1.1.2.1. Đặc điểm của mọt gây hại đậu xanh
Mọt đậu xanh có tên khoa học là Callosobruchus chinensis Linne thuộc họ
mọt đậu (Bruchidae), bộ cánh cứng (Coleoptera). Mọt đậu xanh là loài đa thực, ăn
hại các loại đậu và các sản phẩm dược liệu có nguồn gốc thực vật như: đậu xanh,
đậu tằm, đậu đũa, đậu hà lan, đậu đen, hạt sen, đậu tương.... Trong đó, đậu xanh và
hạt sen là bị thiệt hại nặng nhất. Loài mọt này có mặt khắp nơi trên thế giới, các
vùng trồng đậu xanh ở nước ta đều có loại mọt này. Mọt đậu xanh thường có mặt
ngoài đồng ruộng vào thời gian đậu xanh sắp thu hoạch [5], [39], [154], [157].
Về đặc điểm hình thái, mọt đậu xanh thuộc nhóm biến thái hoàn toàn, chu kỳ
sống của chúng gồm 4 pha phát dục là trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành [5], [39].
Mọt trưởng thành: con đực dài trung bình 2,5 mm, rộng 1,64 mm, con cái dài
trung bình 3 mm, rộng 1,8 mm. Thân hình bầu dục ngắn, toàn thân màu đen nâu,
màu nâu đỏ hay trà nâu, có nhiều lông nhỏ màu đen nâu, màu vàng nâu hay màu
trắng xám. Ðầu nhỏ, quặp về phía trước. Râu đầu có 11 đốt, râu con cái hình răng
cưa, râu con đực hình răng lược. Gốc râu, thân râu màu hồng nâu. Ðầu màu nâu tối,
phủ đầy chấm lõm và lông nhung màu vàng kim. Mép sau ngực trước ở giữa có 2
khóm lông hình bầu dục dài màu xám trắng. Mắt lồi, ngực trước có hình chóp cụt,
mặt lưng lồi tròn, cánh không che hết phần bụng. Trên hai rãnh của đốt đùi chân sau
có 2 răng, răng ngoài tù, răng trong dài và thẳng [5], [39], [154].
Trứng có hình bầu dục, một đầu to, một đầu nhỏ, chiều dài từ 0,4 - 0,6 mm
và chiều rộng 0,28 - 0,4 mm, màu vàng nhạt [5], [39].
Sâu non có 4 tuổi, màu sắc thay đổi tùy theo độ tuổi. Sâu non tuổi một có
chân rất nhỏ, tạm thời không phân đốt. Khi đẫy sức sâu non có chiều dài khoảng 3,5

mm, có màu trắng sữa, mập, có hình chữ C [5], [154].
Nhộng trần dài 3 - 3,5 mm, hình bầu dục to và mập, có nhiều lông nhỏ màu
vàng nhạt, đầu cong xuống [5], [39], [157].
Về đặc tính sinh vật học, trưởng thành mọt đậu xanh đẻ trứng vào các hạt mà
quả đã bị khô nứt vỏ hoặc vỏ bị côn trùng ăn hại bỏ sót lại. Sau một thời gian ngắn


9

thì trứng nở thành sâu non, sâu non ăn phần thịt của hạt và làm cho hạt rỗng, phân
thải ra trong quá trình này làm cho hạt bị biến đổi thành màu vàng nâu hoặc nâu
đen. Sâu non khi đẫy sức hóa nhộng, vũ hóa ngay trong hạt, trưởng thành sau vũ hóa
một ngày chui ra từ một lỗ tròn ở vỏ hạt. Con đực chui ra được hơn nửa giờ bắt đầu
giao phối, sau giao phối khoảng hơn 5 giờ con cái bắt đầu đẻ trứng. Mọt có thể đẻ
trứng trên quả ở ngoài đồng hay trên hạt ở trong kho, có thể đẻ liên tục 2 - 3 quả trên
cùng 1 hạt. Thời gian các pha phát dục của mọt là: giai đoạn trứng từ 4 - 15 ngày,
trung bình 6 ngày. Giai đoạn sâu non từ 13 - 34 ngày. Giai đoạn nhộng từ 3 - 18 ngày.
Thời gian sống của mọt trưởng thành phụ thuộc vào các yếu tố sinh thái, đặc biệt là
yếu tố nhiệt độ và độ ẩm. Trung bình trưởng thành sống được từ 36 đến 39 ngày
trong điều kiện mùa đông và 6 đến 7 ngày trong điều kiện mùa hè. Mọt phát dục thích
hợp nhất ở 22oC - 29,5oC và độ ẩm 88 - 100 % [150] . Mọt không có khả năng đẻ
trứng khi nhiệt độ dưới 10oC, và trên 37oC [150]. Vòng đời của mọt đậu xanh phụ
thuộc vào các yếu tố như độ nhiệt, độ ẩm và thức ăn, thời gian từ 18 - 60 ngày.
Trong điều kiện hoàn toàn thích hợp, một con cái có thể đẻ từ 80 - 100 trứng. Nếu
điều kiện không thích hợp, thì vòng đời của mọt có thể kéo dài đến 196 ngày. Tập
tính của mọt đậu xanh đã được nghiên cứu chi tiết về tập tính giao phối của con đực
[79], nghiên cứu về vai trò của con đực đối với khả năng sinh sản của con cái [39].
Mỗi năm mọt đậu xanh thường có từ 4 - 5 lứa, có thể có từ 8 - 11 lứa (nếu trong điều
kiện thích hợp).
Về đặc điểm sinh thái học

Theo Chavan và cs (1997), mọt trưởng thành có đời sống ngắn, khoảng 12
ngày trong điều kiện thích hợp. [42]. Vòng đời khoảng 22 đến 25 ngày trong điều
kiện thích hợp. Nhiệt độ thích hợp cho mọt đậu xanh đẻ trứng là ở 23oC. Trứng dính
chặt vào vỏ của hạt ký chủ, những giống có vỏ hạt nhẵn phù hợp cho sự đẻ trứng
hơn những giống có vỏ hạt ráp [42], [103]. Sau khi đẻ 5 - 6 ngày thì trứng bắt đầu
nở [63]. Theo Borikar và cs (1996), Yongxue và cs (1998b) mọt đậu xanh được
nuôi dễ dàng trong phòng thí nghiệm và sự phát triển của nó bị ảnh hưởng lớn bởi
nhiệt độ và độ ẩm [34], [150].


10

Ấu trùng phát triển hoàn toàn trong một hạt, tạo thành hang khi phát triển.
Nhiệt độ tối thích cho mọt đậu xanh phát triển là 37oC và độ ẩm 90%. Thời gian
phát triển tối thiểu là 22 - 23 ngày. Sự xâm nhiễm thường xảy ra trên đồng
ruộng, trứng được đẻ trên vỏ quả khi chín [95], [117]. Khi quả khô khả năng xâm
nhiễm của mọt giảm [39].
Nghiên cứu về sự cạnh tranh giữa loài C. chinensis và C. maculatus, Koichi
fujii (1967) cho thấy, trong điều kiện nhiệt độ 30oC và độ ẩm 70% bổ sung thêm
thức ăn ở các khoảng thời gian khác nhau thì không thấy có kết quả về của sự cạnh
tranh giữa hai loài [73]. Cũng ở điều kiện trên, khi sử dụng hai nguồn thức ăn khác
nhau là đậu khô (hàm lượng nước là 11%) và đậu thường (hàm lượng nước khoảng
15%) thì cũng không thấy có sự khác nhau về kết quả cạnh tranh thức ăn. Nhưng ở
điều kiện nhiệt độ 32oC và độ ẩm 64% thì thấy có kết quả của sự cạnh tranh, do sự
khác nhau về tỷ lệ phát triển và số lượng trứng giữa hai loài.
1.1.2.2. Tác hại của mọt trong quá trình bảo quản đậu xanh
Sau khi thu hoạch, hạt đậu xanh cần được bảo quản để sử dụng làm lương
thực, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nhiều mục đích khác nhau, mà thiệt hại do
côn trùng gây ra trong qúa trình bảo quản hạt có thể lên tới 5 - 10% (ở khu vực ôn
đới) và 20 - 30% (ở khu vực nhiệt đới) [5], [96]. Đặc biệt, với đặc điểm khí hậu

nước ta nóng ẩm quanh năm, có nhiều loại mọt hại đậu xanh trong kho bảo quản
nhưng mọt đậu xanh loài C. Chinensis là đối tượng gây hại nghiêm trọng nhất,
chúng có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh và có sức sinh sản
nhanh. Sự xâm nhiễm có thể bắt đầu từ ngoài đồng trước khi thu hoạch, sau đó theo
vào trong kho bảo quản. Sự lây nhiễm có thể làm giảm đáng kể về khối lượng, chất
lượng và hàm lượng protein của hạt [154]. Ngoài ra nó còn gây hại nghiêm trọng
đối với các loại đậu đỗ khác, như: đậu tương, đậu hà lan, đậu đũa và đậu năng, đậu
đỏ, đậu đen... Ngoài ra, mọt đậu xanh còn gây hại trên hạt bông, lúa miến và ngô
[29]. Cả mọt trưởng thành và sâu non đều gây hại. Khối lượng hạt bị hao hụt do mọt
có thể lên đến 55 - 60% [52] và hao hụt về hàm lượng protein là 45,50 - 66,30%
[73]. Một sâu non có thể gây hại vài hạt đậu [63]. Trong trường hợp bị nhiễm mọt,


11

hạt bị mất khả năng nảy mầm và không sử dụng được. Khi bị xâm nhiễm nặng, thiệt
hại có thể lên đến 100% và chỉ còn lại phần vỏ hạt. Nghiên cứu sự thiệt hại về chất
lượng của hạt đậu xanh kết quả cho thấy sự thiệt hại có thể lên tới 90%. Tỷ lệ thiệt
hại hạt đậu xanh trong quá trình bảo quản do C. chinensis ở Pakistan gây ra là
12,18% [56].
1.1.2.3. Một số biện pháp phòng trừ mọt hại đậu xanh
Sau khi thu hoạch hạt đậu xanh được bảo quản chủ yếu ở dạng hạt khô và
hạt khô dễ bị tấn công bởi mọt, gây ra thiệt hại lớn. Hiện nay người ta có thể sử
dụng nhiều biện pháp khác nhau để phòng trừ mọt đậu xanh. Nhưng có hai
phương pháp được sử dụng phổ biến nhất đó là phương pháp hóa học và phương
pháp vật lý [33].
Phòng trừ bằng hóa học
Có thể xử lý hạt bằng xông hơi methyl bromide hoặc phosphine, mặc dù sự
đăng ký sử dụng sản phẩm này ở nhiều khu vực có thể bị hạn chế hoặc bị cấm
[118]. Philips (1994) cho rằng, biện pháp hóa học có hiệu quả rất cao đối với mọt

đậu, có thể đạt 90 - 99% với các loại thuốc hóa học thuộc nhóm lân hữu cơ và
pyrethroid. Các hoá chất pyrethrin là những hợp chất hữu cơ thiên nhiên mà có chứa
hoạt tính diệt côn trùng mạnh [109].
Việc sử dụng bừa bãi thuốc hóa học trừ côn trùng dẫn đến một số vấn đề như
tăng tính kháng thuốc của côn trùng, các tàn dư độc hại trên hạt, gây ô nhiễm môi
trường và tăng chi phí. Do đó, hiện nay người ta quan tâm nhiều đến việc sử dụng
các chất có hoạt chất sinh học được chiết xuất từ thực vật. Việc trộn hạt với dầu
thực vật, tro hoặc lá có mùi thơm cũng có hiệu quả trong việc hạn chế tác hại của
mọt đậu xanh [73]. Một số các loài cây, sản phẩm chiết xuất từ cây có tác dụng hạn
chế tác hại của mọt đậu xanh và các loài dịch hại thuộc họ Bruchidea khác như: cây
keo Ả Rập (Acacia nilotica), cây thủy xương bồ (Acorus calamus), Cây cỏ xước
(Achyranthus aspera), cây gội nước (Amoora rohituka), Cây cốt khí muồng (Cassia
occidentalis), cây bạch đàn trắng lá nhỏ (Eucalyptus tereticornis), cây hoa ngũ sắc
(Lantana camara), cây lanh (Linum usitatissinum),...[39].


12

Hóa chất có nguồn gốc thực vật được biết đến phổ biến nhất là azadirachtin,
chất này được dùng riêng ở dạng thuốc thảo mộc hoặc ở dạng hỗn hợp như một
thành phần của lá hoặc dạng chiết xuất của cây xoan ấn độ (Azadirachta indica).
Azadirachtin có tác dụng hạn chế sự đẻ trứng và tiêu diệt sâu non và mọt trưởng
thành. Dầu của cây xoan Ấn độ và chất chiết xuất khác có thể sử dụng trực tiếp để
bảo quản hạt đậu xanh [155].
Trong bảo quản hạt đậu xanh, Farid Asif Shaheem (2006) đã nghiên cứu hiệu
quả sử dụng bột ớt, bột oliu và bột lá chè xanh trong phòng chống sự xâm nhiễm và
phá hủy hạt của mọt Callosobruchus chinensis. Kết quả cho thấy bột ớt, bột oliu,
bột lá chè có tác dụng chống mọt và trong cùng một khối lượng hạt đậu xanh bảo
quản, cùng thời gian và cùng liều lượng bột xử lý thì hiệu quả chống mọt có sự khác
nhau giữa bột ớt, bột liu và bột đậu xanh [56].

Phòng trừ bằng biện pháp vật lý
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của mọt. Việc xử lý
nhiệt đã được quan tâm nhiều trong những năm gần đây trong việc làm sạch hàng
hóa bảo quản và xu hướng này đang tiếp tục được áp dụng rộng rãi để diệt trừ dịch
hại [85], [86]. Việc sử dụng nhiệt độ cao là một biện pháp được sử dụng phổ biến để
phòng trừ dịch hại trong bảo quản hạt. Hầu hết các dịch hại trong bảo quản bị chết ở
nhiệt độ trên 40oC [61]. Tuy nhiên, nhiệt độ thấp cũng được sử dụng trong phòng trừ
mọt hại. Evans (1987) công bố rằng xử lý nhiệt độ thấp, kết hợp với làm khô bảo vệ
hạt khỏi sự tấn công và gây hại của dịch hại hơn là việc xử lý diệt trừ [55]. Việc tăng
nhiệt độ làm tăng tỷ lệ trao đổi chất, theo đó làm giảm trọng lượng sản phẩm bảo
quản nhanh hơn. Ở nhiệt độ thấp khả năng đẻ trứng giảm và khả năng phát triển của
côn trùng chậm điều này kéo dài thời gian trước khi quần thể tăng đến ngưỡng gây
hại kinh tế [73].
Sử dụng năng lượng điện tử ở mức nhẹ để phòng trừ mọt, thí nghiệm này được
tiến hành ở phòng thí nghiệm đối với mọt ở các giai đoạn khác nhau. Mọt ở 0, 2, 4,
6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 ngày tuổi xử lý ở mức 170 kv trong vòng 20 phút, kết quả
cho thấy sự mẫn cảm đối với bức xạ điện tử giảm khi tuổi của mọt tăng, giai đoạn


13

trứng dễ nhiễm bức xạ điện tử cao nhưng ngược lại giai đoạn 18 ngày tuổi thì mọt
trưởng thành vẫn hoàn toàn phát triển được. Do vậy, để đạt được tỷ lệ chết ở giai
đoạn trưởng thành 80% phải xử lý ở mức năng lượng cao hơn (200 kv). Đối với mọt
trưởng thành sống sót còn lại thì ảnh hưởng tới sức đẻ trứng, thời gian sống. Đây là
một biện pháp rất hiệu quả và an toàn vì nó không ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm
của hạt đậu [157].
Đối với bất kỳ một loại sâu bệnh nào việc nghiên cứu để tìm ra giống có khả
năng chống chịu là khâu không thể thiếu trong công tác quản lý dịch hại tổng hợp,
vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm 5 giống đậu xanh: Parbat, Paidar91, Pb-2000, CM-2000, bittler-98 thì thấy khả năng kháng mọt của các giống là rất

khác nhau thể hiện ở số lượng trứng, tỷ lệ hao hụt khối lượng, số lượng mọt trưởng
thành, số lượng lỗ đục. Kết quả thí nghiệm cho thấy giống Parbat là giống bị nhiễm
nặng, còn giống Bittle-98 có khả năng kháng mọt cao [158].
1.1.3. Đánh giá khả năng kháng mọt của đậu xanh
Có rất nhiều phương pháp để đánh giá khả năng kháng mọt đục hạt đậu xanh.
Liu và cs năm 2016 đã nghiên cứu về khả năng kháng mọt đục hạt ở đậu xanh bằng
phương pháp so sánh hệ gen của các giống đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczeck).
Kết quả so sánh hệ gen của các dòng bố mẹ kháng và nhạy cảm với mọt thế hệ con
cháu của chúng đã xác định được 91 gen biểu hiện khác nhau và phân loại thành 17
gen chính và 74 gen khác liên quan tính kháng mọt; một số lượng lớn gen này nằm
trên một vùng của nhiễm sắc thể số 5 [82]. Sibakwe và cs (2015) đã đánh giá các
mức độ kháng mọt Acanthoscelides obtectus và mọt Zabrotes subfasciatus của một
vài giống đậu ở quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng mức
độ kháng của 7 giống đậu xanh với hai loài mọt Acanthoscelides obtectus và
Zabrotes subfasciatus có sự khác nhau rõ rệt trong thời gian lưu trữ từ 15 ngày đến
120 ngày [116].
Năm 2014, Duraimunrugan và cs đã sử dụng phương pháp sàng lọc khả năng
kháng mọt đậu xanh của các kiểu gen đậu xanh và đậu đen nhằm tìm hiểu sự ảnh
hưởng của đặc điểm hình thái, sinh lý của hạt tới khả năng kháng mọt. Sử dụng 335